Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Entwicklung im Thymus von Mäusen mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Einzelzell-Suspensionen aus dem Thymus und der Milz der Maus hergestellt werden. In einem zweiten Schritt werden die Thymozyten und Zellen mit einem Antikörper-Cocktail gefärbt, um spezifische Thymus-Populationen zu identifizieren.

Schließlich kann die Frequenz und Anzahl verschiedener Lymphozytenpopulationen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur T-Zell-Entwicklung zu beantworten, beispielsweise, welche Gene und Signalwege wichtig sind, um ein funktionelles, aber dennoch zelltolerantes T-Zell-Repertoire zu erzeugen. Obwohl diese Methode Einblicke in die T-Zell-Entwicklung im Thymus ermöglicht, kann sie auch bei der Untersuchung der Entwicklung anderer Immunzellen angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Konzeption ihrer Antikörpermischungen für die Durchflusszytometrie. Vor Beginn der Dissektion eine sterile Stahlsiebfläche in eine 60 mal 15 Millimeter große Petrischale geben. Anschließend fünf Milliliter HBSS zur Schale hinzufügen und die Schale zur Gewinnung des Thymus auf Eis lagern.

Zunächst heben Sie mit einer Pinzette die untere Spitze des Brustbeins an, um das Zwerchfell freizulegen. Danach schneiden Sie, die Leber vermeidend, das Zwerchfell durch, um den Rippenkorb zu lösen, und schneiden anschließend den Rippenkorb beidseits nach oben hin durch. Achten Sie dabei darauf, Lunge und Herz zu schonen.

Verwenden Sie nun die Pinzette, um den Rippenkorb vorsichtig nach hinten zu ziehen. Der Thymus ist ein weißes, zweilappiges Organ, das sich oberhalb des Herzens befindet. Benutzen Sie die flache Kante der Pinzette, um den unteren Teil der Lappen zu erfassen.

Ziehen Sie dann vorsichtig den Thymus heraus und legen Sie ihn auf eines der zuvor vorbereiteten Siebträger. Um die Milz zu entnehmen, führen Sie einen Schnitt durch das Peritoneum durch, um die Bauchhöhle freizulegen. Die Milz ist ein rot gefärbtes, surfbrettförmiges Organ, das sich auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus unterhalb der Leber befindet.

Verwenden Sie dann ein Paar Pinzetten, um die Milz herauszuziehen, und ein weiteres Paar, um das Bindegewebe vorsichtig zu lösen. Legen Sie die präparierte Milz anschließend auf einen separaten Netzfilter. Benutzen Sie nun den Kolben einer Dreimilliliter-Spritze, um jedes Organ auf dem Netzfilter zu zerkleinern, bis nur noch Bindegewebe und Fett zurückbleiben. Pipettieren Sie die Zellen und HBSS in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.

Anschließend jede Membran dreimal mit frischem HBS S3 spülen. Danach die Zellen fünf Minuten bei 335 × g und 4 °C pelletieren. Nach dem Absaugen des Überstandes die Zellen in 500 µL eines CK-Lysepuffers suspendieren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während die erythrozytären Zellen der Milz lysiert werden.

Suspendieren Sie die Thymozyten bei 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Fax-Puffer und stellen Sie sie auf Eis. Geben Sie nun fünf Milliliter HBSS zu, um nach dem erneuten Zentrifugieren die Zellen wieder in einen isotonischen Zustand zu bringen; resuspendieren Sie das erythrozytenfreie Pellet bei 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Fax-Puffer. Beginnen Sie diesen Schritt mit Ali Watting.

Viermal 10 hoch 6 der reservierten THYMOCYTEN pro Durchflusszytometrie-Probe in jedes Brunnen einer 96-Loch-Platte geben. Danach Zellen in die Brunnen einer 96-Loch-Platte für Kompensationskontrollen geben. Anschließend blockieren Sie die FC-Rezeptoren in jeder der Zellproben durch Inkubation mit Anti-CD-1632 für 10 Minuten auf Eis.

Zentrifugieren Sie nun die Platte und entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte einmal mit der Öffnung nach unten in ein Spülbecken klopfen. Suspendieren Sie anschließend jede Vertiefung erneut in 200 µL Fax-Puffer und wiederholen Sie die Waschung. Danach inkubieren Sie die experimentellen Proben mit 200 µL Antikörper-Cocktail oder einzelnen mit Fluorochrom konjugierten Antikörpern für die Kompensationskontrollen, jeweils in Fax-Puffer auf Eis im Dunkeln.

Nach 30 Minuten die Zellen zweimal mit Fax-Puffer waschen und anschließend, nach dem erneuten Aufschwemmen der Zellen in Fax-Puffer, die Proben in Fax-Röhrchen in physiologischen TCR-transgenen Modellen und Wildtyp-Mäusen überführen. Die positive Selektion setzt im doppelt positiven hellen Stadium ein, bevor sie in das doppelt positive schwache Stadium übergeht. Nach dem Kontakt mit dem Antigen treten die doppelt positiven schwachen Thymozyten in ein Übergangsstadium mit CD4-positiv und CD8-schwach ein, bevor sie CD4-positiv werden.

Einzelne positive oder CD8-einzelpositive Thymozyten reife einzigartige positive Thymozyten zeichnen sich durch ihre hohe TCR-Expression und den Verlust von CD24 aus. Während das CD8-zu-CD4-Verhältnis Defekte in der positiven Selektion aufzeigen kann, ermöglicht die Untersuchung von TCR-Beta zu CD69 oder CD5 weitere Einblicke in die Lokalisation des Defekts. Sowohl CD69 als auch CD5 werden nach TCR-Stimulation hochreguliert, wobei stärkere Interaktionen eine höhere Expression dieser Marker hervorrufen.

In diesem TCR-Beta-über-CD69-Diagramm einer Wildtyp-Maus repräsentiert das TCRβ-low-CD69-negative Tor eine Population von präselektierten doppelt positiven Thymozyten. Hingegen stellt das TCRβ-intermediäre CD69-positive Tor eine Übergangspopulation direkt nach der TCR-Aktivierung dar und besteht aus doppelt positiven hellen Zellen sowie einigen doppelt positiven schwachen und CD4-positiven CD8-niedrigen Zellen. Hier veranschaulicht das TCRβ-hohe CD69-positive Tor die Population der Zellen unmittelbar nach der positiven Selektion, die aus doppelt positiven schwachen, CD4-positiven, CD8-niedrigen sowie CD4-einfach positiven Zellen besteht.

Schließlich weist dieses TCR-beta-hohe, CD69-negative Profil eine reifere Zellpopulation auf, die hauptsächlich aus CD4- und CD8-einfach positiven Zellen besteht. Das Fehlen der TCR-beta-intermediären, CD69-positiven sowie der TCR-beta-hohen, CD69-positiven Populationen kann auf eine beeinträchtigte positive Selektion hinweisen. Veränderungen im Verhältnis der CD4-einfach positiven zu den CD8-einfach positiven Zellen innerhalb der TCR-beta-hohen, CD69-negativen Population könnten auf eine veränderte Linienentscheidung hindeuten.

Der Verlust der TCR-beta-hoch-CD69-positiven und der TCR-beta-hoch-CD69-negativen Populationen könnte auf Überlebensprobleme nach der positiven Selektion hinweisen. Die Untersuchung von TCR-beta mittels CD5 ist eine weitere Strategie, um Populationen vor und nach der positiven Selektion zu identifizieren. Diese ersten beiden Populationen bestehen hauptsächlich aus doppelt positiven, hellen Thymozyten.

Die Population mit niedrigem TCR-Beta und niedrigem CD5 repräsentiert präselektierte doppelt positive Thymozyten, und die Population mit intermediärem TCR-Beta und intermediärem CD5 setzt sich aus Zellen zusammen, die die positive Selektion einleiten. Eine beeinträchtigte Bildung dieser oder der vorherigen Population deutet auf eine defekte positive Selektion hin. Die Population mit intermediärem TCR-Beta und hohem CD5 repräsentiert dagegen Thymozyten, die sich gerade in der positiven Selektion befinden, und besteht hauptsächlich aus doppelt positiven abgeschwächten und CD4-positiven Zellen.

CD8-low-Thymozyten. Die TCRβ-hoch-CD5-hoch-Population besteht hauptsächlich aus post-positiver Selektion durchlaufenen Einzel-positiven Thymozyten. Veränderungen im Verhältnis von CD4-Einzel-positiv zu CD8.

Einzeln positive Zellen innerhalb dieser Population können trotz normaler vorangehender Populationen auf Veränderungen in der Linienkommitierung hindeuten. Außerdem kann das Fehlen dieser Population auf ein vermindertes Überleben von Thymozyten nach der positiven Selektion hindeuten, da die negative Selektion den Verlust kleiner, antigenspezifischer Populationen beinhaltet. Defekte in diesem Prozess lassen sich am besten an T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen beobachten; in HY-CD4-Mäusen können Thymozyten, die den transgenen H-Y-TCR exprimieren, mit dem monoklonalen Antikörper T3.7 nachgewiesen werden.

Der H-Y-T-C-R erkennt das männlichkeitsspezifische HY-Antigen, das im MHC-Klasse-I-Molekül db präsentiert wird. Daher unterliegen HY-CD4-positive männliche Mäuse einer negativen Selektion von H-Y-T-C-R-positiven Thymozyten, was sich in einer Verringerung der Anzahl von T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten und einem noch stärkeren Rückgang der T3.7-positiven CD8-einfach positiven Thymozytenzahlen zeigt. Im Gegensatz dazu durchlaufen HY-CD4-positive weibliche Mäuse eine positive Selektion, um T3.7-positive CD8-einfach positive T-Zellen zu bilden.

Während eine Verringerung der doppelt positiven Thymozytenzahlen auf eine negative Selektion hinweist, ist das Fehlen antigenspezifischer einzeln positiver Thymozyten das genaueste Maß. Eine genauere Untersuchung der wenigen T3.70-positiven CD8-einzelpositiven Thymozyten in HY-CD4-männlichen Mäusen zeigt, dass die meisten CD24-hoch-exprimierende unreife Zellen sind. Im Gegensatz dazu haben die meisten T3.70-positiven CD8-einzelpositiven Thymozyten in HY-CD4-weiblichen Mäusen die Reife erreicht und weisen einen niedrigen CD24-Spiegel auf, was weiterhin dafür spricht, dass eine negative Selektion in HY-CD4-männlichen Mäusen stattfindet.

Ein Nachteil der TCR-transgenen Modelle ist, dass es aufgrund der hohen TCR-Expression während der gesamten Thymozytenentwicklung schwierig ist, die positive Selektion weiter zu charakterisieren, indem Populationen anhand der Expression von TCR und CD69 oder CD5 identifiziert werden. HY-CD4-weibliche Mäuse weisen eine große Population von T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten auf, die einer positiven Selektion unterliegen. Dies zeigt sich in einer Zunahme der CD69-positiven Population im Vergleich zum Wildtyp. Die negative Selektion erfordert einen TCR-Reiz höherer Affinität als die positive Selektion. Dies wird durch eine stärkere Expression von CD69 auf T3.70-positiven doppelt positiven Thymozyten bei HY-CD4-männlichen Mäusen angezeigt, was zu einer Verschiebung des Histogramm-Gipfels nach rechts führt.

Ähnliche Trends zeigen sich bei der Analyse der thymischen Selektion in genetisch veränderten Mäusen hinsichtlich der Expression von CD five. Die Untersuchung der Expression von CD 69 oder CD five kann Aufschluss darüber geben, ob der Defekt in der TCR-Signalübertragung oder in einer downstream liegenden Folge der TCR-Stimulation begründet ist. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie in zweieinhalb Stunden für die Zellpräparation und Färbung sowie zusätzliche eine Stunde für die Datenerfassung am Durchflusszytometer durchgeführt werden.

Wenn korrekt durchgeführt, verlängert jede zusätzliche Maus das Verfahren um etwa 30 Minuten. Während des Arbeitens ist es wichtig, die Thymozyten vorsichtig zu behandeln und sicherzustellen, dass die Färbestrategie im Voraus geplant wurde. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Tests wie Abtötungsassays oder Zytokinproduktionsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die exportierten Thymozyten ordnungsgemäß funktionieren. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Entwicklung der Thymuslokalisation mittels Durchflusszytometrie analysiert werden kann.