Name: Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: Lernen Sie die Herstellung und Charakterisierung biofunktionalisierter planarer Lipid-Doppelschichten für Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Studien zu Membranproteindynamik.

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MA wurde durch ein Schrödinger-Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF, J3086-B11) und dankt der Max-Planck-Gesellschaft für finanzielle und administrative Unterstützung getragen. GS wurde von der Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS13-030) unterstützt. JH wurde vom Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS14-031) unterstützt.

1. Erzeugung und Funktionalisierung von Planar SLBs <ol><li> Mischen der Lipide <ol><li> Um bei einer 10% DGS NTA-Ni / 90% POPC Lipidzusammensetzung kommen aufzulösen 45 mg POPC und 6,9 mg DGS NTA-Ni in Chloroform in einem 250 ml-Rundkolben. Halten das Volumen Chloroform niedrig (nur einige ml), um es in der nächsten Stufe zu verdampfen. Für eine 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC Lipidzusammensetzung verwenden 49.5 mg POPC und 0,69 mg DGS NTA-Ni. </li><li> Entfernen des Chloroforms unter Verwendung eines Rotationsverdampfers langsam - eine Erhöhung über der Umgebungstemperatur ist nicht notwendig. Alternativ abblasen innerhalb einer chemischen Abzugshaube in einem Strom von Inertgas, wie Stickstoff oder Argon. Während dies zu tun ständig drehen Sie den Kolben auf gleiche Abscheidung des Trocknungs Lipid auf der unteren Hälfte des Rundkolben zu ermöglichen. </li><li> Sobald der Großteil wird das Chloroform abgedampft, befestigen den Kolben zur Vakuum O / N, um das Chloroform quantitativ entfernen. Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Kontamination zu vermeidenvon Proteinen und Zellen mit toxischen Chloroform bei späteren Stufen und Lipiddoppelschicht Fluidität sicherzustellen. </li></ol></li><li> Erzeugung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) aus getrockneten Lipide Anmerkung: kleine unilamellare Vesikel (SUVs) sind zwischen 20 nm und 100 nm im Durchmesser und können leicht durch Behandlung in einem Ultraschallbad hergestellt werden. Lipid Extrusion einem alternativen Verfahren kann zu SUVs zu geben und, abhängig von der Porengröße des für die Extrusion angewendeten Filter auch große unilamellare Vesikel (LUVs), die von 100 nm bis 1000 nm in der Größe. Jedoch sind SUVs besten geeignet zum Bilden SLBs. <ol><li> SUVs durch Behandlung in einem Ultraschallbad (im Video gezeigt): <ol><li> Entgasen PBS. Aussetzung der getrockneten Lipidmischung mit 250 ml Rundkolben in 10 ml entgastem PBS. </li><li> Der Kolben wird mit Inertgas zu füllen, wie beispielsweise Stickstoff oder Argon, schließen Sie es mit einem Stopfen und der Kolben mit Autoklaven Band abzudichten. </li><li> Legen Sie die versiegelte Flasche in einem Ultraschallbad und beschallen die Lipidsuspension eint 120 bis 170 W, bis es klar geworden ist. Dies dauert zwischen 30 und 60 min. </li><li> Überwachung der Fortschritte der Vesikelbildung spektrophotometrisch: ergeben, dass die Absorption von unverdünntem Emulsion im Vergleich zu PBS konstant bei 234 nm (als ein Indikator für den Lipidkonzentration) dennoch sollte deutlich bei 550 nm fallen (aufgrund geringerer Lichtstreuung über größere Partikel). </li><li> Zu Pellet schweren nicht unilamellaren Vesikeln, die mit der Bildung eines zusammenhängenden SLB stören, pelle Vesikelsuspension durch Zentrifugation bei 150000 · g für 1 Stunde bei 25 ° C und anschließend 8 Stunden bei 288.000 × g, 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch einen Spritzenfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 um. </li><li> Messung der OD bei 234 nm und 550 nm, um die Klarheit des Vesikels Zubereitung und die Menge an Lipid linken überwachen. </li><li> Speichern die Vesikel bei 4 ° C unter Argon oder Stickstoff. Optional können Sie Vesikelsuspension für Doppelschicht-Zubereitungfür mehrere Monate. </li></ol></li><li> SUVs durch Lipid-Extrusion: <ol><li> In kurzen, übergeben Sie die Lipidsuspension mehrere Male durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,1 &amp; mgr; m. Unabhängig von dem Herstellungsverfahren Zentrifugation der Vesikelsuspension zweimal (1H, 150,000g, 25 ° C, dann 8 h, 4 ° C, 288.000 g) pelletiert nicht unilamellare Vesikel, die schwerer sind. HINWEIS: Wenn bei 4 ° C unter Inertgas gelagert können Vesikel-Doppelschicht Vorbereitung für mehrere Monate verwendet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Bildung einer SLB und der Ladevorgang mit Protein <ol><li> Behandlung von 24 x 50 mm # 1.5 Glasobjektträger mit einer 3: 1 Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid für 30 min. HINWEIS: Aufgrund der Aggressivität der Mischung besondere Sorgfalt walten lassen, dh tragen einen Laborkittel und Schutzbrille, wie in dem Video zu sehen! </li><li> Spülen Glasobjektträger unter einem Strom von ddH2O aus einer Spritzflasche. Legen Sie sie auf einer Teflon Stand und lassen Sie sie trocknenfür 10 bis 30 min. </li><li> Entfernen Sie die untere Glasplatte von 8 oder 16 auch Kammern, füllen Sie das unten mit Epoxid-Kleber und sorgfältig legen Sie einen sauberen und trockenen Objektträger auf den Leim bedeckten Kammerboden. Ließ den Kleber für etwa 10 min zu härten. Entfernen Sie überschüssigen Kleber von der Unterseite. HINWEIS: Die Dichtheit zwischen dem Glasträger und der Kammer kann auch leicht mit der Verwendung einer Dentalzweikomponenten-Silikon Modelliermasse, die innerhalb von 10 bis 30 min aushärtet erreicht werden. Diese Dichtung ist nicht so fest wie Epoxid-Kleber, sondern hält regelmäßige körperliche Belastung. Nach dem Experiment kann es leicht aus der Kammer, die dann in zukünftigen Experimenten wiederverwendbar ist, entfernt werden. </li><li> Pipette 120 ul (60 ul) einer 10-fach mit PBS verdünnt Lipidsuspension in jede Vertiefung einer 8 (16) - auch Kammer der Doppelschicht und lassen Form für 20 Minuten (wie oben beschrieben). Die Doppelschicht vorsichtig zweimal gründlich mit 15 ml PBS. Sobald die Doppelschicht gebildet hat, muss diese in einem Puffer eingetaucht werden und niemals der Luft ausgesetzt werden. </li&gt; <li> Füllen Sie jede auch den ganzen Weg mit PBS, dann nehmen Sie 330μl (8-Well-Kammer) und 165μl (16-Well-Kammer). Es gibt 350 ul (175μl) in den Brunnen gelassen. Hinzuzufügen 50 ul (25 ul) des Cocktails His-markierten Proteine ​​in PBS in jede Vertiefung (400 oder 200 &amp; mgr; l final) enthielt, verdünnt und Inkubation bei RT für 60 min im Dunkeln. Die Oberflächenproteindichte kann durch Variation der Proteinkonzentration während dieses Inkubationsschritts eingestellt werden. </li><li> Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 15 ml PBS. HINWEIS: In der Regel SLBs sollte in Versuchen nicht mehr als 6 Stunden nach der Beladung mit Protein verwendet werden. Während dieser Zeit bleibt Fluorophor Erholung nach Photobleaching bis zu 95%, und kein Verlust in Bilayer-assoziierten Protein nachgewiesen werden kann. Die Proteindichte sollte vor dem Experiment bestimmt werden (siehe unten). </li><li> Optionaler Schritt: Um nicht-spezifische Bindung des Proteins der DGS NTA-Ni enthaltenden SLB testen, wäscht den SLB einmal mit PBS, enthaltend 300 mM Imidazol. Die Pro-tein sollte komplett zu kommen. </li></ol></li></ol> 2. Mikroskop-Setup <ol><li> Für den Bau einer Mikroskopiesystem zum Aufspüren von der Fluoreszenz der einzelnen Fluorochrome beziehen sich auf die in der Einleitung genannten Empfehlungen. </li></ol> 3. Leistungsmessungen HINWEIS: Fluorophore kann leicht mit einem Überschuss an Anregungslicht gesättigt. Dies beschleunigt ohne weitere Verstärkung der Emissionsphotobleichen und sollten daher vermieden werden. Zur Optimierung der Probenbeleuchtung die Anregungsleistungsdichte sollte direkt an der Probe gemessen werden. Solche Messungen können auch als Referenz für zukünftige Experimente dienen. Ferner kennen das Verhältnis zwischen Eingangs- und Ausgangslaserleistung ist nützlich bei der Beurteilung bei dem Licht in das Abbildungssystem verloren. <ol><li> Bewegen des Anregungsstrahls in die aufrechte Position, so daß es das Ziel Blätter in einem Winkel von 90 °. </li><li> Legen Sie den Kopf der Leistungsmesser an der Spitze of Strahls und Messen der Leistung des Strahls (= P). Dokumentieren Sie das Ergebnis ein. </li><li> Verwenden des Periskop, drehen Sie den Strahl in den TIRF-Position und ein fehlerfreies homogene Leuchtstoffdoppelschicht. Zur Bleiche und CCD-Signalsättigung Ort ein Neutraldichtefilter (ND) mit einer optischen Dichte (OD) von 2 bis 3 in die Anregungslichtpfad zu vermeiden. <ol><li> Messen Sie die integrierten Zählungen der gesamten Leuchtfeld (= I insgesamt). Auch messen Sie die Größe der beleuchteten Fläche (= A insgesamt). Messen Sie die integrierten Zählungen (= I Center) der maximal beleuchtet Zentrum vor Ort als auch die Größe des Flecks (= A Mitte). </li></ol></li><li> Messen Sie die Hintergrundsignal pro Bildpunkt (= B) entweder außerhalb der beleuchteten Fläche oder ohne Probenbeleuchtung. </li><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundsignal aus den Ergebnissen in 3 gemessen). Tun Sie dies, indem die Anzahl von Bildpunkten des fraglichen Bereich (ganze beleuchtete Fläche oder in der Mitte vor Ort) mit dem HintergrundZählungen pro Pixel. (= I Gesamt - insgesamt .B und ich zentrieren - ein Zentrum .B). </li><li> Unterteilen Sie die integrierte und Hinter korrigierte Signal der Mittelpunkt durch die integrierte und Hintergrund-korrigierte Signal von den gesamten Bereich der Beleuchtung. HINWEIS: Das Ergebnis zeigt den Anteil der Gesamtleistung in der Mitte vor Ort (= (I Zentrum - Ein Zentrum .B) / (I Gesamt - Insgesamt .B)) entfernt. Die Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem in 2.) Ergebnisse in der Kraft des Lichts Beleuchtung der Mittelpunkt gemessene Leistung P. </li><li> Bestimmen Sie die Größe des Punktes A Zentrum in um². Dazu teilen Sie die Kamera Pixelgröße in &amp; mgr; m von der Vergrößerung des Objektivs, nehmen Sie den Platz des Ergebnisses als um² pro Pixel. <ol><li> Alternativ misst die Pixelgröße innerhalb des Bildes mit der Verwendung eines Mikrometers Folie auf das Mikroskop gelegt und das Quadrat des Ergebnisses als Fläche pro Pixel. Multiply dieser Wert durch die Anzahl von Pixeln innerhalb des Mittenfleck befindet, um am beleuchteten Spot-Bereich zu gelangen. </li></ol></li><li> Teilen Sie die Leistung P Beleuchten der Mittelpunkt durch die Größe der Mittelpunkt Ein Zentrum, um², um die Beleuchtungsstärke pro &amp; mgr; m 2 zu berechnen. Ein Beispiel ist in Figur 6 angegeben. </li><li> Stromdichtewerte in nicht-TIRF-Beleuchtung gemessen, sind in der Regel niedriger als in TIRF-Beleuchtung 13 vorhanden, die auch von der genauen Winkel, in dem das Laserlicht total reflektiert wird, abhängen. Bei Leistungsdichten unter TIRF-Beleuchtung vorhanden anreisen, Bild kalibriert fluoreszierende Kügelchen von 0,1 um Durchmesser sowohl in nicht-TIRF und TIRF. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten Wulst in TIRF und nicht TIRF Modus gemessen beträgt der Umwandlungsfaktor C, der Umsetzung der gemessenen Leistungsdichtewerte in den unter TIRF-Beleuchtung (Gleichung 1) wirksam werden können. Leistungsdichte </em&gt; TIRF = C • Leistungsdichte nicht-TIRF (Gleichung 1) mit C = Wulst Intensität T IRF / Bead Intensität nicht-TIRF </li></ol> 4. Densitometermesswerten <ol><li> Bestimmen Sie die mittlere Signal einzelner Fluorophore auf einer Doppelschicht entfernt. Doppelschicht-Attached-MHC-Moleküle mit fluoreszierenden Peptiden beladen sind ideal für diesen Zweck, da das Protein: label Stöchiometrie genau ein. Falls erforderlich Bleich alle Etiketten auf der Doppelschicht in das Blickfeld und lassen Sie die Fluoreszenz zu erholen, um einzelne Fluorophore zu visualisieren. <ol><li> Nehmen Sie Bilder in schneller Folge (zB Anwendung eines Streaming-Akquisition-Protokoll) und Überwachung einzelner Moleküle Mobilität über mehrere Rahmen. Für weitere Informationen siehe Abbildung 7. </li></ol></li><li&gt; Markieren Sie die zentralen Beleuchtungsfleck innerhalb der Doppelschicht als ROI. Messung der ROI, sollte die Varianz der Beleuchtungsleistungsdichte (die proportional zur Fluoreszenzintensität) idealerweise weniger als 15% betragen. <ol><li> Bestimmen Sie Einzelmolekül-Fluoreszenz-und Groß nur innerhalb dieses ROI. Integrieren Sie das Signal eines ROI, die groß genug ist, um 99% oder mehr der Punktverteilungsfunktion der Einzelemitter zu erfassen ist. Beim Einsatz einer Kamera mit einer Pixelgröße von 16-20 &amp; mgr; m (unter Ausschluss der Spezifikationen des Herstellers angegeben ist), ein Objektiv mit 100-facher Vergrßerung und einer numerischen Apertur von gleich oder größer als 1,45, einen Bereich von 7 mal 7 Bildpunkte mit der Intensitätsmaximum in der Mitte des Platzes. </li><li> Um die Hintergrundsignal zu bestimmen, integrieren die Grafen von einer benachbarten 7 von 7 Pixel-Quadrat, das ein Fluoreszenzsignal nicht enthält. Subtrahieren Sie den Hintergrund aus der Einzelmolekül-Signal, um den korrigierten Wert für Einzelmolekül-Fluor bestimmenescence. Wählen nur Signale, die sich noch in der nachfolgenden Rahmens sichtbar sind. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.2 fünfzig bis mehrere hundert Mal. Der Mittelwert der Hintergrund-korrigierte Signal. Falls gewünscht, plotten einzigen Molekül Intensitätswerte als Histogramm. Optional: profitieren Sie von einem geeigneten Plugin von Open-Source-Software-Pakete (zB ImageJ) oder Verarbeitung der Daten mit Hilfe kommerzieller Software (zB Metamorph, Molecular Devices). Erfahrene Anwender können ihre eigenen Analyseprogramm in Matlab oder ähnliche Software-Pakete zu schreiben. </li><li> Platzieren eines Neutraldichtefilter von 2 oder höher in der Erregerpfad und nehmen Bilder einer fluoreszierenden Doppelschicht, die Proteine ​​mit dem gleichen Fluorophor markiert. Notieren Sie sich die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb des gleichen ROI für Einzelmolekül-Intensitätsmessungen verwendet. Aufzeichnen der Belichtungszeit des Schüttfluoreszenzmessungen. Messen Sie die gleiche Stelle ohne Beleuchtung für Hintergrund-Subtraktion. </li><li> Um die Proteindichte in der Bi bestimmenSchicht, multiplizieren die hintergrundkorrigierten Massen Fluoreszenz Durchschnittspixelintensität in Schritt 4 bestimmt wird durch die Anzahl der Pixel pro Quadratmikrometer (zB 41,5), 100 (falls ein ND-Filter mit einem Außendurchmesser von 2 verwendet wurde) oder 1000 (wenn ein ND Filter mit einem Außendurchmesser von 3 verwendet wurde) und die Belichtungszeit in Schritt 2 verwendet und teilen sie durch die durchschnittliche Einzelmolekülsignal in Schritt 3 bestimmt wird, in Schritt 2 die Belichtungszeit verwendet, und die Anzahl der Fluorophore pro Protein. </li></ol> 5. Testen der Integrität der Doppelschicht <ol><li> Bereiten Sie eine Leuchtstoffdoppelschicht und auf dem Mikroskoptisch, wie oben beschrieben. </li><li> Stellen Sie den Fokus und nehmen Sie ein Bild von der Doppelschicht in TIRF-Modus. Tragen Sie eine kurze, aber intensive Bleichpuls in nicht-TIRF-Modus, um die Fluoreszenz in einem kleinen scheibenförmigen ROI abzutragen. </li><li> Nehmen Sie ein Bild von der Doppelschicht in geringer Intensität TIRF-Modus unmittelbar nach dem Bleichen und dann alle fünf bis zehn Sekunden, um die Geschwindigkeit der Fluoreszenz Erholung zu überwachen. </li><li> Move in einen anderen Bereich auf der Doppelschicht und folgen Sie die Schritte 2 und 3. Nehmen Sie ein anderes Bild in geringer Intensität TIRF-Modus 5 min nach der Bleichpuls. Bestimmen Sie die Intensität I veröffentlichen Bleichmittel in der Bleichmittelbereich und vergleichen Sie es mit der Intensität vor dem Bleichen I 0 zu Beginn des Experiments (sollte keine Bleiche stattgefunden haben), um die immobile Fraktion berechnen (IF), wie folgt: Immobile Fraktion IF (%) = (I 0 - I veröffentlichen Bleichmittel) / (I 0 - Hintergrund) x 100, mit Hintergrund = gemessene Intensität innerhalb der ROI ohne Anregungslicht angewendet Das IF sollte weniger als 10% (im Idealfall weniger als 5%) beträgt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

Einzelmolekül-Mikroskopie bietet die einmalige Gelegenheit, das Verhalten von Proteinen in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Molekulare Bildgebung wird somit zunehmend attraktiv für eine breite wissenschaftliche Gemeinschaft, aber viele Naturwissenschaftler immer noch weg von der anfänglichen Investitionen in Technologie und Know-how zurückschrecken. Der Hauptnutzen, durch Zusammensetzen der eigenen Abbildungssystems ist, dass es ohne weiteres auf jeden spezifischen Bedarf eingestellt werden. Wie hierin vorgeschlagen, eine nicht-TIRF Anregungslichtkegel kann zusätzlich zu einer bestehenden TIRF Lichtweg eingeführt werden, wenn eine schnelle und definierte Photobleaching (oder -Aktivierung) von Fluorophoren und Liganden gewünscht wird, beispielsweise bei der Durchführung von FRAP oder Ligand uncaging Experimenten 14 . Die Einführung eines Emissionsstrahlteiler ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von mindestens zwei und in einigen Fällen bis zu vier Fluoreszenzkanälen. Die Liste der Erweiterungen ist im wesentlichen nur von begrenztdie eigene Vorstellungskraft. B. Umsetzung einer motorisierten Emissions Filterrad im Emissionspfad ermöglicht eine schnelle Umschaltung zwischen bis zu zehn unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen. Bei der Kombination von zwei motorisierten Emissionsfilterräder in Reihe (jeweils mit 10 Filterschlitze ausgestattet), bis zu 18 Fluoreszenzkanäle können ausgelesen werden. TIRF-basierte Bildgebung kann mit Calciummobilisierung Messungen und Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) nach der Integration einer Xenon oder Quecksilber Anregungslampe Pfad ergänzt werden. IRM ist das Verfahren der Wahl, um den Grad, in dem Zellen auf die Glasoberfläche oder eine SLB befestigt und kann somit kritische Informationen bei der Interpretation der TIRF-basierten Bilddaten zu visualisieren. Festlegung eines verbreiterten Anregungsstrahls mit der Verwendung eines einfachen dichroitischen Spiegel und einem zusätzlichen Laser von 405 nm leitenden Photolokalisierungsmikroskopie (Palm) oder stochastischer optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) ermöglicht, dh zwei superresolutIonen Methodologien Positionsgenauigkeit unterhalb der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts 15,16. Allerdings ist experimentelle Erfolg nicht nur eine Frage der geeigneten Hardware. Um alle Vorteile der geräuschreduzierten TIRF-basierte Bildgebung zu tragen, sollte Zellen Kontakt zu einer Oberfläche in einer Weise, die nicht Zwänge auferlegen wird auf der Zelloberfläche, oder dass stört die Physiologie der Plasmamembran zu machen. SLBs mit geeigneten Proteinen für die Zelladhäsion sind höchstens für diesen Zweck gut geeignet, da alle SLB eingebetteten Liganden sind lateral beweglich und passen ihre laterale Position innerhalb der Doppelschicht in Reaktion auf die Bindung und Trennung Dynamik Rezeptor funktionalisiert ist. Um SLBs reproduzierbar herzustellen, ist es am besten, mit SUVs von hoher Reinheit beginnen. Wie hier beschrieben, ist es somit wichtig, multilamellaren Vesikeln, die auch während der Beschallung erzeugten entfernen, in zwei Schritten, wie Ultrazentrifugation Diese Interfere mit der Bildung von zusammenhängenden SLBs mit hoher Fluidität. SLBs hochwertiger Form nur auf saubere Glasflächen. Sobald gereinigte Glasobjektträger sofort verwendet oder in Vakuum gelagert werden. Wichtig ist, SLBs darf niemals an der Luft liegen, da dies würde ihre Störungen führen kann. SLB Wasch beinhaltet, wie gezeigt, Puffer Spülen mit der Verwendung einer serologischen Pipette, da dies nicht nur sparen, sondern auch zeitsparende Vorgehensweise. Während der Ernte und Reinigung von SLB-residenten Proteinen ist die Verwendung von Reinigungsmitteln vermieden werden sollte. Dies liegt daran, Detergens-Protein Mobilität deutlich, auch wenn sie in Spurenmengen zu reduzieren. Um die Notwendigkeit für Waschmittel alle zusammen zu umgehen, wird eine lösliche Expression sekretierter Polyhistidinschwanz ausgestatteten Liganden in Säugetier- oder Insektenzellen empfohlen. Wenn die Rückfaltung von E. coli-Einschlusskörper erforderlich ist, muss vorsichtig angewendet, um Reinigungsmittel effektiv von der Einschlusskörper vor deren Ab- und Rückfaltung zu entfernen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von SLBs Ergebnisse aus den modularen, rekonstitutiven Natur, die spezifisch sezieren die Rolle eines bestimmten Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung für die Zellaktivierung und die Zelladhäsion ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, dass DGS NTA-Ni vorhanden sein sollte bei 10% in der SLB, um Proteine ​​im Wettbewerb um NTA-NI-Bindungsstellen zu verhindern. Beim Einsatz SLBs beherbergen nur 1% oder 2% DGS NTA-Ni, eine Reduzierung der Assoziation der eine gegebene Polyhistidin-markierte Proteinspezies kann festgestellt werden, insbesondere, wenn Co-Inkubieren zunehmenden Mengen eines zweiten Polyhistidin-markierte Proteinspezies (unveröffent Beobachtung). Dieses Phänomen wird nicht beobachtet, wenn die Arbeit mit SLBs mit 10% DGS NTA-Ni. Während wir nicht beobachtet unspezifische Bindung jeglicher Polyhistidin-tagged Protein SLBs enthaltenden DGS NTA-Ni getestet, sollte diese Möglichkeit bei der Einführung eines Proteins zum ersten Mal getestet werden,Zu diesem Zweck empfehlen wir den Einsatz von SLBs ohne DGS NTA-Ni (das Protein nicht binden sollte). Zweitens, wenn Sie ein SLB enthält DGS NTA-Ni, das Protein sollte komplett kommen nach dem Waschen des SLB mit PBS, das 300 mM Imidazol. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Verwendung SLBs ist, dass transiente Interaktionen und Signalereignisse können mit verbesserten Raum-Zeit-Auflösung von 17 bis 19 überwacht werden. Dies ist zumindest teilweise, weil ein dreidimensionaler Bindungsprozesses im wesentlichen auf zwei Bildabmessungen verringert wird, insbesondere bei Aufnahmen in geräuschgedämpften TIRF-Modus. Die Verwendung von SLBs ist mit Einzelmolekül-Signalerkennung, eine Voraussetzung für die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) oder stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), dh Superresolution-Mikroskopie mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze 15,16 kompatibel. Diese speziellen bildgebenden Verfahren ermöglichen einzelnes Molekül Förster Resonance Energy Transfer Experimente entwickelt, um einzelne Protein-Protein-Interaktionen in einer synaptischen Umgebung 20 zu visualisieren. Dieser Ansatz wird in beträchtlichem Detail in einer Veröffentlichung JoVE als &quot;Mess TCR-pMHC Bindung unter Verwendung eines FRET-Mikroskopie assay&quot; 21 erläutert. Bei der Interpretation der SLB-basierte Experimente sollte man immer daran, dass nicht alle Eigenschaften eines Plasmamembran von einer lebenden Zelle sind durch SLBs vorge zu halten, und dass einige der fehlenden Qualitäten könnten die Physiologie in Untersuchung beeinflussen. Schließlich sind SLB-eingebettete Proteine ​​frei diffundierenden und Membrandomänen, da die meisten ihrer zellulären Gegenstücke 5,6,22 nicht organisiert. Immobilisierten Plasmamembran Blätter von adhärenten Zellen, die die Plasmamembranarchitektur lebender Zellen zu einem gewissen Grad zu sparen abgeleitet sind erfolgreich eingesetzt worden, um die Aufnahme von membrangebundenen Antigene von B-Lymphozyten 23 zu studieren. Aber auch solcheMembranen nicht mit einer hochdynamischen Zytoskelett interagieren und bieten keine Flexibilität, wie sie durch eine starre Glasoberfläche unterstützt. Angesichts dieser Unterschiede besteht eindeutig ein Bedarf an Engineering SLBs, die Mittel bieten, um Proteine ​​in definierter Art und Weise compartmentalize und die durch Oberflächen einstellbare Flexibilität oder durch Oberflächen, die ihre Steifigkeit in Reaktion auf lokal angewendet Lichtpulse ändern unterstützt.

Das Verständnis der Mechanismen, durch die Membranproteine ​​ihre zellulären Funktion erfüllen kann oft eine schwierige Aufgabe sein, weil ihre Wirkungsweisen werden häufig durch eine geringe Affinitätswechselwirkungen, die nur schwer zu erfassen und auszuwerten durch herkömmliche biochemische Methoden, definiert. Membranproteine ​​können weiterhin stark in speziellen Membrandomänen 5,6 oder bilden dynamische Strukturen höherer Ordnung, die grundsätzlich verändern können ihre biologische Aktivität 7 angereichert werden. Nicht-invasive lasergestützte Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie ist damit zu Methodik der Wahl, um Protein-Verhalten in komplexen zellulären Umgebungen zu studieren. Dies gilt insbesondere für biochemische Prozesse, die an der Plasmamembran, da diese im Prinzip in geräuschreduzierten Total Internal Reflection (TIRF) Modus überwacht werden. Hier Probenbeleuchtung ist mit einem bis zu 200 nm-dünne Scheibe in unmittelbarer Nähe zu einem Glas su eingeschränktrface, die zu einem erheblichen Verlust der zellulären Hintergrund ergibt, und aufgrund der Eigenschaften des abklingenden Anregungslicht auch zu einem deutlichen Anstieg in der Fluoreszenzsignalintensität 8,9. Beide Aspekte sind wichtig, wenn mit dem Ziel für eine hohe Positions und zeitlicher Auflösung in Einzelmoleküldetektion. Planar SLBs sind nicht nur mit TIRF-Mikroskopie kompatibel. Wenn mit geeigneten Liganden funktionalisiert sie bieten auch einen direkten Zugang zum Studium der molekularen Dynamik von Zell-Zell-Erkennung, wie sie in Immunzellen oder anderen Zellen auftreten. Sie kann aber auch einfach verwendet werden, um bewegliche und ansonsten nicht-adhärenten Zellen nahe genug an dem Glasträger zu positionieren, dass solche Zellen in TIRF-Beleuchtung, was sehr wünschenswert ist abgebildet werden, wenn Leitungsversuche mit einzelnen Moleküls Verfolgung oder Einzelmolekül-basierten Superauflösung. Zu diesem Zweck Proteine ​​haben, auf eine hochmobile SLB geladen werden. Ein inhärenter Vorteil der verwendeten li<html> PIDs, daß es keine unspezifische Bindung von Proteinen an allen. Darüber hinaus kann SLBs als zweidimensionale Flüssigkeiten mit einer inhärenten Fähigkeit, sich selbst zu heilen betrachtet werden; Unregelmäßigkeiten im Glasträger sind bis zu einem gewissen Grad ausgeglichen. Ein Schritt-Schritt-Protokoll vorgesehen ist, um hochmobilen Doppelschichten mit Proteinen von Interesse berechnet generieren. Die Bildung von planaren SLBs beschrieben, die 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (POPC) als Hauptbestandteil (90-99%) und der synthetischen, und funktionalisierte Lipid 1,2-Dioleoyl sn-glycero-3 - {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure] succinyl} Nickelsalz (DGS NTA-Ni) in geringer Menge (1-10%). POPC trägt eine gesättigte Fettsäure und eines monoungesättigten Fettsäure und bildet Lipiddoppelschichten mit hoher Fließfähigkeit, selbst bei RT. DGS NTA-Ni bindet mit seiner Kopfgruppe um Polyhistidin-Schwanz und dient als Anker für die poly-Histidin-markierte Proteine ​​der Wahl (Abbildung 1). &quot;&gt; Wichtig ist, muss der Mikroskopie-Hardware eine Reihe von Peripheriegeräten, die unten beschrieben werden, umfassen. Mit der zur Verfügung gestellten Informationen und einige Grundkenntnisse in der Optik und Laserphysik, sollte jeder Biologe in der Lage, ein einzelnes Molekül Imaging-Setup zu bauen. Probenanregung sollte idealerweise sein, auf einem inversen Mikroskop in Total Internal Reflection (TIRF) Modus durchgeführt, wie diese Therapie reduziert Streulicht und übermässigem sonst infolge zelluläre Autofluoreszenz 9. Hierzu wird eine spezielle TIRF fähiges Ziel (siehe unten) und Laserbeleuchtung benötigt werden. Einige Experimente werden Belichtungszeiten im Millisekundenbereich erfordern und schnell hintereinander betrieben werden. Zur Beleuchtung Zeit zu sparen oder um unnötige Bleich durch wiederholte Beleuchtung ist es oft hilfreich, um das emittierte Licht in zwei oder mehrere spektrale Kanäle aufgeteilt zu vermeiden. Dies ermöglicht gleichzeitige Auslesen aus zwei oder mehr Emissionsprofile, die ein wichtiger Faktor, wenn CondUC werden kannting Experimenten mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hier die Emission von einzelnen Anregungslichtpuls resultieren, können beide von der FRET-Donor aufgezeichnet und FRET-Akzeptor (wie sensibilisierten Emission). Die Kamera sollte genug Photonen mit ausreichend niedrigen Hintergrund zu erfassen, um einzelne Fluorophore während der Beleuchtungszeit zu visualisieren. Computer-Software müssen bis zur Aufgabe der Anregung Schließung und Bildaufnahme zu synchronisieren. Ein umfassender Überblick wird unten und in Abbildung 2 angegeben: TIRF-fähigen Ziel: Für zielorientierten TIRF-Beleuchtung die numerische Apertur (NA) des Objektivs muss gleich oder größer als 1,4 unter Verwendung von Standard-Glasobjektträger sein (n = 1.515) 9. Vergrößerung zwischen 60x bis hin zu 150x. Das Ziel sollte chromatisch korrigiert werden, um Konfokalität bei der Abbildung unterschiedlicher Fluorophore zu ermöglichen. Laser: Die Anzahl der verfügbaren laser Möglichkeiten hat sich in den letzten Jahren stark zugenommen. Moderne elektronisch modulierbaren Dauerstrichdiodenlaser sind kostengünstig und kann mit noch nie da gewesenen Frequenz und Geschwindigkeit betrieben werden. Teurer Gasionenlaser zeichnen sich durch Laserstrahl Qualität, benötigen aber externe Schließung (siehe unten) und oft umfangreiche (Wasser-) Kühlung. Anregungsläden: akustisch-optische Modulatoren (AOM) ermöglichen eine schnelle Schließung in schneller Folge 10. Für enge schloss die Kombination aus einem AOM mit mechanischer Rollläden wird empfohlen. Auf diese Weise starke Aufheizung des AOM aufgrund der kontinuierlichen Belichtung vermieden und austretendes Licht aus dem AOM in der Aus-Stellung aufgehoben ist. Linsen werden verwendet, um Laserstrahlen zu erweitern und um sie auf der hinteren Brennebene des Objektivs fokussieren. Auf diese Weise, das Ziel als ein paralleler Strahl (3), die für die TIRF Beleuchtung erforderlich ist verlässt das Anregungslichtdie Probe. Bewegen des Brennpunkts in der hinteren Brennebene von der Mitte zu der Peripherie des Ziels der Winkel, unter dem der Strahl das Ziel verläßt, nicht jedoch für die Position des Laserflecks auf der Probe (3), die eine Funktion ist des Gesamtstrahlgeometrie. TIRF-Beleuchtung erfolgt bei einem kritischen Winkel, die mit einem Satz von Spiegeln, die als ein Periskop, um den Brennpunkt des Lasers innerhalb der Brennebene des Objektivs zu übersetzen angepasst werden kann. Linsen sollten chromatisch korrigiert werden und kann in einer Reihe von zwei oder drei Linsen verwendet werden. Ein Drei-Linsensystem besteht aus zwei als Teleskop, um den Laserstrahl (und daher der Beleuchtungsfleck auf der Probe) und einer dritten Linse zu erweitern, um den verbreiterten Strahl in der hinteren Brennebene des Objektivs (4) orientiert handeln Linsen. Beide Funktionen (Teleskop und Fokussieren) kann auch durch eine Kombination von nur zwei Linsen erreicht werden (siehe Abbildung 4). &quot;jove_content&quot;&gt; Spiegel sollten mindestens 95% reflektierend sein, um den Verlust von Laserlicht zu vermeiden. Für jeden Strahl Einstellung ein Satz von zwei Spiegeln ist in der Regel als solche Anordnung angewendet ist ausreichend präzise jeden Winkel und jede Position des Laserstrahls einzustellen. Dichroic Overlays reflektieren und Licht unterschiedlicher Wellenlängen festgelegt und werden verwendet, um zu überlagern oder teilen Sie die Strahlen aus zwei Lasern. Polychroic Filter sind komplexer als dichroitische Filter und werden benötigt, um eingehenden Anregungslicht reflektieren und austretende Emissionslicht von der Probe. Sie werden in die Filterwürfel zwischen Objektiv und Tubuslinse des Mikroskops gelegt. Clean up Filter: Abhängig von der Art des Lasers employe d Laser bereinigen Filter mit einem schmalen Übertragungsbandbreite sollte in den Laserstrahl direkt nach dem es den Laser verlässt platziert werden. Notch-Filtersind entworfen, um Laserlicht effektiv absorbieren mit einer schmalen Bandbreite und übertragen alle anderen Licht. Sie werden innerhalb des Emissionspfad platziert, um herauszufiltern, keine störenden Laseranregungslicht. , Notch-Filter arbeiten, jedoch nur bei 0 ° Einfallswinkel. Wenn die Bandbreite des Kerbfilters ist sehr scharf, können die verschiedenen ankommenden Winkeln nicht mehr reflektiert wird. Blockierung des kollimierten Laserlaserlicht ist nicht betroffen, aber zurückgestreute Licht möglicherweise nicht effizient aus dem Erreichen der Kamera behindert werden. Motorisierte Filterräder mit geeigneten Filtern Rädern leicht in die Anregungs- und Emissionspfad angeordnet werden und ermöglichen die einfache Umschaltung zwischen verschiedenen Lichtintensitäten (bei ​​Verwendung mit ND-Filter ausgestattet ist) oder Fluoreszenzkanälen (wenn vor einer Xenon- oder Quecksilber-Bogenlampe ratiometrisch platziert Kalzium-Imaging oder vor der Kamera, um die emittierende Fluorophor auszuwählen). 50:50 Würfelstrahlteiler cein zur Laserstrahlen in zwei getrennte Anregungsstrahlengänge aufgeteilt werden und auch, um sie vor dem Periskop zu kombinieren. Strahlteiler (Emissionspfad): Für eine schnelle Bildaufnahme ohne die Notwendigkeit für physikalische Filter ändert, der Emissionsstrahl in einen blauverschoben und rotverschoben Kanal aufgeteilt. Prinzipiell können Strahlteiler durch Verwenden eines dichroitischen Keil oder eine Reihe von Spiegeln und einen dichroitischen Spiegel, um den Emissionsstrahl in einem Wellenlängen-abhängigen Weise getrennt gebaut werden. Zwei Emissionsfilter notwendig sind, um aufzuräumen, die das Sendekanäle. Raumfilter: räumliche Filterung des Anregungsstrahls wird manchmal benötigt, um nicht-parallel von niedriger Qualität Laserstrahlen emittierten Lichtstrahlen zu entfernen. Eine räumliche Filter besteht aus einem Zweilinsenteleskop mit einem kleinen Nadelloch genau im Brennpunkt beider Linsen angeordnet. Auf diese Weise Streulicht von nicht parallelen Abschnitten des Laserstrahls resultierenden wird effektiv blockiert. Subei der Festlegung der TIRF-Mikroskopie-basierte muss ch Bedingungen erfüllt sein. Räumliche Filterung mit sinke Pinholes, die schwieriger, in den Brennpunkt, und mit kleineren Brennweiten der ersten Linsenposition sind. Um Effekte durch Linsenfehler zu reduzieren ist es vorteilhaft, anstelle von einfachen Linsen hoher Qualität und unendlich korrigierte Mikroskopobjektive mit geringer Vergrößerung (10x oder 20x) zu beschäftigen. Periskop: Ein Periskop Einstellungen notwendig, um den fokussierten Laserstrahl in der hinteren Brennebene des Objektivs, eine Voraussetzung für TIRF Bildgebung zu übersetzen. Es kann leicht von zwei Zwei-Zoll-Spiegel, eine Translationsstufe zum Einstellen der ersten Spiegel und einen Beitrag zum Positionieren des zweiten Spiegels um die aufgeweiteten und fokussierten Anregungsstrahls in das Mikroskop (Figur 5) wiedergeben gebaut werden. Kamera: Back-beleuchteten Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) werden routinemäßig verwendetdie Aufzeichnung von Einzelmolekül-Signale. Dies ist wegen der hohen Quantenausbeute (bis 95%), hoher Aufnahmegeschwindigkeit (bis 30 MHz) und eine vergleichsweise geringe Geräuschentwicklung. Abkühlen auf -80 ° C reduziert Wärmerauschen und wird von einer Reihe von gegenwärtig verfügbaren EMCCD- Kameras unterstützt. Eine Begrenzung der EMCCD- Technologie ist, dass Kamerarauschen steigt linear mit der sowohl die Kameraverstärkung und das Signal erfasst. Dies ist nicht der Fall bei wissenschaftlichen CMOS (sCMOS) -Kameras, die deutlich auch wesentlich schneller als EMCCD- Kameras sind weniger teuer und arbeiten durch die spezielle Architektur des sCMOS Chip. Aber ein Problem mit der CMOS-Technologie verbunden ist, dass die Bildaufnahme ein gewisses Maß einer quantitativen Anzeige auf einer Einzelmolekülebene fehlt noch, weil jedes Pixel verfügt über verschiedene Erfassungsempfindlichkeit. Im Prinzip kann dies durch das Pixel-Normalisierung kompensiert werden kann, aber dieses Verfahren ist keineswegs trivial 11. Das ist, warum wir immer noch jederzeit wiederlobe sCMOS Kameras für Einzelmolekül-Mikroskopie, aber angesichts der raschen Entwicklung dieser Technologie könnte sCMOS Kameras bald die Kamera der Wahl geworden. Slow-Scan-CCD-Kameras Kameras zu vermeiden Verstärkungsbedingte Rauschen und Pixelvarianz alle zusammen und unterstützen schnellsten Erfassungsraten, wenn sie in einer so genannten &quot;kinetischen&quot; Modus betrieben werden. In diesem Modus wird der gesamte Kamerachips mit Ausnahme eines Bereichs von Interesse (ROI) maskiert ist, wodurch es möglich ist, die Chips selbst als eine Speichervorrichtung zu verwenden macht. Nachdem der ROI wird zum ersten Mal ausgesetzt sind, werden die sich ergebenden Ladungen in dem maskierten Bereich des Chips Pixelzeile von Pixellinie, in der das Bild von der weiteren Lichtexposition geschützt verschoben. Sobald die Verschiebung aller Linien des ROI in den maskierten Bereich wird (im Sub-Millisekundenbereich) abgeschlossen ist, ist der ROI sich bereit für die nächste Aufnahme. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis alle Pixelzeilen des CCD-Chips berechnet. Der Chip wird dann langsam mit deutlich redu lesenCED Ausleserauschen. Zum Beispiel auf einem 1000 x 1300 Pixel-Chip können 20 ROIs von 50x50 Pixel in schneller Folge aufgenommen werden. Weil die Bilder verbleiben auf dem Chip für eine beträchtliche Zeit, bevor sie ausgelesen werden, ist es entscheidend, zu hochwertigen Maskierungs gewährleisten und die Kamera zu kühlen (zB mit flüssigem Stickstoff), als Mittel, um übermäßiges thermisches Rauschen zu reduzieren. Einige EMCCD-Kameras unterstützen auch die kinetische Modus. Software: Timing der Laser, Rollläden, AOMs und Kamerabelichtung sowie für eine angemessene Bildspeicher integraler Bestandteil jeder erfolgreichen Imaging-Experiments sind. Im Prinzip können viele definierten Operationen mit den verfügbaren Softwarepakete, die mit der Kamera kommen, programmiert werden. Kommerzielle Softwarepakete unterstützen eine große Anzahl von Hardware-Peripherie, die mit geringem technischen Know-how umgesetzt werden können. Impulsgenerator, Datenerfassung (DAQ) Pension (mit analogen und digitalen Ausgangskanäle) und Oszilloskop: Ein Impulsgenerator ist einexzellente Wahl, um Triggerimpulse in Impulse definierter Zeit und Spannung umzuwandeln. Auf diese Weise Laser präzise für Ausgangsleistung gesteuert und im Millisekunden-Sub-Millisekunden-Bereich getaktet werden. Messkarten mit analogen Ausgängen erreichen die gleiche und sind bequem über PCI-Steckplätze in Hauptplatine des Computers integriert. Impulsdauer, Amplitude und Frequenz mit einem Oszilloskop überprüft. Gehäuse der gesamten Anregungsstrahlengang: Um Schwankungen in der Anregungsprofil durch Luft Konvektionen die gesamte Anregungsstrahlengang sollte von seiner Laborumgebung eingeschlossen werden vermeiden. Diese Maßnahme ist besonders wichtig bei der Durchführung von TIRF Mikroskopie. Optische Komponenten werden auch vor Staub und das menschliche Auge aus der Laserlichtbestrahlung geschützt. Gehäuse können einfach aus schwarzem Karton, die in der Kunst-Versorgung-Läden gekauft werden können, zu bauen. Um die Fließfähigkeit des SLB Fluorescence Recovery After Photobleac bestimmenHing (FRAP) Messungen 12 durchgeführt werden. Für FRAP die Existenz von zwei Anregungsstrahlengänge ist ratsam (siehe Abbildung 3). Der erste Strahlengang zur Abbildung der Fluoreszenz der Doppelschicht entwickelt. Dies kann in TIRF-Konfiguration und mit geringer Lichtintensität durchgeführt werden. Der zweite Strahlengang um einen kurzen aber intensiven Bleichimpuls ermöglichen und sollte nicht TIRF-Modus konfiguriert werden, so daß es das Ziel Blätter entlang der optischen Achse. Eine runde Öffnung in den Anregungsstrahlengang platziert werden (siehe Abbildung 8), um eine perfekt runde Bleichprofil mit definierten Kanten zu projizieren. Um dieses Bild Apertur auf der Objektebene, würde seine optimale Position in der Brennebene der Linse 3 (siehe Abbildung 3). Jedoch aufgrund der langen Brennweite dieser Linse, eine Blende Bild ausreichender Qualität kann auch erzeugt werden, wenn die Öffnung an leicht versetzten Positionen angeordnet sind. Nach Durchführung ter Imaging-Experiments die Rohdaten müssen angemessen untersucht werden. Mehrere Schritt-für-Schritt-Protokolle angeboten, die die Einstellung der wichtigsten Einstellungen (zB Beleuchtungsleistung und Zeit, TIRF Winkel) zu decken, Erfassung und Analyse der Daten.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Objektträger</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml Rundkolben</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50:50 Strahlteilerwürfel</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Akusto-opitkaler Modulator C1205-2</td><td>Isomet-nur</td><td></td> <td>bei Verwendung von CW-Lasern notwendig, die nicht modulierbar sind</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life Technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life Technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenband</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>oder ein anderes hitzestabiles klebriges Klebeband</td></tr><tr><td>Avanti Mini-Extruder</td><td>Avanti Lipids</td><td>610000</td><td>Alternative zum Badbeschaller</td></tr><tr><td>Badsonicator QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td></td></tr><tr><td>Strahlteiler</td><td>Cairn</td><td>P280/210/MLS</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi Rotationsverdampfer</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>siehe Manuskripttext für Alternativen</td></tr><tr><td>konzentriertes Wasserstoffperoxid</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>konzentrierte Schwefelsäure</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidkleber</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>Filterrad</td><td>Sutter Instrumente</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>LabTek Kammern</td><td>VWR</td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>Laser &nbsp;</td><td>Toptica-verschiedene</td><td></td> <td>Varianten (Wellenlängen 375 - 785 nm) sind verfügbar</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Thorlabs, Newport-DGS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTA-Ni (Lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>bereits in Choroform-gelöster ausgelieferter Version der nicekl-Salzvariante wird empfohlen</td></tr><tr><td>POPC (Lipid)</td><td>Avanti Lipide</td><td>850457C</td><td>bereits in Choroform-gelöster ausgelieferter Version wird empfohlen</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axiovert 200</td><td></td> <td>Zeiss-Spiegel</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>optische Filter</td><td>AHF, Chroma, Semrock-Filter-Sets</td><td></td> <td>sind für viele verschiedene Farbkombinationen erhältlich</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>BK Precision&nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>Entgasung vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Periskop</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Alternative zum Epoxidleim-Leistungsmesser</td></tr><tr><td>Lasermate-Q</td><td>Coherent-jedes</td><td></td> <td>im verwendeten Spektralbereich empfindliche Leistungsmesser ist geeignet</td></tr><tr><td>Impulsgeber</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>räumlicher Filter</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,2 & Mikro m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TIRF-fähiges Apochromat-Objektiv 100x, NA 1,46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Trichlormethan/Chloroform</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen für die Ultrazentrifugation Polycarbonat 1,00 mm, 11 mm x 32 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Ultrazentrifuge &nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>RC M150GX</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenrotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>UV-Spektralphotometer Nanodrop 2000c</td><td>Thermo Fisher-Vakuumpumpe</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf planar unterstützte bilayers

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Im Laufe eines einzigen Jahrzehnts hat sich die Einzelmolekülmikroskopie von einer abgelegenen Domäne, die nur von Physikern mit einem starken Hintergrund in Optik und Laserphysik geteilt wird, zu einer Disziplin gewandelt, die jetzt lebhafte Aufmerksamkeit von Lebenswissenschaftlern aller Art genießt 1. Dies liegt daran, dass die Einzelmolekül-Bildgebung das einzigartige Potenzial hat, das Verhalten von Proteinen in situ in lebenden Zellen aufzudecken und die zelluläre Organisation mit einer noch nie dagewesenen Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts aufzudecken 2. Glasgestützte planare Lipiddoppelschichten (SLBs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zellen, die sonst in Suspension wachsen, nahe genug an den Objektträger zu bringen, so dass sie im rauschreduzierten Total Internal Reflection-Beleuchtungsmodus 3,4 problemlos abgebildet werden können. Sie sind sehr nützlich, um die Proteindynamik bei Plasmamembran-assoziierten Ereignissen zu untersuchen, die so unterschiedlich sind wie Zell-Zell-Kontaktbildung, Endozytose, Exozytose und Immunerkennung. Es werden einfache Verfahren vorgestellt, wie hochmobile proteinfunktionalisierte SLBs reproduzierbar erzeugt werden können, wie die Proteinmobilität innerhalb des Proteins bestimmt werden kann und wie Proteindichten mit Hilfe der Einzelmoleküldetektion gemessen werden können. Es wird gezeigt, wie man ein kosteneffizientes Einzelmolekül-Mikroskopiesystem mit TIRF-Beleuchtungsfähigkeit konstruiert und wie es im Experiment bedient wird.

Die Architektur der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopiesystem wird sehr detailliert in Figur 2 dargestellt. Einzelne Teile, wie optische Komponenten und anderen Hardware-Komponenten sind in der Einleitung erläutert. Die optischen Anregungsstrahlengänge, die Anstieg definiert auf TIRF und nicht TIRF-Beleuchtung zu geben, werden gezeigt und in den 3 bis 5 erläutert. Man beachte die Lage der 50:50 Strahlteiler vor dem ersten Spiegel angeordnet ist Periskop eine Mikrometer translatierbaren Stufe (Abbildung 5). Dieser Strahlteiler überlagert die TIRF Strahl für die Bildgebung verwendet (grün angezeigt) und der nicht-TIRF Strahl (rot gekennzeichnet) zum Bleichen oder lokale Öffnung definierte Licht-vermittelte Aktivierung Probe verwendet (wie in Abbildung 3 beschrieben). Die kombinierten Lichtwege (Abbildung 5, in orange dargestellt) sind über den zweiten Periskop Spiegel in den hinteren Anschluss des invertierten micr reflektiertOscope. Wie in Figur 4 erläutert und in Figur 2 skizziert, die Umsetzung von zwei oder drei konvexen Linsen erweitert die Laserstrahlprofile und fokussiert die Laserstrahlen auf der hinteren Brennebene des Objektivs um zu zwei kollimierten Strahlen ergeben Beleuchten der Probe in TIRF und jeweils in nicht-TIRF. Ein Beispiel für gemessene Intensitätswerte für die Berechnung der Leistungsdichte an der Probe erforderlich ist, in 6 gezeigt. Die durchschnittliche Hintergrundsignal, das von Intensitäten in dem beleuchteten und Zentralbereich (für die Bildgebung verwendet wird) gemessen subtrahiert werden soll, wird in einem Bereich innerhalb des fest Sichtfeld, die nicht durch den Laserstrahl (hier 7089 counts) beleuchtet wird. Die Hintergrund-korrigierten mittleren Intensitäten der beleuchteten (1684 Zählungen) und dem Mittelbereich (4830 Zählungen) werden dann durch die entsprechenden Bereichsgrößen multipliziert, um Anlass zu integrierten Intensitäten (1,471 gebenx 10 8 Fälle für den beleuchteten Bereich und 3.424 x 10 7 Zählungen für den zentralen Bereich). Das Verhältnis der integrierten Intensitäten innerhalb der zentralen und beleuchteten Bereiche ergibt den Bruchteil der Gesamtleistung Beleuchten der zentrale Bereich (0,23 bzw. 23%). Wie in dem Film dargestellt ist, weist die Gesamtleistung an dem Ziel bei der Verwendung eines Leistungsmessers in nicht TIRF Beleuchtungsmodus bestimmt werden. In unserem Beispiel wird sie auf 5 mW eingestellt, was was zu einer Leistung von 5 mW x 0,23 = 1,15 mW im zentralen Bereich. Da 41,5 Pixel Menge in unserem Beispiel 1 um 2 hat der zentrale Bereich eine Größe von 7089 /41.5 Pixel Pixel x &amp; mgr; m 2 = 170,8 &amp; mgr; m 2. Dividieren der Leistung der Licht Beleuchten der zentrale Bereich (1,15 mW) von diesem Bereich (170,8 &amp; mgr; m 2) ergibt eine mittlere LeistungDichte von 0,7 kW / cm 2 in dem zentralen Bereich. Abbildung 7 zeigt Bilder und entsprechende Intensitäts Ergebnisse in schneller Folge erworbenen Einzel Fluorophore (100 Bilder pro Sekunde, dh mit einem Zeitrahmen von 10 ms). Zur Intensitäts Quantifizierung der durchschnittliche Signal eines rechteckigen Bereichs von sieben und sieben (= 49) Pixel, die das Fluoreszenzsignal umfasst, wird bestimmt. Weiterhin ist die durchschnittliche Signal des Hintergrunds in einem rechteckigen Bereich von sieben von sieben Pixeln in der Nähe des einzelnen Moleküls Signals bestimmt. Der Hintergrund-korrigierten mittleren Signal wird durch die Anzahl von Pixeln in dem Bereich (= 49) multipliziert, um Anlass zu Einzelmolekülsignal (fett dargestellt) zu ergeben. Ein repräsentatives Experiment FRAP entwickelt, um die Mobilität von SLB-assoziierte Fluoreszenz-markierten Proteinen zu bewerten, ist in Fig. 8 gezeigt Hinweis in 8A die repetitive Verwendung eines verbreiterten geringer Intensität Abbildungsstrahl und dem einzigen Einsatz eines zweiten engeren und Blende definierten Strahl hoher Intensität für die schnelle Fluorochrom-Ablation bei dem zweiten Zeitpunkt Null. Hintergrund-subtrahiert mittleren Intensitäten im gelben Kreis, der durch die anfängliche durchschnittliche Intensitätswert vor dem Bleichimpuls normalisiert wurden, sind in Abbildung 8B gegen die Zeit, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß, zu dem Fluoreszenz erholt hat aufzuzeichnen aufgetragen. Wie gezeigt, hat mehr als 90% (durch die grüne Linie) der anfänglichen Doppelschichtstärke innerhalb von 75 sec nach Fluorochrom Ablation erholt. Als Folge weniger als 10% der Proteine ​​in der gezeigten SLB eingebettet sind unbeweglich. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung eines SLB-System. (A) SLBs aus POPC (90-99%) und dem synthetischen Lipid DGS NTA-N gemachti (1-10%). Sie bilden sich spontan, wenn saubere Glasoberflächen mit SUVs aus den entsprechenden Lipiden geladen. (B) Einmal gebildet, sind diese SLBs können mit löslichen Proteine ​​entweder mit einem C- oder N-terminalen Histidine-Tag mit zwölf (12H, für ausgedehnte dekorierenden zB die kostimulatorische Molekül B7-1 und das Adhäsionsmolekül ICAM-1) oder Protein-Dimere mit zwei Tags mit sechs Histidinen jeweils (2x6H, beispielsweise eine αβMHC Klasse-II-Dimer). erweiterte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Figur 2. Übersicht der Anregungs- und Emissionsstrahlengänge. Gasionenlaser (zum Beispiel Ar + oder Kr +) kann für eine schnelle Schließung mit dem Einsatz von akusto optischen mo betrieben werden<html> dulators. Laser-Dioden sind in vielen Wellenlängen heutzutage zur Verfügung und stellen eine hervorragende Alternative, da sie elektronisch im Mikrosekunden-rage moduliert werden. Beachten Sie, dass Laserstrahlen können leicht mit zwei (dichroitische) Spiegel und splitbereinigt und in Kombination mit der Verwendung von einfachen Strahlteiler Anlass zu zwei oder mehr Strahlengänge zu geben. In diesem Beispiel ein TIRF Abbildungsstrahl (um Ereignisse zu überwachen) und ein Bleichstrahl (entweder Bleich Fluorophore oder photo aktivieren Käfigmoleküle in einer Öffnung definiert) verwendet. Beide Anregungspfade können unabhängig voneinander durch die Verwendung von zusätzlichen Jalousien betreiben. Das Periskop ermöglicht zum Übersetzen der fokussierten Laserstrahlen in der hinteren Brennebene des Objektivs zu TIRF Beleuchtung der Probe zu erzeugen. Das Fluoreszenzbild können spektral mit dem Einsatz von einer Emissionsstrahlteiler vor dem Erwerb aufgeteilt werden unter Verwendung einer hochempfindlichen Kamera (zB EM-CCD oder wissenschaftlichen CMOS-Kamera)..com / files / ftp_upload / 53.158 / 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figur 3. Einstellen TIRF-Beleuchtung durch die Übersetzung der fokussierte Strahl innerhalb der hinteren Brennebene des Objektivs ist. Wie gezeigt den Brennpunkt des Laserstrahls ist innerhalb der hinteren Brennebene des Objektivs von der Mitte zu der Peripherie durch Translokation des Strahls verschoben (mit einem Periskop Spiegelanordnung). Als Ergebnis wird ein Parallelstrahl verlässt das Ziel in einer geneigten Beleuchtungs bis ein Grenzwinkel erreicht ist, bei welchem ​​die interne Totalreflexion kommt. Die abklingende Feld wird an der Glas-Media-Schnittstelle in denen Totalreflexion auftritt generiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi ansehen</a><html> Abbildung. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figur 4. Einfache optische Systeme, um den Laserstrahl in der hinteren Brennebene des Objektivs fokussieren. Drei oder zwei Linsen benötigt werden, um den Laserstrahl zu verbreitern und um es auf der hinteren Brennebene der TIRF Ziel zu fokussieren. Zwei Linsensysteme enthalten weniger Objektiv-assoziierten Fehler als drei Linsensysteme und könnten für die Erzeugung des TIRF Abbildungsstrahlen besser geeignet sein. Drei Linsen vielleicht vorzuziehen, wenn mit dem Ziel für definierte Strahlaufweitung und einer Beleuchtungsfleck mit scharfen Kanten, wie es für Studien mit Photoaktivierung oder Entfärbemittel der erforderlich sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Kommentierte Fotografie der Strahlengang an der Rückseite des Fluoreszenzmikroskops. Wie bereits in Abbildung 2 einen Rohr umrissen einfach implementieren zwei Anregungsstrahlen, eine in TIRF (grün angezeigt) die andere in nicht-TIRF-Modus (in angedeutet rot). Diese werden bei der Verwendung eines 50:50 Strahlteiler (BS) überschichtet. Konvexen Linsen (L1 und L2) sind in die jeweiligen Strahlen positioniert ist, um sie auf der hinteren Brennebene der Objektiv konzentrieren (nicht dargestellt). Ein Periskop aus zwei Spiegeln (M1 und M2) führt beide Strahlen durch den Hafen für die Einreise in das Mikroskop. Wobei der erste Spiegel (M1) mit dem Einsatz einer Translationsstufe (TS) (durch Drehen einer Mikrometerschraube wie angegeben) bewegt wird, um einen der Strahlen in TIRF Position zu bewegen. Sobald TIRF wurde festgestellt, kann der zweite Strahl (für Foto-Bleichen oder -Aktivierung, hier in rot angegeben verwendet) unabhängig von der TIRF Strahl eingestellt werden, um das Ziel in nicht-TIRF verlassenModus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Abbildung 6. Messung der Leistung im mittleren Bereich der Beleuchtungsfleck. Wie angedeutet wählte geeignete Regionen von Interesse, der Hintergrund zu reflektieren, die gesamte beleuchtete Fläche (IA) und der Zentralbereich (CA), wo Veranstaltungen werden später aufgenommen werden. Subtrahieren der Hintergrundwerte von denen für IA und CA erfasst und die Integration der Intensitäten durch Multiplikation korrigierten mittleren Intensitäten mit der Anzahl der in jedem Bereich (= integrierte Intensitäten) vorhanden Pixel. Teilen Sie die integrierte Intensität der CA durch, dass der IA an der Anteil der Strahlleistung Beleuchtung des CA gelangen (in diesem Beispiel: 23%). Bestimmen Sie die Leistung der Licht Beleuchten der CA, indem der Gesamtstrahlleistung (hier: 5 mW) mit dem Anteil Beleuchten der CA (hier: 0,23). Zur Bestimmung der Größe der zentralen Bereich multiplizieren Sie den Bereich (hier: 7089 Pixel) mit einer Bildpunkt-zu-Flächengröße Umrechnungsfaktor (hier: 1 / 41,5 &amp; mgr; m 2 Pixel -1). Um mit dem durchschnittlichen Leistungsdichte des Anregungslicht Beleuchtung des CA anreisen, teilen Sie die Leistung (hier: 1,15 mW) von der Größe des CA. (Hier: 170,8 &amp; mgr; m 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Abbildung 7. Die Quantifizierung der Einzelmolekül-Signale. (A) Zeitverlauf der einzelnen Fluorophore auf einer SLB. A 7 x 7 Pixel-Größe, Region of Interest (ROI, gelb) um das Signal für die Quantifizierung platziert. Hintergrund ist aus der einer benachbarten 7 x 7 Pixel bestimmtroi (grün). (B) Quantifizierte durchschnittliche Pixelintensitäten werden aufgelistet. Um die Einzelmolekül-Signal zu bestimmen, werden Hintergrundwerte (grün ROI) von Signalwerten (gelb roi) subtrahiert und multipliziert mit 49. (C) Einzelmolekül Intensitäten einem Fluorophor gegen die Zeit aufgetragen. Beachten Sie, dass die 90 msec Zeitpunkt weggelassen, wie das Fluorophor in den Prozess der Bleiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Abbildung 8. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse, um die Integrität des SLB bestimmen. (A) FRAP wurde an einem Doppelschicht tragenden Iek / MCC-Alexa Fluor 647. Jeder 10. Bild des Experiments ist in (B) FRAP Quantifizierung des in dargestellten Experiment durchgeführt. (A). Werte zeigen mittleren Intensitäten (I) innerhalb der in (A) gezeigt, gelb ROI dividiert durch die Anfangsintensität (I o) vor der Bleiche. Red Datenpunkte werden in (A) angezeigt wird, zeigt die grüne Linie 0.9 Wiederherstellung der ursprünglichen Intensitäten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

In diesem Video zeigen wir, wie man biofunktionalisierte planare unterstützte Lipiddoppelschichten herstellt und charakterisiert. Außerdem beschreiben wir detailliert die Architektur eines Mikroskops mit totaler innerer Reflexion, das über Einzelmoleküldetektionsfähigkeiten verfügt. Wir messen die Anregungsleistungsdichte, die Fluidität und die Proteindichte der Lipiddoppelschicht.Beginnen wir mit der kurzen Einführung zur planaren, glasgestützten Lipiddoppelschicht. Wenn kleine einwandige Vesikel auf eine saubere Glasoberfläche treffen, platzen sie und breiten sich aus, um eine zusammenhängende Lipiddoppelschicht zu bilden. Auf einem Wasserpolster wählen wir typischerweise Palmmaterial.POP oder POPC ist das vorherrschende Lipid, da es bei Raumtemperatur und 37 Grad Celsius flüssige Lipiddoppelschichten bildet. Zur Funktionalisierung fügen wir Nickel-NTA hinzu, ein synthetisches Lipid mit einer Nickel-chelatisierenden Kopfgruppe, die Poly-Histidin-Tag-Proteine bindet. Beispielsweise das kostimulatorische Molekül B7-1, das Adhäsionsmolekül ICAM-1 und das fluoreszenzmarkierte, peptidbeladene MHC-Molekül zur Erkennung durch T-Zellen, wie hier gezeigt. Dieses Lipiddoppelschicht-System kann jedoch prinzipiell auch zur Untersuchung völlig unterschiedlicher Prozesse in einer Vielzahl biologischer Systeme eingesetzt werden.Aufgrund der Beschaffenheit des planaren Systems können Fluoreszenzereignisse im Modus der totalen inneren Reflexion überwacht werden, was das zelluläre Hintergrundsignal erheblich reduziert und sich sehr gut für die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie eignet. Für die Lipidpräparation benötigt man die Lipide POPC und Nickel-Antiox-Chloroform sowie einen sauberen Rundkolben. Lösen Sie die Lipide im gewünschten Verhältnis in Chloroform und trocknen Sie sie unter Vakuum, wie hier gezeigt. Nach der Behandlung unter Hochvakuum über Nacht bilden die Lipide einen Film auf der Innenseite des Kolbens. Zur Lipidrehydratisierung verwenden Sie entgastes PBS, indem Sie 10 Milliliter des entgasten PBS zur getrockneten Lipidmischung geben.Nicht mischen. Um nun eine Lipidoxidation zu vermeiden, füllen Sie das Kolben mit einem Inertgas wie Stickstoff oder Argon und schwenken Sie das Kolben. Die Lipide bilden eine milchige Suspension. Entnehmen Sie eine kleine Probe als Blindwert für das Spektrophotometer, um während des nächsten Schritts einen Gasaustausch zu verhindern. Es ist sehr wichtig, den Kolben mit der Lipidsuspension ordnungsgemäß zu verschließen. Verwenden Sie ein wärmestabiles Klebeband, zum Beispiel Autoklavierband, um während der physikalischen Herstellung in einem geschlossenen Ultraschallbad einen Luftschutz zu gewährleisten.Nachdem der Kolben montiert wurde, beginnen Sie die Beschallung bei einer maximalen Leistung von 170 Watt. Beschallen Sie 60 Minuten lang. Aufgrund der physikalischen Bildung hat die Trübung signifikant abgenommen.Dies kann durch Spekrophotometrie bei 550 Nanometern überprüft werden. Verwenden Sie die Aliquote, die vor der Beschallung entnommen wurde, als Blindwert. Die optische Dichte bei 230 Nanometern, die auf die Lipidmenge hinweist, sollte konstant bleiben.Hier füllen wir kleine Ultrazentrifugenröhrchen mit einer Milliliter-Visl-Suspension und geben sie in einen festen Winkelrotor einer Tisch-Ultrazentrifuge. Es ist sehr wichtig, nur kleine unilaminare Vesikel für die Bilayer-Präparation zu verwenden. Größere und dichtere multilaminare Vesikel, die ebenfalls während der Beschallung entstehen, stören die Bilayer-Fluidität und müssen daher durch Zentrifugation pelletiert und entfernt werden.Zunächst zentrifugieren wir eine Stunde lang bei 150.000 G bei Raumtemperatur. Das resultierende Snat wird anschließend weitere acht Stunden bei 288.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Glasplättchen müssen sehr sauber sein, bevor Lipidvesikel sich darauf ausbreiten können, um eine zusammenhängende und fluide Doppelschicht zu bilden.Dazu geben wir Deckgläser in einen Teflonbehälter, den wir anschließend in ein Glasgefäß stellen. Dabei ist größte Vorsicht geboten, weshalb Schutzbrille, Schutzhandschuhe und Laborkittel getragen werden müssen und im Abzug gearbeitet werden sollte. Wir fügen eine Portion 30%ige Wasserstoffperoxidlösung hinzu und danach drei Portionen konzentrierte Schwefelsäure, wodurch sehr reaktive und oxidierende Peroxomonoschwefelsäure entsteht.Dieses Gemisch reagiert heftig mit organischen Substanzen, einschließlich solchen in Ihrer Haut, Ihren Augen und Ihrer Kleidung. Es erwärmt sich sofort. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang.Nehmen Sie die Deckglas mit einer Pinzette. Spülen Sie die Säure gründlich von beiden Seiten des sauberen Deckglases mit destilliertem oder hochwertigem, nichtionisiertem Wasser ab. Anschließend wird das Deckglas auf einen Teflon-Präzisionsständer gestellt und nicht länger als 10 Minuten trocknen gelassen, um mehrere einzelne Lipiddoppelschichten gleichzeitig herstellen zu können. Getrocknete Deckgläser verkleben wir mit schnell aushärtendem Kleber.Zweikomponenten-Epoxidharzkleber entweder auf eine 8- oder 16-Well-Labortechnik-Kammer. Entfernen Sie zunächst die ursprüngliche Lept-Objektträger vorsichtig aus ihrem Rahmen. Mischen Sie die beiden Klebestoffkomponenten im Verhältnis 1:1. Verteilen Sie es gleichmäßig in den unteren Rillen des Kammergestells. Legen Sie die saubere Deckglasplatte auf die mit Klebstoff bedeckte Unterseite des Kammergestells. Stellen Sie sicher, dass der Klebstoff gleichmäßig zwischen Objektträger und Kunststoffrahmen verteilt ist.Lassen Sie den Klebstoff 30 Minuten lang aushärten. Verdünnen Sie die physikalische Lipid-Suspension in PBS im Verhältnis 1 zu 10 und filtrieren Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Filter. Geben Sie 120 Mikroliter dieser Verdünnung in jedes Loch einer 8-Loch-Kammer oder 60 Mikroliter in jedes Loch einer 16-Loch-Kammer. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Glasoberfläche bedeckt ist, und warten Sie 20 Minuten.Die Doppelschicht hat sich nun gebildet. Um restliche Lücken zu entfernen, spülen Sie jedes Gefäß mit 30 Milliliter PBS. Vermeiden Sie unter allen Umständen eine Belüftung der Glasoberfläche. Dies würde die Doppelschicht sofort zerstören. Stellen Sie sicher, dass jedes Gefäß das gleiche Puffervolumen enthält. Für den folgenden Proteindekorationschritt füllen Sie jedes Gefäß vollständig und entfernen Sie die flüssige Wölbung.Entnehmen Sie 330 Mikroliter. Dadurch verbleiben etwa 350 Mikroliter in jedem. Um die Doppelschicht mit Proteinen zu funktionalisieren, bereiten Sie eine Master-Mischung vor, die die gewünschten Poly-Histidin-markierten Proteine enthält, und geben Sie 50 Mikroliter davon in jedes Loch. Proteine binden an die Nickel-Anti-Kopfgruppe des dunklen Lipids, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten; gründlich, aber vorsichtig mischen und stets 60 Minuten inkubieren, um ungebundene Proteine zu entfernen. Nochmals mit 30 Milliliter PBS waschen. Konzentrieren wir uns nun auf die Mikroskopie-Hardware.Zunächst erläutern wir die Anforderungen der Totalreflexionsmikroskopie für die objektivbasierte TIRF-Mikroskopie. Man benötigt ein Öl-Immersion-Objektiv mit einer hohen numerischen Apertur. Der einfallende Laseranregungsstrahl wird vom dichroitischen Spiegel reflektiert und mithilfe eines Systems aus zwei oder drei Linsen ausschließlich auf die hintere Brennebene des Objektivs fokussiert.Dann leitet das Laserlicht den beschichteten Strahl entlang der optischen Achse zum Objektiv. Auf diese Weise wird die fluoreszierende Probe in ihrer gesamten Tiefe beleuchtet. Wenn man den Strahl senkrecht zur optischen Achse verschiebt, bleibt der Strahl kollimiert, verlässt das Objektiv jedoch geneigt.Wenn Sie fortfahren, das Licht zu translozieren, erreichen Sie irgendwann den kritischen Winkel, bei dem der Strahl vollständig an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckel und der Probe reflektiert wird. Die Intensität der resultierenden evaneszenten Welle nimmt exponentiell ab, und nur Strukturen, die sich in unmittelbarer Nähe der Grenzfläche – bis zu mehreren hundert Nanometern – befinden, werden angeregt. Nun veranschaulichen wir, wie man den Laserstrahl manuell in die hintere Brennebene des Objektivs fokussiert.Unter Verwendung von drei oder zwei Linsen, wobei die ersten beiden Linsen genutzt werden, wird der Durchmesser des Laserstrahls vergrößert. Das Verhältnis ihrer Brennweiten bestimmt die Größe des Beleuchtungsflecks in der Objektebene. Um sicherzustellen, dass der Strahl kollimiert bleibt, stellen Sie den Abstand zwischen diesen Linsen so ein, dass er der Summe beider Brennweiten entspricht.Die dritte Linse dient dazu, den verbreiterten Strahl in die hintere Brennebene des Objektivs zu fokussieren. Da die Brennweite dieser Linse an die Abmessungen des Mikroskoprumpfes sowie an ein assoziiertes Periskop angepasst werden muss, ist sie in unserem Fall deutlich länger, etwa 75 Zentimeter. Der Abstand zwischen der zweiten und dritten Linse hat keinen Einfluss auf die Strahleigenschaften.Daher kann der unendliche Zwischenraum genutzt werden, um den Strahl auf definierte Weise ohne Verzerrungen zu modifizieren. Beispielsweise kann eine Blende eingefügt und exakt auf die Objenebene projiziert werden. Im Wesentlichen lässt sich dasselbe auch mithilfe von zwei Linsen anstelle von dreien erreichen.Das Zweilinsensystem ist weniger definiert, verursacht jedoch weniger Linsenaberrationen. Einfache Elemente wie eine Blende können dennoch sehr gut für die zeitliche Modulation umgesetzt werden. Vor einen mechanischen Verschluss oder einen optischen Modulator sollte ein Gas-, Eisen- oder Festkörperlaser im Millisekundenbereich platziert werden.Eine gute Alternative ist ein Diodenlaser, der elektronisch moduliert werden kann und keine externe Abschaltung benötigt. Zwei Spiegel genügen, um den Strahl an beliebige Orte und in beliebige Richtungen zu lenken. Wie zuvor erörtert, dienen die beiden Linsen dazu, den Strahl zu verbreitern und ihn auf der hinteren Brennebene des Mikroskopsobjektivs zu fokussieren.Wir können den Strahl für die Rasenkonfiguration verschieben, indem wir den unteren Spiegel des Periskops auf einer optischen Schiene bewegen. Zur Bilderkennung verwenden wir eine hochsensible Kamera. Beispielsweise kann ein elektronenvervielfachendes ladungsgekoppeltes Gerät oder em CCD sowie ein zweiter Laserstrahl einer anderen Wellenlänge in den Strahlengang eingestellt werden.Mithilfe von Spiegeln und einer dichroitischen Überlagerung. Für die gleichzeitige Detektion von zwei Farben platzieren wir eine im Handel erhältliche Strahlteiler-Vorrichtung in den Emissionspfad. Für Experimente ist es sehr nützlich, zwei unabhängige Anregungsstrahlpfade bereitzuhalten.Zum Beispiel eines für die Rasenabbildung und ein zweites für gezieltes Photobleichen oder Aktivieren. Dies kann leicht durch die Implementierung eines Satzes von zwei 50:50-Strahlteilern erreicht werden. Wie in unserer Abbildung dargestellt, führen zwei verschiedene Linsen- und Spiegeljustiersysteme zu zwei individuellen Strahlprofilen und Strahlwinkeln.Zum Beispiel eine erweiterte für die Bildgebung im Turf und eine fokussiertere für das Bleichen oder die Aktivierung außerhalb des Turfs. Eine Blende kann in den Strahlengang außerhalb des Turfs eingefügt werden, um den Bleich- oder Aktivierungspunkt präzise zu formen. Zwei zusätzliche Verschlüsse, jeweils einer für jeden Strahlengang, ermöglichen eine unabhängige Schaltsteuerung des Laserstrahls, wodurch der Objektivweg gerade und nicht geneigt bleibt.Schalten Sie das Leistungsmessgerät ein und stellen Sie es auf die entsprechende Laserwellenlänge ein. Messen Sie die Leistung des Laserlichts am Objektiv und notieren Sie diese. Bringen Sie nun den Spiegel hinter dem Mikroskop in eine gekippte Position, um den Laserstrahl am Objektiv in die „turf“-Position zu lenken.Sehen Sie niemals direkt in das Laserlicht. In der unteren rechten Ecke sehen Sie das Intensitätsprofil des Anregungslasers, dargestellt durch die Emission einer Doppelschicht, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert ist. Hier verwenden wir eine Falschfarbendarstellung, um Bereiche unterschiedlicher Intensität hervorzuheben.Messen Sie die durchschnittliche Intensität des Hintergrunds in einem ausreichend großen Bereich von Interesse. Dieser Wert hängt von spezifischen Kameraeinstellungen wie EM-Verstärkung und Auslesegeschwindigkeit ab und muss von allen gemessenen Intensitäten subtrahiert werden. Bestimmen Sie die durchschnittliche Intensität innerhalb der gesamten beleuchteten Fläche.Wählen Sie einen Durchmesser, der groß genug ist, sodass die Intensitätswerte am Rand denen des Kamerahintergrunds ähneln; messen Sie die durchschnittliche Intensität des zentralen Bereichs. Dieser Bereich definiert die Region von Interesse, in der später die Mikroskopieexperimente durchgeführt werden. Subtrahieren Sie nun den durchschnittlichen Hintergrundintensitätswert von den Intensitäten sowohl des eliminierten als auch des zentralen Bereichs.Anschließend multiplizieren Sie die hintergrundkorrigierten Intensitäten mit der entsprechenden Pixelanzahl der Bereichsgröße, um die integrierten Intensitäten zu erhalten. Setzen Sie die integrierte Intensität des beleuchteten Bereichs auf eins und berechnen Sie den Anteil für den zentralen Bereich. Die mit dem Leistungsmesser gemessene Leistung.In unserem Fall sind fünf Milliwatt direkt proportional zur integrierten Intensität des gesamten beleuchteten Bereichs. Multiplizieren Sie diesen Wert mit dem Leistungsanteil des zentralen Bereichs, um die Leistung innerhalb des zentralen Bereichs zu bestimmen. In unserem Beispiel, 1,15 Milliwatt, hängt der Faktor zur Umrechnung der Pixelanzahl in Quadratmikrometer von der tatsächlichen Pixelgröße des Kamerachips und der Vergrößerung des Emissionspfads ab.Sie kann mithilfe eines Objektmikrometers leicht bestimmt werden. In unserem Beispiel entspricht der zentrale Bereich 170,8 Quadratmikrometern. Die Leistungsdichte bezieht sich auf die gemessene Leistung geteilt durch die Fläche und beträgt somit 1,15 Milliwatt geteilt durch 170,8 Quadratmikrometer oder 0,007 Milliwatt pro Quadratmikrometer.Das entspricht 0,7 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Um die Fließfähigkeit der Doppelschicht zu bestimmen, führen wir eine Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichung in einem Wrap-Versuch durch. Wie im Film unten links gezeigt, nehmen wir die fluoreszierende Doppelschicht mit geringer Leistungs­dichte auf.Im unteren rechten Film sehen Sie die entsprechende Labor-Technologiekammer am Mikroskop. Anschließend bleichen wir einen kreisförmigen Bereich mit kurzen, hochintensiven Lichtimpulsen und verfolgen die Wiederherstellung bei geringer Leistungsdichte. Auch hier bietet die Montage einen Überblick über das Experiment zu verschiedenen Zeitpunkten, wobei der Zeitpunkt null den Bleichimpulsen entspricht.Wir quantifizieren die durchschnittliche, hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensität innerhalb des markierten Kreises und normalisieren alle gemessenen Intensitäten auf die Intensität zu Beginn des Experiments. Vor den Bleichimpulsen tragen wir die normalisierten Intensitätswerte gegen die Zeit auf. Der Sättigungswert stellt in unserem Fall den mobilen Anteil dar, der über 90 % beträgt. Zunächst nehmen wir ein Bild der Doppelschicht bei geringer Anregungsleistungsdichte auf.Beispielsweise verringert die Verwendung eines optischen Dichtefilters mit einem logarithmischen Dämpfungswert von zwei die Leistung um einen Faktor von 100. Die Belichtungszeit sollte während des gesamten Verfahrens konstant sein und ausreichen, um einzelne Fluidkräfte bei der nicht gedämpften Leistungsdichte abzubilden; in unserem Fall 10 Millisekunden bei 0,7 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Verwenden Sie eine Falschfarbendarstellung, um Bereiche mit unterschiedlichen Intensitäten hervorzuheben.Wählen Sie eine Region von Interesse aus, in der später Einzelmolekül-Messungen durchgeführt werden sollen, sowie eine Region gleicher Größe. Berechnen Sie zur Hintergrundsubtraktion die integrierte Intensität nach Hintergrundabzug. Entfernen Sie nun den optischen Dichtefilter aus dem Anregungsstrahlengang, bleichen Sie die Fläche aus und nehmen Sie ein Bild auf.Sie werden einzelne Fluor-Kräfte sehen, die sich im gebleichten Bereich ausbreiten. Einzelne Fluor-Kräfte sind beugungsbegrenzt und weisen einen typischen Durchmesser von zwei bis drei Pixeln auf. Wählen Sie einen Bereich von sieben mal sieben Pixeln um jedes einzelne Molekülsignal sowie einen zweiten Bereich in unmittelbarer Nähe. Zur Hintergrundsubtraktion ist es wichtig, ausschließlich das Signal einzelner Fluor-Kräfte zu quantifizieren.Daher ist es am besten, Proteine auf der BI-Schicht mit einem Verhältnis von Reagenz zu Protein von weniger als eins oder für SAT spezifisch markierte Proteine abzubilden. Noch mehr bei einem Verhältnis von Reagenz zu Protein von eins, wie in unserem Beispiel gezeigt, messen Sie die integrierten Intensitäten für beide Bereiche und subtrahieren Sie die Untergrundintensität vom Signal, um nicht das zuletzt beobachtete Ereignis in unserem Beispiel als solches anzunehmen, da eine Bleiche wahrscheinlich während der Belichtung eingetreten ist. Die korrigierten Signale hierfür führen wir dies für eine Fluorophor-Messung von vier durch, die wir über neun Bilder beobachten.Dieses Verfahren sollte jedoch für mindestens mehrere hundert Einzelmolekülereignisse durchgeführt werden. Kehren wir nun zu unserem ursprünglichen Bilayer-Bild zurück, das bei abgeschwächter Anregungsleistungsdichte beobachtet wurde. Die Moleküldichte wird bestimmt, indem die integrierte Intensität des interessierenden Bereichs für niedrige Anregungsleistungsdichte korrigiert wird, indem sie mit hundert multipliziert und anschließend durch die durchschnittliche Einzelmolekülintensität und die Fläche dividiert wird.Wir arbeiten mit einer Dichte von 421,4 Fluor-Kraft pro Quadratmikrometer. In unserem Beispiel entspricht dies bei einem Verhältnis von Nahrung zu Protein von eins der gleichen Anzahl von Molekülen pro Quadratmikrometer. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, einen proteinfunktionalisierten Lipiddoppelschicht mittels Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie herzustellen und zu charakterisieren.Weiterhin sollten Sie mit den grundlegenden Prinzipien vertraut sein, ein Standardmikroskop für diesen Zweck zu modifizieren und aufzurüsten. Wir werden diese Methodik später verwenden, um die Bindungskinetik von einer Doppelschicht gebundenen Antigenen an Zell-gebundene T-Zell-Rezeptoren zu bestimmen, aber viele andere darauf basierende Anwendungen sind durchaus möglich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Untersuchung der Septinorganisation auf einer glasgestützten Lipiddoppelschicht in vitro mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: Eine mikroskopiebasierte In-vitro-Technik zur Untersuchung der Septin-Assemblierung auf biologischen Membranimitatoren

Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Lernen Sie die Herstellung und Charakterisierung biofunktionalisierter planarer Lipid-Doppelschichten für Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Studien zu Membranproteindynamik.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

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