Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In diesem Video zeigen wir, wie biofunktionalisierte, planar unterstützte Lipidbilaren hergestellt und charakterisiert werden können. Wir werden auch die Architektur eines Totalreflexionsmikroskops mit Einzelmoleküldetektionsfunktionen detailliert beschreiben. Wir werden die Anregungsleistungsdichte, die Fließfähigkeit und die Proteindichte des Lipidblays messen.

Beginnen wir mit der kurzen Einführung in das planare glasgestützte Lipid-Blay. Wenn kleine unilanare Vesikel auf eine saubere Glasoberfläche treffen, platzen sie auf und breiten sich aus, um eine zusammenhängende Lipiddoppelschicht zu bilden. Bei einem Wasserkissen wählen wir in der Regel Handflächenmaterial.

Ole phosphocholin oder POPC hat das vorherrschende Lipid, da es bei Raumtemperatur und 37 Grad Celsius flüssige Lipiddoppelschichten entstehen lässt. Zur Funktionalisierung fügen wir Nickel-Antiox hinzu, ein synthetisches Lipid mit einer Nickel-Chelat-Kopfgruppe, das Polyhistamin-Tag-Proteine bindet. Zum Beispiel das co-stimulatorische Molekül B seven one, das Adhäsionsmolekül ICAM one und das fluoreszenzmarkierte peptidbeladene MHC-Molekül für die T-Zell-Erkennung, wie hier gezeigt, kann dieses Doppelschichtsystem jedoch prinzipiell eingesetzt werden, um völlig unterschiedliche Prozesse in einer Vielzahl von biologischen Systemen zu adressieren.

Aufgrund der Beschaffenheit des planaren Systems können Fluoreszenzereignisse im Totalreflexionsmodus überwacht werden, was den zellulären Hintergrund erheblich reduziert und sehr gut für die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie geeignet ist. Für die Lipidherstellung benötigt man die Lipide, POPC und Nickel-Antiox-Chloroform, und einen sauberen Rundkolben, um die Lipide im gewünschten Verhältnis aufzulösen und Chloroform zu bilden und unter Vakuum zu trocknen, wie hier gezeigt. Nach der Hochvakuumbehandlung über Nacht bilden die Lipide einen Film auf der Innenseite des Kolbens. Zur Lipidrehydratation verwenden Sie Degas PBS zu 10 Millilitern des Degas PBS auf das getrocknete Lipidgemisch.

Nicht mischen. Um eine Lipidoxidation zu vermeiden, füllen Sie nun den Kolben mit einem Inertgas wie Stickstoff oder Argon und schwenken Sie den Kolben. Die Lipide bilden eine milchige Suspension.

Entnehmen Sie eine kleine Probe als Rohling für das Spektralphotometer, um einen Gasaustausch im nächsten Schritt zu verhindern. Es ist sehr wichtig, den Kolben mit der Lipidsuspension richtig zu verschließen. Verwenden Sie ein hitzestabiles Klebeband, z. B. ein Autoklavenband, bei dem die Luft während der physikalischen Bildung mit einem geschlossenen Ultraschallbad geschützt wird.

Nach dem Montieren des Kolbens wird der Beschallungsvorgang mit einer maximalen Leistung von 170 Watt gestartet. Sonic Cade für 60 Minuten. Aufgrund der physikalischen Bildung ist die Trübung deutlich gesunken.

Dies kann durch Spektrophotometrie bei 550 Nanometern nachgewiesen werden. Verwenden Sie das Aliquot, das vor der Beschallung entnommen wurde, als Rohling. Die optische Dichte bei 230 Nanometern, die ein Indikator für die Lipidmenge ist, sollte konstant bleiben.

Hier befüllen wir kleine Ultrazentrifugationsröhrchen mit einer Milliliter-Visl-Suspension und setzen sie in einen Festwinkelrotor einer Tisch-Ultrazentrifuge ein. Es ist sehr wichtig, nur kleine Uni-Laina-Vesikel für die Herstellung von Doppelschichten zu verwenden. Größere und dichtere Multi-Laina-Vesikel, die auch während der Beschallung gebildet werden, beeinträchtigen die Fließfähigkeit der Doppelschicht und müssen daher durch Zentrifugation geblassen und entfernt werden.

Zuerst schleudern wir eine Stunde lang bei 150.000 g bei Raumtemperatur. Die resultierende Snat wird dann für weitere acht Stunden bei 288.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Glasleuchten müssen sehr sauber sein, bevor sich Lipidvesikel auf ihnen ausbreiten und eine zusammenhängende und flüssige Doppelschicht bilden können.

Dazu legen wir Deckgläser in einen Teflonhügel, die wir dann in eine Glasgefäßübung legen. Große Vorsicht bei Augenschutz, schützenden Handschuhen und einem Laborkittel und Arbeit in einem Chemikalienschrank. Wir fügen einen Teil 30%iges Wasserstoffperoxid und dann drei Teile konzentrierte Schwefelsäure hinzu, um eine sehr reaktive und oxidative Periomonoschwefelsäure zu erhalten.

Dieses Gemisch reagiert heftig mit organischen Substanzen, auch mit denen Ihrer Haut, Ihrer Augen und Ihrer Kleidung. Es heizt sich sofort auf. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang.

Greifen Sie den Deckglas mit Gewalt ab Waschen Sie die Säure auf beiden Seiten des sauberen Deckblatts gründlich mit W destilliertem oder hochwertigem Union-Wasser ab. Legen Sie dann den Objektträger auf einen Teflonständer und lassen Sie ihn nicht länger als 10 Minuten trocknen, um mehrere einzelne Lipiddoppelschichten auf einmal herstellen zu können. Wir kleben getrocknete Deckgläser mit schneller Aushärtung.

Zweikomponenten-Epoxidkleber auf eine Laborkammer mit acht oder 16 Bohrlöchern. Entfernen Sie zunächst den originalen Leptglasschieber vorsichtig aus seinem Rahmen. Mischen Sie die beiden Leimkomponenten im Verhältnis eins zu eins.

Verteilen Sie es gleichmäßig in den unteren Rillen des Kammerrahmens. Legen Sie den sauberen Deckglas auf die mit Klebstoff bedeckte Unterseite des Kammerrahmens. Achten Sie darauf, dass der Kleber gleichmäßig zwischen dem Glasschieber und dem Kunststoffrahmen verteilt ist.

Lass den Kleber 30 Minuten aushärten. Verdünnen Sie die physikalische Lipidsuspension in PBS eins bis 10 und filtrieren Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Filter bei 120 Mikrolitern dieser Verdünnung in jede Vertiefung einer Acht-Well-Kammer oder 60 Mikroliter in jede Vertiefung einer 16-Well-Kammer. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Glasoberfläche abgedeckt ist, und warten Sie 20 Minuten.

Die Doppelschicht hat sich nun gebildet: Um Reste loszuwerden, spülen Sie jeden gut mit 30 Millilitern PBS aus. Vermeiden Sie um jeden Preis die Freilegung der Glasoberfläche. Dadurch wird die Doppelschicht sofort zerstört, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung das gleiche Volumen an Puffer enthält. Füllen Sie für den folgenden Schritt der Proteindekoration jede Vertiefung vollständig und entfernen Sie die Flüssigkeitskuppel.

Nehmen Sie 330 Mikroliter heraus. Dadurch verbleiben jeweils etwa 350 Mikroliter. Um die Doppelschicht mit Proteinen zu dekorieren, bereiten Sie einen Mastermix mit Polyhistamin-Tech-Proteinen Ihrer Wahl vor und geben Sie 50 Mikroliter davon in jede Vertiefung

Proteine binden an die Nickel-Anti-Kopf-Gruppe des dunklen Lipids, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten gründlich, aber sorgfältig gemischt und immer 60 Minuten lang inkubieren, um ungebundene Proteine zu entfernen. Nochmals mit 30 Millilitern PBS waschen. Konzentrieren wir uns nun auf die Mikroskopie-Hardware.

Zunächst werden die Anforderungen der Totalreflexionsmikroskopie für die objektive Rasenmikroskopie veranschaulicht. Man benötigt ein Ölimmersionsobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur. Der einfallende Laseranregungsstrahl wird vom dichroitischen Spiegel reflektiert und über einen Satz von zwei oder drei Linsen nur auf die hintere Brennebene des Objektivs fokussiert.

Dann führt das Laserlicht das Objektiv als beschichteter Strahl entlang der optischen Achse. Auf diese Weise wird die fluoreszierende Probe in ihrer gesamten Tiefe beleuchtet. Wenn Sie den Strahl senkrecht zur optischen Achse verschieben, bleibt der Strahl magaziniert, verlässt das Objektiv jedoch gekippt.

Wenn Sie die Translokation fortsetzen, erreichen Sie irgendwann den kritischen Winkel, bei dem der Strahl an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckglas und der Probe vollständig reflektiert wird. Die Intensität der resultierenden evaneszenten Welle nimmt exponentiell ab und nur die vier Stockwerke, die sich in unmittelbarer Nähe der Grenzfläche befinden, werden bis zu mehreren hundert Nanometern angeregt. Nun veranschaulichen wir, wie der Laserstrahl manuell in die hintere Brennebene des Objektivs fokussiert wird.

Durch die Verwendung von drei oder zwei Linsen mit den ersten beiden Linsen wird der Durchmesser des Laserstrahls vergrößert. Das Verhältnis ihrer Brennweite bestimmt die Größe des Beleuchtungsflecks in der Probenebene. Um sicherzustellen, dass der Strahl magaziniert bleibt, stellen Sie den Abstand zwischen diesen Linsen so ein, dass er der Summe beider Brennweiten entspricht.

Die dritte Linse wird verwendet, um den verbreiterten Strahl in die hintere Brennebene des Objektivs zu fokussieren. Da die Brennweite dieses Objektivs den Abmessungen des Mikroskopgehäuses und der eines zugehörigen Periskops entsprechen muss, muss sie in unserem Fall viel länger sein, 75 Zentimeter variierend. Der Abstand zwischen Linse zwei und drei hat keinen Einfluss auf die Strahleigenschaften.

Daher kann der Unendlichkeitsraum dazwischen genutzt werden, um den Strahl auf definierte Weise ohne Verzerrungen zu modifizieren. Sie können z.B. eine Apertur einfügen und präzise auf die Probenebene projizieren. Im Wesentlichen können Sie dasselbe mit der Verwendung von zwei Linsen anstelle von drei erreichen.

Das Zwei-Linsen-System ist weniger definiert, führt aber zu weniger Linsenaberrationen. Einfache Features wie eine Apertur lassen sich dennoch sehr gut für die zeitliche Modulation umsetzen. Ein Gas-, Eisen- oder Festkörperlaser sollte vor einem Millisekunden-Verschluss platziert werden, beispielsweise einem mechanischen Verschluss oder einem optischen Modulator.

Eine gute Alternative ist ein Diodenlaser, der elektronisch moduliert werden kann und keine externe Abschaltung benötigt. Zwei Spiegel reichen aus, um den Strahl auf jeden Ort und in jede Richtung zu richten. Wie bereits erwähnt, werden die beiden Linsen verwendet, um den Strahl zu verbreitern und auf die hintere Brennebene des Mikroskops zu fokussieren. Objektiv.

Wir können den Strahl für die Rasenkonfiguration translozieren, indem wir den unteren Spiegel des Periskops auf eine optische Schiene verschieben. Für die Bilderkennung verwenden wir eine hochempfindliche Kamera. Zum Beispiel kann ein elektronenmultiplizierendes ladungsgekoppeltes Gerät oder ein zweiter CCDA-Laserstrahl einer anderen Wellenlänge in den Strahlengang ausgerichtet werden.

Mit Hilfe von Spiegeln und einer dichroitischen Überlagerung. Für die gleichzeitige Zweifarbendetektion platzieren wir ein kommerziell erhältliches Strahlteilergerät in den Emissionspfad. Für Experimente ist es sehr nützlich, zwei unabhängige Anregungsstrahlengänge zu haben.

Zum Beispiel eine für die Rasenbildgebung und eine zweite für gezieltes Photobleaching oder Aktivierung. Dies kann ohne weiteres durch die Implementierung eines Satzes von 2 50 50 Strahlteilern erreicht werden. Wie in unserer Abbildung zu sehen ist, ergeben sich durch zwei unterschiedliche Linsen- und Spiegelverstellsysteme zwei individuelle Abstrahlprofile und Abstrahlwinkel.

Zum Beispiel eine verbreiterte für die Bildgebung in Rasen und eine fokussiertere für das Bleichen oder Aktivieren in Nicht-Rasen. In den Nicht-Rasenbalken kann eine Apertur eingesetzt werden, um den Bleich- oder Aktivierungspunkt präzise zu formen. Zwei zusätzliche Verschlüsse, einer für jeden Strahlengang, ermöglichen einen unabhängigen Steuerschalter am Laserstrahl, so dass sich das Objektiv in einem geraden, nicht geneigten Pfad befindet.

Schalten Sie den Leistungsmesser ein und stellen Sie ihn auf die entsprechende Laserwellenlänge ein. Messen Sie die Leistung des Laserlichts am Objektiv und notieren Sie diese. Verschieben Sie nun den Spiegel hinter das Mikroskop, um den Laserstrahl am Objektiv in die Rasenposition zu kippen.

Schauen Sie niemals direkt in das Laserlicht. In der unteren rechten Ecke sehen Sie das Intensitätsprofil des Anregungslasers, wie es durch die Emission einer mit fluoreszierenden Proteinen verzierten Doppelschicht sichtbar wird. Hier verwenden wir eine Falschfarbendarstellung, um Bereiche unterschiedlicher Intensität hervorzuheben.

Messen Sie die durchschnittliche Intensität des Hintergrunds innerhalb eines ausreichend großen Interessenbereichs. Dieser Wert hängt von spezifischen Kameraeinstellungen wie EM-Verstärkung und Auslesegeschwindigkeit ab und muss von allen gemessenen Intensitäten abgezogen werden. Ermitteln Sie die durchschnittliche Intensität innerhalb des gesamten beleuchteten Bereichs.

Wählen Sie den Durchmesser groß genug, sodass die Intensitätswerte an der Peripherie denen des Kamerahintergrunds ähneln und die durchschnittliche Intensität des zentralen Bereichs messen. Dieser Bereich definiert den interessierenden Bereich, in dem später Mikroskopie-Experimente durchgeführt werden. Subtrahieren Sie nun den durchschnittlichen Wert der Hintergrundintensität von den Intensitäten des eliminierten und des zentralen Bereichs.

Multiplizieren Sie als Nächstes die hintergrundkorrigierten Intensitäten mit der entsprechenden Pixelzahl der Bereichsgröße, um integrierte Intensitäten zu erhalten. Stellen Sie die integrierte Intensität des beleuchteten Bereichs auf eins ein und berechnen Sie den Bruch für den zentralen Bereich. Die mit dem Leistungsmesser gemessene Leistung.

In unserem Fall sind fünf Milliwatt direkt proportional zur integrierten Intensität der gesamten beleuchteten Fläche. Multiplizieren Sie diesen Wert mit dem Trennschärfeanteil des zentralen Bereichs, um die Trennschärfe innerhalb des zentralen Bereichs zu bestimmen. In unserem Beispiel von 1,15 Milliwatt hängt der Faktor für die Umrechnung der Pixelanzahl in quadratische Mikrometer von der tatsächlichen Pixelgröße des Kamerachips und der Vergrößerung des Emissionspfads ab.

Er lässt sich leicht mit einem Mikrometerschlitten bestimmen. In unserem Beispiel entspricht die zentrale Fläche 170,8 Quadratmikrometern. Die Leistungsdichte bezieht sich auf die gemessene Leistung geteilt durch die Fläche und ergibt somit 1,15 Milliwatt geteilt durch 170,8 Quadratmikrometer oder 0,007 Milliwatt pro Quadratmikrometer.

Das sind 0,7 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Um die Fließfähigkeit der Doppelschicht zu bestimmen, führen wir ein Fluoreszenzerholungsexperiment nach dem Photobleaching of Wrap Experiment durch. Wie im Film unten links zu sehen ist, bilden wir die fluoreszierende Doppelschicht bei geringer Leistungsdichte ab.

Auf dem unteren rechten Film sehen Sie die entsprechende Labortechnik-Kammer auf dem Mikroskop. Anschließend bleichen wir einen kreisförmigen Bereich mit den kurzen Pulsen mit hoher Leistungsdichte und überwachen die Erholung bei niedriger Leistungsdichte. Auch hier gibt die Montage einen Überblick über das Experiment für verschiedene Zeitpunkte, wobei die Zeit Null die Bleichimpulse sind.

Wir quantifizieren die durchschnittliche hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensität innerhalb des Markierungskreises und normalisieren alle gemessenen Intensitäten auf die Intensität zu Beginn des Experiments. Vor den Bleichpulsen stellen wir die normalisierten Intensitätswerte gegen die Zeit dar. Der Sättigungswert stellt den mobilen Anteil dar, in unserem Fall über 90%Zuerst wird ein Bild der Doppelschicht bei geringer Anregungsleistungsdichte aufgenommen.

Wenn Sie beispielsweise einen optischen Dichtefilter mit einem logarithmischen Dämpfungswert von zwei platzieren, reduziert sich die Leistung um den Faktor 100. Die Belichtungszeit sollte während des gesamten Verfahrens konstant sein und ausreichen, um eine einzelne Fluidkraft bei der nicht abgeschwächten Leistungsdichte abzubilden, in unserem Fall 10 Millisekunden bei 0,7 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Verwenden Sie die Falschfarbendarstellung, um Bereiche unterschiedlicher Intensität hervorzuheben.

Wählen Sie einen Bereich von Interesse, in dem später Einzelmolekülmessungen durchgeführt werden, und einen Bereich derselben Größe. Berechnen Sie für die Hintergrundsubtraktion die subtrahierte integrierte Hintergrundintensität. Entfernen Sie nun den optischen Dichtefilter aus dem Anregungsstrahlengang, bleichen Sie den Bereich und nehmen Sie ein Bild auf.

Sie werden sehen, wie sich die individuelle Grippekraft im gebleichten Bereich ausbreitet. Einzelne Grippekräfte sind beugungsbegrenzt mit einem typischen Durchmesser von zwei bis drei Pixeln, nehmen einen Bereich von sieben mal sieben Pixeln um jedes einzelne Molekülsignal und den zweiten Bereich in der Nähe ein. Für die Hintergrundsubtraktion ist es wichtig, nur das Signal einer einzelnen Fluorkraft zu quantifizieren.

Daher ist es am besten, Proteine auf der BI-Schicht mit einem Verhältnis von weniger als eins zu Proteinen abzubilden oder für SAT-spezifisch markierte Proteine. Noch mehr Futter-Protein-Verhältnis von eins, wie in unserem Beispiel gezeigt, messen Sie die integrierten Intensitäten für beide Regionen und subtrahieren Sie den Hintergrund von dem Signal, das letzte beobachtete Ereignis in unserem Beispiel nicht zu nehmen, da das Bleichen wahrscheinlich während des Expositionsdurchschnitts aufgetreten ist. Die korrigierten Signale hier, wir tun dies für eine Vierergrippe, die wir über neun Bilder beobachten.

Dieses Verfahren sollte jedoch für mindestens mehrere hundert Einzelmolekülereignisse durchgeführt werden. Kehren wir zu unserem ursprünglichen Doppelschichtbild zurück, das bei abgeschwächter Anregungsleistungsdichte beobachtet wurde. Die Moleküldichte wird bestimmt, indem die integrierte Intensität des interessierenden Bereichs für eine niedrige Anregungsleistungsdichte durch Multiplikation mit hundert korrigiert und durch die durchschnittliche Einzelmolekülintensität und die Fläche dividiert wird.

Wir haben es mit einer Dichte von 421,4 Fluorkraft pro Quadratmikrometer zu tun. In unserem Beispiel entspricht dies bei einem Verhältnis von Nahrung zu Protein von eins der gleichen Anzahl von Molekülen pro Quadratmikrometer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, eine proteinfunktionalisierte Lipiddoppelschicht mit Hilfe der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten und zu charakterisieren.

Darüber hinaus sollten Sie mit den Grundprinzipien vertraut sein, um ein Standardmikroskop zu diesem Zweck zu modifizieren und aufzurüsten. Wir werden diese Methodik später verwenden, um die Bindungskinetik von doppelschichtgebundenem Antigen an zellgebundene T-Zell-Rezeptoren zu bestimmen, aber viele andere Anwendungen, die darauf basieren, sind sicherlich machbar.