Name: Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse der T-Zellentwicklung im Thymus genetisch veränderter Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung lymphatischer Zellpopulationen und wichtiger Signalwege.

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Die Autoren bedanken sich bei Bing Zhang für seine technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute for Health Research (MOP-86595) finanziert. TAB ist eine CIHR New Investigator und AHFMR Scholar. Doctoral und einem AIHS Vollzeit Studentship - QH wird durch eine CIHR Canada Graduate Scholarship unterstützt. SAN wird von einer Königin Elizabeth II Graduate Scholarship unterstützt. Doctoral - AYWS wird durch ein NSERC Postgraduate-Stipendium unterstützt.

Siehe Abbildung 1 für eine allgemeine Regelung des experimentellen Protokolls Abbildung. Ein. Präparation <ol><li> Ort sterile Stahlgitter Bildschirm in 60 x 15 mm Petrischale. Eine Einheit wird pro Gewebeprobe nötig. </li><li> 5 ml balanced salt Hank-Lösung (HBSS) zu jedem Gericht. Halten Sie Speisen auf dem Eis. </li><li> Einschläfern Mäuse mit CO 2. </li><li> Sichere Maus Dissektion Oberfläche Bauchseite nach oben. Spray-Maus mit 70% Ethanol für die Sterilisation und sicherzustellen, dass das Fell verfilzt wird unten. </li><li> Verwendung von chirurgischen Schere, beginnen Dissektion indem ein Einschnitt in der ventralen Bauchhaut knapp oberhalb der Genitalien. Verlängern Sie die Inzision nach oben bis zum Kinn. </li><li> Von der Mittellinie, verlängern die Inzision entlang aller Glieder. Ziehen Sie die lose Haut und stecken Sie es bis zur Dissektion Oberfläche. </li><li> Ernten Sie die Thymus: <ol><li> Heben Sie die untere Spitze des Brustbeins, um einen Schnitt zu machen.</li><li> Die Vermeidung der Leber, senken die Membran an den Brustkorb zu lösen und dann geschnitten den Brustkorb zu jeder Seite. Schneiden Sie die Brustkorb nach oben auf jeder Seite, kümmert sich um die Lunge und des Herzens zu vermeiden. </li><li> Ziehen der Brustkorb wieder mit einer Pinzette. Der Thymus ist ein weißes, bilobed Organ oberhalb des Herzens. Mit dem flachen Rand der Zange, um die Unterseite der Flügel zu erfassen, ziehen Sie den Thymus und legen Sie es auf dem Sieb. </li></ol></li><li> Ernten die Milz: <ol><li> Die Milz ist ein roter, Surfboard-förmige Organ auf der linken Seite der Maus der Bauchhöhle, unterhalb der Leber entfernt. </li><li> Einen Einschnitt in die Bauchhöhle. Ziehen Sie vorsichtig die Milz mit einer Pinzette, mit dem zweiten Paar zu necken sich Bindegewebe. Legen Sie die Milz auf einem separaten Sieb. </li></ol></li></ol> 2. Cell Preparation <ol><li> Verwendung eines Kolbens aus einer 3-ml-Spritze, schleifenOrgane in den Sieb, bis nur Bindegewebe und Fett bleibt. Spülen Mesh mit HBSS aus der Schale dreimal. Verwenden Sie einen neuen Kolben für jede Gewebeprobe. <ol><li> Andere Möglichkeiten zur Homogenisierung Gewebe kann anstelle dieses Verfahren verwendet werden. </li></ol></li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 335 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Splenozyten resuspendieren in 500 ul ACK-Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) für 10 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Thymozyten bei 20 x 10 6 Zellen / ml in FACS-Puffer (PBS, 1% FCS, 0,02% Natriumazid) und beiseite stellen auf Eis. </li><li> Splenozyten zurückzukehren, um Isotonie durch Zugabe von 5 ml HBSS. Pellet Splenozyten durch Zentrifugieren und Resuspendieren bei 20 x 10 6 Zellen / ml in FACS-Puffer. Wenn Zellen steril bleiben müssen, können Sie sterilem RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.Färbung Cells für die Durchflusszytometrie Der Zweck dieses Protokolls ist es, Strategien für die Analyse der positiven und negativen Selektion mit Wildtyp (WT) und HY cd4 Mäusen zu skizzieren. Für allgemeine Überlegungen zur Durchflusszytometrie experimentelles Design, Beschaffung und Analyse verweisen wir die Leserschaft auf eine ausgezeichnete Bewertung von Tung et al. 11 <ol><li> Aliquot 4 x 10 6 pro Thymozyten Durchflußcytometrieprobe zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte, sowie 1 x 10 6 Splenozyten WT pro Kompensationssteuerung. Bei der Verwendung von transgenen Mäusen, sollten Sie einen WT-Maus als Kontrolle in den Test einbezogen werden. </li><li> Fc-Rezeptoren blockieren, durch Inkubieren von Zellen mit anti-CD16/32 (Klon 2.4G2) für 10 min auf Eis. </li><li> Drallplatte bei 335 × g bei 4 ° C für 5 min. Deckel entfernen und zu zerstreuen Flüssigkeit sorgfältig durch Ausklopfen der Platte einmal nach unten in einer Senke. Resuspendieren jedes Well in 200 ul FACS Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Bereiten Antikörper Cocktails wie unten aufgeführt, über die optimale Konzentration jedes Antikörpers zur Verdünnung in 200 ul FACS-Puffer pro well basiert. Die optimale Konzentration der einzelnen Antikörper wird als die niedrigste Konzentration benötigt wird, um die größte Trennung von positiven und negativen Populationen geben definiert. Wenn es keinen negativen Population für einen gegebenen Antikörper, sollte ein Isotyp-Antikörper enthalten sein. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung können verkleinert werden (zB zu 100 ul pro Well), falls gewünscht. <ol><li> WT Thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24 </li><li> HY cd4 Thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24 Um eine bessere Trennung von CD69 und CD69 lo hallo Populationen in Thymocyten zu erhalten, wird empfohlen, dass ein biotinylierter anti-CD69 primärer Antikörper verwendet werden, gefolgt von einem sekundären Fleck enthält Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin. Wir use die gleiche Strategie für CD5 Färbung. </li></ol></li><li> Inkubieren von Zellen mit 200 ul Antikörper-Cocktail in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln. </li><li> Zeitgleich mit Antikörper-Cocktail Färbung, färben jede Entschädigung Steuerung mit einer einzigen Fluorochrom konjugierte Antikörper. Im Idealfall beinhaltet Entschädigung Färbung die gleichen Antikörper wie in der Antikörper-Cocktail verwendet. Allerdings kann Färbung für jedes einzelne Antigen nicht machbar sein für größere Experimente, wenn viele Antigene untersucht wird. Daher wird Anfärben für entweder Anti-CD4-oder Anti-CD8 empfohlen aufgrund hoher Expression dieser Antigene, oder die Verwendung von Kompensation Kügelchen. Färben in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln. Lassen Sie eine Ausgleichsregelung ungefärbt. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit FACS-Puffer. </li><li> Die Zellen in FACS-Puffer und Transfer zum FACS-Röhrchen. </li><li> Erwerben Proben auf Durchflusszytometer. Beinhalten den Erwerb von FSC-A-und FSC-W einllow für Dublett Diskriminierung. </li></ol> 4. Analyse der Durchflusszytometrie Data - Non-TCR transgenen Mäusen Wir verwenden FlowJo für die Durchflusszytometrie Datenanalyse. Siehe 2A für die Gating-Strategie für nicht-TCR transgenen Mäusen Abbildung. <ol><li> Mit FSC-A von SSC, elektronisch Tor auf der &quot;Lymphozyten&quot; Bevölkerung. </li><li> Im Rahmen der &quot;Lymphozyten&quot; Bevölkerung, verwenden FSC-A von FSC-W elektronisch Tor des FSC-W lo Bevölkerung zu Zelle Dubletten und aggregrates auszuschließen. Dies ist die &quot;Singulett&quot; Tor. </li><li> Mit den Veranstaltungen in der &quot;Singulett&quot; Tor, Grundstück CD8 von CD4. Zeichnen Tore für DN, DP langweilig, DP hell, CD4 + CD8 lo, CD4SP und CD8SP Populationen wie in 2B dargestellt. </li><li> Unter dem CD4SP und CD8SP Tore, erstellen TCRβ von CD24 Plots. Verwenden Sie den Quadranten Gating-Tool zu Toren zu ziehen wie in 2C dargestellt. </li><li> Erstellen Sie eine new Plot aus der &quot;Singulett&quot; Tor: TCRβ von CD69. Zeichnen Gatter A, B, C, D wie in 2D dargestellt. </li><li> Erstellen Sie ein weiteres Grundstück von der &quot;Singulett&quot; Tor: TCRβ von CD5. Zeichnen Gatter i, ii, iii, iv, wie in 2E dargestellt ist. Dies ist eine weitere Strategie zur Untersuchung positive Selektion. </li><li> Bewerben DN, DP langweilig, DP hell, CD4 int, CD4SP und CD8SP Toren unter &quot;Singulett&quot; zu Toren i, ii, iii, iv, A, B, C, D (2D, E). </li><li> Berechnen Sie die Anzahl der Zellen in einer bestimmten Untergruppe durch Multiplikation Orgel Zellularität durch die Häufigkeit der einzelnen nachfolgenden Tor, bis Sie Ihre Zielgruppe erreichen. Zum Beispiel kann die Anzahl der TCRβ hallo CD69-CD8SP Thymozyten würde durch Thymus Zellularität x% TCR bhi bestimmt werden CD69-(Fraktion D) x% CD8SP. <ol><li> Zählen berücksichtigt bereits die lebenden und toten Zellen also nicht auch die &quot;lymphocYTE &quot;Tor in Ihren Berechnungen. </li></ol></li></ol> 5. Analyse der Durchflusszytometrie Data - TCR transgenen Mäusen Siehe 3A für die Gating-Strategie für TCR transgenen Mäusen Abbildung. <ol><li> Folgen Sie den Schritten 4,1 und 4,2, wie im vorherigen Abschnitt. </li><li> Unter dem &quot;Singulett&quot; Tor, eine T3.70 von SSC Plot und Tor auf der T3.70 + Zellpopulation Antigen-spezifischen T-Zellen (3B) zu analysieren. In manchen Fällen kann es von Interesse sein, diese Bevölkerung zu dem nicht antigenspezifischen (T3.70-) T-Zell-Population zu vergleichen. </li><li> Innerhalb der T3.70 + Bevölkerung, draw DN, DP, CD4SP und CD8SP Tore (3C). <ol><li> Für WT Kontrollproben, zeichnen diese Tore unter dem &quot;Singulett&quot; Tor oder eine T3.70-Gate, da nur sehr wenige T3.70 +-Zellen sein wird. </li></ol></li><li> Unter dem CD8SP Tor, erstellen Sie eineT3.70 von CD24 Grundstück. Verwenden des Quadranten Gating Werkzeug, um Zellen in vier Populationen (3F) zu unterteilen. </li><li> Neu überlagerte Histogramm, welches die CD69-Expression in den DP-Kompartiment von WT-Mäusen und T3.70 + DP Abteil HY cd4 Mäusen (4A). Wiederholen Sie den Vorgang CD5 Expression (4B) zu untersuchen. </li><li> Berechnen der absoluten Anzahl von Zellen in jeder Untergruppe von Interesse, wie in 4.8. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Protokoll kann verwendet werden, um positive und negative Selektion in nicht-transgenen und TCR TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Färbung von Oberflächen-Antigenen. Für die weitere Analyse der molekularen Mechanismen, ist es oft notwendig, intrazelluläre Färbung führen. Wir verwenden die BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit für die meisten intrazellulären Proteinen und der BD Biosciences Foxp3 Staining Kit für Transkriptionsfaktoren. Wir in der Regel erwerben u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> HyClone Hanks balanced salt solution </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Drahtgewebeelementen </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzen (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Konischen Röhren (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss - Primo Star </td><td> 415.500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> HausserWissenschaftlich </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platte </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Mehrkanalpipette </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Kälberserum </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> IT Baker Chemical Co. </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcR Blockierungsreagenz </td><td></td><td></td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-YY * </td><td> Clone T3.70 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-YY * </td><td> Clone RM4-5 </td></tr><tr><td> Anti-Maus CD8a </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-YY * </td><td> Clone 53-6,7 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-YY * </td><td> Clone M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-YY * </td><td> Clone H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD69 Biotinylierte </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-YY * </td><td> Clone H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD5 Biotinylierte </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-YY * </td><td> Clone 53-7,3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-YY * </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS-Röhrchen </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometrie-Analyse-Software </td><td> TreeStar - FlowJo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX variiert je nach Fluorochrom und YY variiert je nach Gefäß Größe. </td></tr></tbody></table>

prüfung thymic positive und negative selektion mittels durchflusszytometrie

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Ein gesundes Immunsystem verlangt, dass T-Zellen fremde Antigene reagieren, während verbleibenden tolerant gegenüber Selbst-Antigenen. Random Umlagerung der T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β loci erzeugt eine T-Zell-Repertoire mit riesigen Vielfalt in Antigenspezifität, sowohl sich selbst als auch ausländische. Auswahl des Repertoires während der Entwicklung im Thymus ist kritisch für die Erzeugung und sichere nützlich T-Zellen. Defekte im Thymus Auswahl zur Entwicklung von Autoimmun-und Immunschwäche-Erkrankungen 1-4. T-Zell-Vorläufer geben den Thymus als doppelt negative (DN) Thymozyten, die nicht exprimieren CD4 oder CD8 Co-Rezeptoren. Expression des αβTCR und beide Co-Rezeptoren tritt bei der doppelt positiven (DP) Bühne. Interaktion des αβTCR mit Selbst-Peptid-MHC (pMHC) durch Thymus-Zellen präsentiert bestimmt das Schicksal der DP Thymozyten. Hochaffine Wechselwirkungen zu negativen Selektion und Eliminierung führention von selbst-reaktiven Thymozyten. Low Affinitätswechselwirkungen Ergebnis in positiver Selektion und Entwicklung von CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) T-Zellen in der Lage zu erkennen fremde Antigene durch Selbst-MHC 5 dargestellt. Positive Selektion kann in Mäusen mit einem polyklonalen (Wildtyp) TCR Repertoires werden durch Beobachten der Erzeugung von reifen T-Zellen untersucht. Sie sind jedoch nicht ideal für das Studium der negativen Selektion, die Deletion von antigenspezifischen kleinen Populationen umfasst. Viele Modellsysteme verwendet worden, um negative Selektion zu studieren, aber variieren in ihrer Fähigkeit zu rekapitulieren physiologische Ereignisse 6. Zum Beispiel in-vitro-Stimulation von Thymozyten fehlt die Thymus-Umgebung, die innig in Auswahl beteiligt ist, während Verabreichung von exogenen Antigens an nicht-spezifische Deletion von Thymozyten 7-9 führen kann. Derzeit sind die besten Werkzeuge für die Untersuchung in vivo negative Selektion Mäuse, die eine transg ausdrückenenic TCR spezifisch für endogene Selbst-Antigen. Allerdings sind viele klassischen TCR-transgene Modelle von vorzeitigem Expression des transgenen TCRα Kette am DN Stufe dadurch, was zu einem vorzeitigen negative Selektion. Unser Labor hat den HY cd4 Modell, bei dem der transgene HY TCRα bedingt am DP Stufe exprimiert wird entwickelt, wodurch negative Selektion während der DP bis SP Übergang auftreten wie dies bei Wildtyp-Mäusen 10. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll zum Thymus positive und negative Selektion in der HY cd4 Mausmodell zu untersuchen. Während negative Auswahl HY cd4 Mäusen ist höchst physiologischen können diese Verfahren auch auf andere TCR-transgene Modelle angewendet werden. Wir werden außerdem allgemeine Strategien zur Analyse positive Selektion in einem polyklonalen Repertoire für alle genetisch manipulierten Mäusen.

In physiologischen TCR transgene Modelle und WT Mäusen, beginnt positive Selektion an der DP hellen Bühne, bevor er in den DP langweilig Stufe nach Antigen Begegnung. DP langweilig Thymozyten und geben Sie dann eine Übergangsregelung CD4 + CD8 lo Bühne, bevor er CD4SP oder CD8SP Thymozyten (Abbildung 2B). Mature SP Thymozyten zeichnen sich durch hohe TCR-Expression und den Verlust von CD24 (2C) gekennzeichnet. Während die CD8 durch ...

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu untersuchen<em&gt; In vivo</em&gt; Mit genetisch manipulierten Mäusen auf einer Wildtyp-oder T-Zell-Rezeptor transgenen Hintergrund.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Ein gesundes Immunsystem erfordert, dass T-Zellen auf fremde Antigene reagieren, während sie gleichzeitig tolerant gegenüber Selbstantigenen bleiben. Die zufällige Umlagerung der T-Zell...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Entwicklung im Thymus von Mäusen mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Einzelzell-Suspensionen aus dem Thymus und der Milz der Maus hergestellt werden. In einem zweiten Schritt werden die Thymozyten und Zellen mit einem Antikörper-Cocktail gefärbt, um spezifische Thymus-Populationen zu identifizieren.Schließlich kann die Frequenz und Anzahl verschiedener Lymphozytenpopulationen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur T-Zell-Entwicklung zu beantworten, beispielsweise, welche Gene und Signalwege wichtig sind, um ein funktionelles, aber dennoch zelltolerantes T-Zell-Repertoire zu erzeugen. Obwohl diese Methode Einblicke in die T-Zell-Entwicklung im Thymus ermöglicht, kann sie auch bei der Untersuchung der Entwicklung anderer Immunzellen angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Konzeption ihrer Antikörpermischungen für die Durchflusszytometrie. Vor Beginn der Dissektion eine sterile Stahlsiebfläche in eine 60 mal 15 Millimeter große Petrischale geben. Anschließend fünf Milliliter HBSS zur Schale hinzufügen und die Schale zur Gewinnung des Thymus auf Eis lagern.Zunächst heben Sie mit einer Pinzette die untere Spitze des Brustbeins an, um das Zwerchfell freizulegen. Danach schneiden Sie, die Leber vermeidend, das Zwerchfell durch, um den Rippenkorb zu lösen, und schneiden anschließend den Rippenkorb beidseits nach oben hin durch. Achten Sie dabei darauf, Lunge und Herz zu schonen.Verwenden Sie nun die Pinzette, um den Rippenkorb vorsichtig nach hinten zu ziehen. Der Thymus ist ein weißes, zweilappiges Organ, das sich oberhalb des Herzens befindet. Benutzen Sie die flache Kante der Pinzette, um den unteren Teil der Lappen zu erfassen.Ziehen Sie dann vorsichtig den Thymus heraus und legen Sie ihn auf eines der zuvor vorbereiteten Siebträger. Um die Milz zu entnehmen, führen Sie einen Schnitt durch das Peritoneum durch, um die Bauchhöhle freizulegen. Die Milz ist ein rot gefärbtes, surfbrettförmiges Organ, das sich auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus unterhalb der Leber befindet.Verwenden Sie dann ein Paar Pinzetten, um die Milz herauszuziehen, und ein weiteres Paar, um das Bindegewebe vorsichtig zu lösen. Legen Sie die präparierte Milz anschließend auf einen separaten Netzfilter. Benutzen Sie nun den Kolben einer Dreimilliliter-Spritze, um jedes Organ auf dem Netzfilter zu zerkleinern, bis nur noch Bindegewebe und Fett zurückbleiben. Pipettieren Sie die Zellen und HBSS in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.Anschließend jede Membran dreimal mit frischem HBS S3 spülen. Danach die Zellen fünf Minuten bei 335 × g und 4 °C pelletieren. Nach dem Absaugen des Überstandes die Zellen in 500 µL eines CK-Lysepuffers suspendieren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während die erythrozytären Zellen der Milz lysiert werden.Suspendieren Sie die Thymozyten bei 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Fax-Puffer und stellen Sie sie auf Eis. Geben Sie nun fünf Milliliter HBSS zu, um nach dem erneuten Zentrifugieren die Zellen wieder in einen isotonischen Zustand zu bringen; resuspendieren Sie das erythrozytenfreie Pellet bei 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Fax-Puffer. Beginnen Sie diesen Schritt mit Ali Watting.Viermal 10 hoch 6 der reservierten THYMOCYTEN pro Durchflusszytometrie-Probe in jedes Brunnen einer 96-Loch-Platte geben. Danach Zellen in die Brunnen einer 96-Loch-Platte für Kompensationskontrollen geben. Anschließend blockieren Sie die FC-Rezeptoren in jeder der Zellproben durch Inkubation mit Anti-CD-1632 für 10 Minuten auf Eis.Zentrifugieren Sie nun die Platte und entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte einmal mit der Öffnung nach unten in ein Spülbecken klopfen. Suspendieren Sie anschließend jede Vertiefung erneut in 200 µL Fax-Puffer und wiederholen Sie die Waschung. Danach inkubieren Sie die experimentellen Proben mit 200 µL Antikörper-Cocktail oder einzelnen mit Fluorochrom konjugierten Antikörpern für die Kompensationskontrollen, jeweils in Fax-Puffer auf Eis im Dunkeln.Nach 30 Minuten die Zellen zweimal mit Fax-Puffer waschen und anschließend, nach dem erneuten Aufschwemmen der Zellen in Fax-Puffer, die Proben in Fax-Röhrchen in physiologischen TCR-transgenen Modellen und Wildtyp-Mäusen überführen. Die positive Selektion setzt im doppelt positiven hellen Stadium ein, bevor sie in das doppelt positive schwache Stadium übergeht. Nach dem Kontakt mit dem Antigen treten die doppelt positiven schwachen Thymozyten in ein Übergangsstadium mit CD4-positiv und CD8-schwach ein, bevor sie CD4-positiv werden.Einzelne positive oder CD8-einzelpositive Thymozyten reife einzigartige positive Thymozyten zeichnen sich durch ihre hohe TCR-Expression und den Verlust von CD24 aus. Während das CD8-zu-CD4-Verhältnis Defekte in der positiven Selektion aufzeigen kann, ermöglicht die Untersuchung von TCR-Beta zu CD69 oder CD5 weitere Einblicke in die Lokalisation des Defekts. Sowohl CD69 als auch CD5 werden nach TCR-Stimulation hochreguliert, wobei stärkere Interaktionen eine höhere Expression dieser Marker hervorrufen.In diesem TCR-Beta-über-CD69-Diagramm einer Wildtyp-Maus repräsentiert das TCRβ-low-CD69-negative Tor eine Population von präselektierten doppelt positiven Thymozyten. Hingegen stellt das TCRβ-intermediäre CD69-positive Tor eine Übergangspopulation direkt nach der TCR-Aktivierung dar und besteht aus doppelt positiven hellen Zellen sowie einigen doppelt positiven schwachen und CD4-positiven CD8-niedrigen Zellen. Hier veranschaulicht das TCRβ-hohe CD69-positive Tor die Population der Zellen unmittelbar nach der positiven Selektion, die aus doppelt positiven schwachen, CD4-positiven, CD8-niedrigen sowie CD4-einfach positiven Zellen besteht.Schließlich weist dieses TCR-beta-hohe, CD69-negative Profil eine reifere Zellpopulation auf, die hauptsächlich aus CD4- und CD8-einfach positiven Zellen besteht. Das Fehlen der TCR-beta-intermediären, CD69-positiven sowie der TCR-beta-hohen, CD69-positiven Populationen kann auf eine beeinträchtigte positive Selektion hinweisen. Veränderungen im Verhältnis der CD4-einfach positiven zu den CD8-einfach positiven Zellen innerhalb der TCR-beta-hohen, CD69-negativen Population könnten auf eine veränderte Linienentscheidung hindeuten.Der Verlust der TCR-beta-hoch-CD69-positiven und der TCR-beta-hoch-CD69-negativen Populationen könnte auf Überlebensprobleme nach der positiven Selektion hinweisen. Die Untersuchung von TCR-beta mittels CD5 ist eine weitere Strategie, um Populationen vor und nach der positiven Selektion zu identifizieren. Diese ersten beiden Populationen bestehen hauptsächlich aus doppelt positiven, hellen Thymozyten.Die Population mit niedrigem TCR-Beta und niedrigem CD5 repräsentiert präselektierte doppelt positive Thymozyten, und die Population mit intermediärem TCR-Beta und intermediärem CD5 setzt sich aus Zellen zusammen, die die positive Selektion einleiten. Eine beeinträchtigte Bildung dieser oder der vorherigen Population deutet auf eine defekte positive Selektion hin. Die Population mit intermediärem TCR-Beta und hohem CD5 repräsentiert dagegen Thymozyten, die sich gerade in der positiven Selektion befinden, und besteht hauptsächlich aus doppelt positiven abgeschwächten und CD4-positiven Zellen.CD8-low-Thymozyten. Die TCRβ-hoch-CD5-hoch-Population besteht hauptsächlich aus post-positiver Selektion durchlaufenen Einzel-positiven Thymozyten. Veränderungen im Verhältnis von CD4-Einzel-positiv zu CD8.Einzeln positive Zellen innerhalb dieser Population können trotz normaler vorangehender Populationen auf Veränderungen in der Linienkommitierung hindeuten. Außerdem kann das Fehlen dieser Population auf ein vermindertes Überleben von Thymozyten nach der positiven Selektion hindeuten, da die negative Selektion den Verlust kleiner, antigenspezifischer Populationen beinhaltet. Defekte in diesem Prozess lassen sich am besten an T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen beobachten; in HY-CD4-Mäusen können Thymozyten, die den transgenen H-Y-TCR exprimieren, mit dem monoklonalen Antikörper T3.7 nachgewiesen werden.Der H-Y-T-C-R erkennt das männlichkeitsspezifische HY-Antigen, das im MHC-Klasse-I-Molekül db präsentiert wird. Daher unterliegen HY-CD4-positive männliche Mäuse einer negativen Selektion von H-Y-T-C-R-positiven Thymozyten, was sich in einer Verringerung der Anzahl von T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten und einem noch stärkeren Rückgang der T3.7-positiven CD8-einfach positiven Thymozytenzahlen zeigt. Im Gegensatz dazu durchlaufen HY-CD4-positive weibliche Mäuse eine positive Selektion, um T3.7-positive CD8-einfach positive T-Zellen zu bilden.Während eine Verringerung der doppelt positiven Thymozytenzahlen auf eine negative Selektion hinweist, ist das Fehlen antigenspezifischer einzeln positiver Thymozyten das genaueste Maß. Eine genauere Untersuchung der wenigen T3.70-positiven CD8-einzelpositiven Thymozyten in HY-CD4-männlichen Mäusen zeigt, dass die meisten CD24-hoch-exprimierende unreife Zellen sind. Im Gegensatz dazu haben die meisten T3.70-positiven CD8-einzelpositiven Thymozyten in HY-CD4-weiblichen Mäusen die Reife erreicht und weisen einen niedrigen CD24-Spiegel auf, was weiterhin dafür spricht, dass eine negative Selektion in HY-CD4-männlichen Mäusen stattfindet.Ein Nachteil der TCR-transgenen Modelle ist, dass es aufgrund der hohen TCR-Expression während der gesamten Thymozytenentwicklung schwierig ist, die positive Selektion weiter zu charakterisieren, indem Populationen anhand der Expression von TCR und CD69 oder CD5 identifiziert werden. HY-CD4-weibliche Mäuse weisen eine große Population von T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten auf, die einer positiven Selektion unterliegen. Dies zeigt sich in einer Zunahme der CD69-positiven Population im Vergleich zum Wildtyp. Die negative Selektion erfordert einen TCR-Reiz höherer Affinität als die positive Selektion. Dies wird durch eine stärkere Expression von CD69 auf T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten bei HY-CD4-männlichen Mäusen angezeigt, was zu einer Verschiebung des Histogramm-Gipfels nach rechts führt.Ähnliche Trends zeigen sich bei der Analyse der thymischen Selektion in genetisch veränderten Mäusen hinsichtlich der Expression von CD five. Die Untersuchung der Expression von CD 69 oder CD five kann Aufschluss darüber geben, ob der Defekt in der TCR-Signalübertragung oder in einer downstream liegenden Folge der TCR-Stimulation begründet ist. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie in zweieinhalb Stunden für die Zellpräparation und Färbung sowie zusätzliche eine Stunde für die Datenerfassung am Durchflusszytometer durchgeführt werden.Wenn korrekt durchgeführt, verlängert jede zusätzliche Maus das Verfahren um etwa 30 Minuten. Während des Arbeitens ist es wichtig, die Thymozyten vorsichtig zu behandeln und sicherzustellen, dass die Färbestrategie im Voraus geplant wurde. Befolgen Sie dieses Verfahren.Andere Tests wie Abtötungsassays oder Zytokinproduktionsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die exportierten Thymozyten ordnungsgemäß funktionieren. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Entwicklung der Thymuslokalisation mittels Durchflusszytometrie analysiert werden kann.

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik, bei der zwei Fluorochrome verwendet werden, um CD4+ und CD8+ T-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und Monozyten in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu identifizieren. Nach der Inkubation der Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker werden die Zelluntergruppen mit einer optimalen durchflusszytometrischen Gating-Strategie...

Ein Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung von Immunzelluntergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Hier, ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von CD4+ T-Zelle Teilmengen aus menschlichen peripheren Blut wird beschrieben. CD4 gereinigt+ T-Zellen werden analysiert, indem Durchflusszytometrie Proportionen des follikulären T Helfer-Zelle Teilmengen zu bestimmen.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von doppelt negativen Thymozyten aus dem Thymus der Maus, gefolgt von retroviraler Transduktion und Co-Kultur auf dem delta-like 4-exprimierenden Knochenmark-Stroma-Zelllinien-Co-Kultursystem (OP9-DL4) zur weiteren funktionellen Analyse.

Kokultur und Transduktion von murinen Thymozyten auf Delta-ähnlichen 4-exprimierenden Stromazellen zur Untersuchung von Onkogenen bei T-Zell-Leukämie

Wir beschreiben Protokolle für die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymusepithelzellen der Maus und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse.

Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymus-Epithelzellen der Maus und Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse der T-Zellentwicklung im Thymus genetisch veränderter Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung lymphatischer Zellpopulationen und wichtiger Signalwege.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

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