Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Entwicklung bei Mäusen mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dies wird durch die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der Maus, dem Thymus und der Milz erreicht. In einem zweiten Schritt werden die Thymozyten und Zyten mit einem Cocktail aus Antikörpern gefärbt, um bestimmte Thy-Populationen zu identifizieren.

Letztendlich kann die Häufigkeit und Anzahl verschiedener Lymphozytenpopulationen durch durchflusszytometrische Analyse bewertet werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der T-Zell-Entwicklung zu beantworten, z. B. welche Gene und Signalwege wichtig sind, um ein funktionsfähiges und dennoch zelltolerantes T-Zell-Repertoire zu generieren. Diese Methode kann zwar Aufschluss über die Entwicklung von T-Zellen im Thymus geben, kann aber auch bei der Untersuchung der Entwicklung anderer Immunzellen angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten bei der Gestaltung ihrer Antikörpercocktails für die Durchflusszytometrie. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, legen Sie ein steriles Stahlgitter in eine 60 x 15 Millimeter große Petrischale. Geben Sie dann fünf Milliliter HBSS in die Schüssel und lagern Sie die Schale auf Eis, um den Thymus zu ernten.

Heben Sie zunächst mit einer Pinzette die untere Spitze des Brustbeins an und legen Sie das Zwerchfell frei. Vermeiden Sie dann die Leber, schneiden Sie das Zwerchfell durch, um den Brustkorb zu lösen, und schneiden Sie dann den Brustkorb auf jeder Seite nach oben auf. Achten Sie darauf, die Lunge und das Herz zu vermeiden.

Ziehe nun mit der Pinzette den Brustkorb vorsichtig zurück. Der Thymus ist ein weißes, zweilappiges Organ, das sich über dem Herzen befindet. Fassen Sie mit der flachen Kante der Pinzette die Unterseite der Lappen.

Ziehen Sie dann den Thymus vorsichtig heraus und legen Sie ihn auf eines der zuvor vorbereiteten Siebe. Um die Milz zu entnehmen, machen Sie einen Schnitt durch das Bauchfell, um die Bauchhöhle freizulegen. Die Milz ist ein rotes, surfbrettförmiges Organ, das sich auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus unterhalb der Leber befindet.

Ziehe dann mit einer Pinzette die Milz heraus und mit einer anderen das Bindegewebe weg. Legen Sie dann die präparierte Milz auf ein separates Gittersieb. Mahlen Sie nun mit dem Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze jedes Organ in sein Netzsieb, bis nur noch Bindegewebe und Fett übrig sind, pipettieren Sie die Zellen und das HBSS in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie dann jedes Netz mit frischem HBS S3 Mal aus. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 335 mal G und vier Grad Celsius. Nach dem Aspirieren des Überstandsresus werden die Zyten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 500 Mikrolitern eines CK-Lysepuffers suspendiert, während die Milz-roten Blutkörperchen aufgebahrt werden.

Suspendieren Sie die Thymozyten im Verhältnis von 20 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in Faxpuffer und legen Sie sie auf Eis beiseite. Fügen Sie nun fünf Milliliter HBSS hinzu, um die Zyten wieder in die Isotonität zu versetzen, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, und reansieren Sie das erythrozytenfreie Pellet bei 20 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter im Faxpuffer. Beginnen Sie diesen Schritt mit Ali Watting.

Viermal 10 bis zum Sechstel der reservierten THYMOZYTEN pro Durchflusszytometrie-Probe in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie als Nächstes Zyten zu den Vertiefungen einer 96-Well-Platte hinzu, um die Kompensationskontrolle zu ermöglichen. Blockieren Sie dann die FC-Rezeptoren in jeder der Zellproben durch Inkubation mit Anti-CD 1632 für 10 Minuten auf Eis.

Drehen Sie nun die Platte herunter und entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte einmal mit der Vorderseite nach unten in ein Waschbecken schnippen, dann jede Vertiefung in 200 Mikroliter Faxpuffer aufhängen und den Waschvorgang wiederholen. Als nächstes inkubieren Sie die experimentellen Proben mit 200 Mikrolitern Antikörpercocktail oder einzelnen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern für die Kompensationskontrollen. Alles im Faxpuffer auf Eis im Dunkeln.

Nach 30 Minuten waschen Sie die Zellen zweimal mit Faxpuffer und übertragen Sie die Proben nach der Wiederbelebung in Faxpuffer auf Faxröhrchen in physiologischen TCR-transgenen Modellen und Wildtyp-Mäusen. Die positive Selektion beginnt in der doppelt positiven hellen Phase, bevor sie in die doppelt positive matte Phase übergeht. Nach dem Antigentreffen auf die doppelt positiven dumpfen Thymozyten, dann treten Sie in ein Übergangsstadium von CD vier positiven CD acht niedrigen Stadiums ein, bevor es zu CD vier wird.

Einzelne positive oder CD acht einfach positive Thymozyten reifen einfach positive Thymozyten zeichnen sich durch ihre hohe TCR-Expression und den Verlust von CD 24 aus. Während das Profil von CD acht bis CD vier Fehler in der positiven Selektion aufdecken kann, kann die Untersuchung von TCR beta durch CD 69 oder CD fünf weitere Erkenntnisse darüber liefern, wo der Defekt liegt. Sowohl CD 69 als auch CD 5 sind nach TCR-Stimulation hochreguliert, wobei stärkere Wechselwirkungen zu einer höheren Expression dieser Marker führen.

In diesem TCR beta by CD 69-Plot in einer Wildtyp-Maus repräsentiert der TCR R beta niedrige CD 69 negative Gang eine Population von doppelt positiven Thymozyten vor der Selektion. Während dieser TCR-Beta-Intermediär-CD 69-positive Gang eine Übergangspopulation direkt nach der TCR-Intervention darstellt und aus doppelt positiven, hellen mit einigen doppelt positiven dumpfen und vier positiven CD und acht niedrigen Zellen besteht. Hier veranschaulicht der TCR R beta high CD 69 positive Gang die Population von Zellen direkt nach der positiven Selektion, die aus doppelt positiven stumpfen CD vier positiven, CD acht niedrigen und CD vier einfach positiven Zellen bestehen.

Schließlich zeigt dieser TCR-Beta-hohe CD 69-negative Gang eine reifere Zellpopulation, die hauptsächlich aus CD vier und CD acht einzelnen positiven Zellen besteht. Das Fehlen der TCR-R-beta-Intermediär-CD 69-positiven und der TCR-R-beta-hohen CD 69-positiven Populationen könnte auf beeinträchtigte positive Selektionsänderungen im Verhältnis der CD 4 einfach positiv zu CD acht hinweisen. Einzelne positive Zellen innerhalb der TCR-beta-Population mit hohem CD-69-Gehalt können auf Veränderungen in der Linienbindung hindeuten.

Der Verlust der TCR-beta-hohen CD 69-positiven und der TCR-beta-hohen CD 69-negativen Populationen könnte auf Überlebensprobleme nach positiver Selektion zurückzuführen sein. Die Untersuchung von TCR beta nach CD 5 ist eine weitere Strategie, um Populationen vor und nach positiver Selektion zu identifizieren. Diese ersten beiden Populationen bestehen hauptsächlich aus doppelt positiven hellen Thymozyten.

Die TCR-beta-Population mit niedriger CD fünf repräsentiert doppelt positive Thymozyten vor der Selektion, und die TCR-beta-Intermediate-CD fünf-Population besteht aus den Zellen, die die positive Selektion initiieren. Eine gestörte Generierung dieser oder der vorherigen Population deutet auf eine fehlerhafte positive Selektion hin. Die TCR R beta-Intermediate CD fünf hohe Population stellt jedoch Thymozyten dar, die sich im Prozess der positiven Selektion befinden und hauptsächlich aus doppelt positiven, dumpfen und CD vier positiven Thymozyten bestehen.

CD acht niedrige Thymozyten. Die TCR beta high CD five high Population besteht hauptsächlich aus postpositiver Selektion. Einfach-positive Thymozyten verändern sich im Verhältnis von Zöliakie vier, einfach positiv zu Zöliakie acht.

Einzelne positive Zellen innerhalb dieser Population, trotz normaler Vorpopulationen, können auf Veränderungen in der Abstammungsbindung hindeuten. Darüber hinaus kann das Fehlen dieser Population auf ein vermindertes Überleben von Thymozyten nach positiver Selektion hinweisen, da die negative Selektion die Deletion kleiner antigenspezifischer Populationen beinhaltet. Defekte in diesem Prozess lassen sich am besten anhand von TCR-transgenen Mäusen in HY CD beobachten: Vier Mäuse, die den transgenen H-Y-T-C-R exprimieren, können mit dem monoklonalen Antikörper T 3.7 nachgewiesen werden.

Das H-Y-T-C-R erkennt das männliche spezifische HY-Antigen, das in MHC Klasse eins db präsentiert wird. Somit durchlaufen HY CD vier männliche Mäuse eine negative Selektion von H-Y-T-C-R-positiven Thymozyten, was durch eine Verringerung der doppelt positiven Thymozytenzahlen von T um drei Komma 70 und eine dramatischere Abnahme von T 3,7 positiven CD 8, einfach positiven Thyozytenzahlen angezeigt wird. Im Gegensatz dazu durchlaufen HY CD vier weibliche Mäuse eine positive Selektion, um T 3,7 positive CD acht einzelne positive T-Zellen zu erzeugen.

Während eine Verringerung der doppelt positiven Thy-Zahlen auf eine negative Selektion hinweist, ist das Fehlen von antigenspezifischen einfach positiven Thymozyten das genaueste Maß. Eine weitere Untersuchung der wenigen T, drei Punkt 70 positiven CD acht einfach positiven Thymozyten in HY CD vier männlichen Mäusen zeigt, dass es sich bei den meisten um CD 24 hochunreife Zellen handelt. Während die meisten T drei Komma 70 positiven CD acht einfach positive Thymozyten bei den HY CD vier Weibchen die Reife erreicht haben und CD 24 niedrig sind, was eine weitere Unterstützung bietet, tritt diese negative Selektion bei HY CD vier männlichen Mäusen auf.

Ein Nachteil der transgenen TCR-Modelle besteht darin, dass es schwierig ist, die positive Selektion weiter zu charakterisieren, indem Populationen basierend auf TCR und CD 69 oder CD 5-Expression identifiziert werden, da die TCR-Expression während der gesamten CYTE-Entwicklung hoch ist. HY CD vier weibliche Mäuse haben eine große Population von T drei Komma 70 positiven doppelt positiven Thymozyten, die eine positive Selektion durchlaufen. Wie die Zunahme der CD-69-positiven Population im Vergleich zum Wildtyp zeigt, ist die negative Selektion mit einem höheren Affinitäts-TCR-Stimulus verbunden als die positive Selektion. Dies zeigt sich in einer höheren Expression von CD 69 auf T drei Komma 70 positiven doppelt positiven Thymozyten in HY CD vier männlichen Mäusen, was zu einer Verschiebung des Histogramm-Peaks nach rechts führt.

Ähnliche Trends werden bei der Expression von Zöliakie fünf bei der Analyse der Thymusselektion in genetisch manipulierten Mäusen beobachtet. Die Untersuchung der Expression von CD 69 oder CD 5 kann feststellen, ob der Defekt auf die TCR-Signalübertragung zurückzuführen ist oder auf ein nachgeschaltetes Ergebnis der TCR-Stimulation zurückzuführen ist. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in zweieinhalb Stunden für die Zellvorbereitung und Färbung durchgeführt werden, plus eine weitere Stunde für die Datenerfassung auf dem Durchflusszytometer.

Bei korrekter Ausführung fügt jede zusätzliche Maus ca. 30 Minuten hinzu. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, an einen schonenden Umgang mit den Thymozyten zu denken und sicherzustellen, dass Sie die Färbestrategie im Voraus geplant haben. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Assays wie Tötungsassays oder Zytokinproduktionsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die exportierten Thymozyten ordnungsgemäß funktionieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Entwicklung der Thymusstelle mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert.