Субстрат поколения для эндонуклеаз CRISPR / Cas системы

Общей целью следующих экспериментов является создание РНК-субстратов для изучения Cas Endonuclease, которые играют решающую роль в более четких иммунных системах Cass, обнаруженных у бактерий и ArcHa, для получения РНК-субстратов для Cas Endonuclease. ПЦР-амплификация определенного участка CRISPR может быть использована для получения длинной матрицы ДНК для производства РНК in vitro. Если предпочитают.

Два олигонуклеотида могут быть соединены коленом для создания более коротких матриц для производства субстратной РНК. В качестве альтернативы, короткие, специально синтезированные повторяющиеся последовательности могут быть затем протестированы в анализах эндонуклеазы CAS. В конечном счете, производство транскриптов РНК и последующее расщепление шестью эндонуклеазами CAS могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

Основная цель методики докладчика — дать возможность исследователям изучить процессинг CRISPR РНК с РНК-субстратами различной длины. Поэтому для получения малых РНК используются различные методы, например, одиночные повторяющиеся элементы или более крупные РНК, такие как CRISPR, РНК, транскрипты, которые охватывают несколько спейсеров. Несмотря на то, что эти методы конкретно дают представление о созревании CRISPR РНК, аналогичные стратегии подготовки шаблонов могут быть приняты для других систем обработки РНК, демонстрируя процедуру с приглушенной поверхностью аспиранта и постдока, как из лаборатории, так и из ArcHa CRISPR иммунной системы.

Вирусная последовательность ДНК, называемая протоспейсером, может быть вставлена между двумя повторяющимися элементами в растущем кластере CRISPR в процессе, называемом адаптацией. Затем весь кластер CRISPR транскрибируется, а затем обрабатывается в малые CRISPR РНК с помощью эндонуклеазы Cass, например, CAS six. Малые CRISPR РНК затем включаются в каскад белковых комплексов CAS и опосредуют защиту хозяина от повторной вирусной атаки, используя комплементарность оснований между CRISPR РНК и протоспейсером в качестве сигнала для деградации вирусной ДНК для генерации длинных субстратов пре-CRISPR РНК.

Начните с разработки праймеров для ПЦР, нацеленных на области спейсеров кластера CRISPR путем добавления последовательности промотора полимеразы Т-7 РНК к прямому праймеру. Затем добавьте сайты рестрикции к обоим праймерам для клонирования продукта ПЦР в вектор. Обратите внимание, что Т-7 РНК-полимераза требует 1-го гинового остатка для правильной инициации транскрипции после амплификации интересующей последовательности РНК pre CRISPR из геномной ДНК с помощью ПЦР.

Разделите продукты ПЦР, Виагра с помощью геля электрофереза и гелевого экстракта по желанию запретите, затем переварите продукт ПЦР с ферментами рестрикции для создания липких концов. Затем, после очистки продукта ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР, чтобы устранить любые побочные продукты расщепления, добавьте буфер T four DNA Ligase T four DNA Ligase и соотношение трех к одному молярам расщепленного продукта PCR к четырем родственным векторам шайбы DFOs с соответствующими липкими концами. Теперь инкубируйте реакцию лигирования при 16 градусах Цельсия в течение ночи, а затем преобразуйте смесь в компетентные кишечную палочку, DH пять альфа-клеток по стандартным протоколам с использованием сине-белого скрининга для выявления успешного лигирования.

Наконец, изолируйте плазмиды из белых колоний с помощью набора для подготовки плазмид и идентифицируйте положительные клоны с помощью секвенирования плазмид для получения субстратов пре-CRISPR РНК промежуточного размера. Начните с проектирования прямых и обратных олигонуклеотидов с желаемой последовательностью повторных пространств CRISPR, аналогичной последовательностям, показанным здесь. Следует отметить, что олигонуклеотиды содержат последовательность промотора полимеразы Т-7 РНК, а также концевые сайты рестрикции после терминации олигонуклеотидов, чтобы обеспечить образование липких концов.

После стояния на коленях образцы инкубируют с Т-4 полинуклеотидкиназой и Т-4 полинуклеотидкиназным буфером в течение одного часа при 37 градусах Цельсия до пяти первичных фосфорилятов, по одному аномальному от каждого из олигонуклеотидов. Затем инкубируйте фосфорилированные прямые и обратные олигонуклеотиды с буфером T 4 DNA лигазы в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия на нагревательном блоке. После того, как образцы гибридизуются, выключите источник тепла и дайте смеси остыть в течение примерно двух-трех часов, пока они не достигнут комнатной температуры.

Теперь лигируйте называемые олигонуклеотиды с помощью гибридизационной смеси, расщепленного и дефосфорилированного P-вектора T, четырех буферов ДНК-лигазы и TP при 16 градусах Цельсия в течение ночи. Затем трансформируют лигированные плазмиды в компетентные e-coli, DH пять альфа-клеток по стандартным протоколам с использованием сине-белого скрининга для выявления успешного лигирования. Наконец, изолируйте плазмиды и идентифицируйте положительные клоны с помощью расщепления и последующего секвенирования плазмид.

Короткие последовательности субстрата РНК cas с одним повтором могут быть сконструированы аналогично показанным здесь. Обязательно включите в состав дезоксирибонуклеотид. Если необходимо определить место расщепления РНК, то для реализации производства олигонуклеотида РНК можно использовать специализированную возможность синтеза.

После выделения плазмид с помощью персонализированного субстрата по выбору, используя набор для очистки плазмид maxi prep, линеаризуйте плазмиды с помощью фермента рестрикции, который расщепляется после клонированных фрагментов. Затем, после обеспечения полного разложения, очистите линеаризованную плазмиду путем экстракции фенолхлороформа и осаждения этанола. Восстановите нуклеиновые кислоты с помощью ресуспензии, суспензии гранулы в стерильной воде, обработанной DEPC.

Теперь инкубируйте пищеварительные плазмиды в свежеприготовленной in vitro смеси для транскрипции полимеразы с семью РНК, включая A-T-P-C-T-P-G-T-P и UTP, в течение трех часов при 37 градусах Цельсия. Наконец, анализируют полученные транскрипты РНК на денатурирующем восьмимолярном мочевине, 12%-ном полиакриламидном геле. Также возможно очистка транскриптов с помощью моно Q анионообменной хроматографии, а затем извлечение транскриптов путем осаждения этанолом фракций РНК и ресуса гранул в стерильной воде, обработанной DEPC. Анализ дизайн-субстратов с помощью эндонуклеазных анализов начинается с визуализации полос субстрата с помощью авторадиографии и очистки продуктов реакции путем экстракции гелем из денатурирующей восьмимолярной мочевины.

12%-ный полиакриламидный гель затем производит и очищает желаемые рекомбинантные белки CAS с помощью теплового осаждения, хроматографии NTA никеля, как показано для этого белка CAS six из термоэлемента Clostridium. Затем смешайте белок CAS со свежеприготовленной смесью эндонуклеазной реакции в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы можно было провести реакцию эндонуклеазного анализа. Наконец, загрузите пять реакционных смесей на восьмимолярную мочевину.

12% полиакриламидного геля и визуализировать продукты расщепления после электрофореза с помощью авторентгенографии. Здесь показан окрашенный в синий цвет полиакриламидный гель из специально разработанного олигонуклеотида РНК и двух транскриптов РНК in vitro. Обратите внимание, что эффективность производства РНК варьируется между короткими, длинными и промежуточными конструкциями.

Исследование активности эндонуклеазы РНК требует положительного отрицательного контроля, а также высокоочищенных рекомбинантных белков cas. На этом рисунке. Гель для страниц SDS препарата CAS six из термоэлемента Clostridium.

После осаждения тепла и никеля показано, как проводится NTA-хроматография вместе со стандартным белковым маркером. Подходящий отрицательный контрольный образец должен содержать лизат клеток без экспрессии CAS six, но после идентичной процедуры очистки CAS six было определено, что препарат CAS 6 обладает требуемым высоким уровнем чистоты. Здесь с помощью авторентгенографии можно визуализировать расщепление субстрата из пяти простых меченых повторных последовательностей белком CO Clostridium thermo cell CAS six.

Каждая полоса содержит радиоактивно меченый субстрат, РНК после инкубации с примерно шестью белками, как указано знаками плюс, или с буфером в качестве отрицательного контроля по сравнению со знаками минус, длинные субстраты или короткие субстраты с добавлением или без добавления дезоксирибонуклеотида. В положении минус девять использовали для облегчения эндонуклеазной реакции. Обратите внимание на отсутствие расщепления коротких субстратов при включении дезоксирибонуклеотида в молекулу РНК после этой процедуры.

Шесть нуклеаз CAS также могут быть использованы в качестве инструмента для создания зрелых, четких РНК. Эти РНК могут быть включены в каскадные комплексы, чтобы получить представление об участии вирусных атак в интерференции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проектировать и производить субстраты CRISPR es для Cas и нуклеаз.

Эти различные субстраты полезны для решения вопросов, касающихся созревания и использования crispr E.