Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in Drosophila

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Flugleistung bei Drosophila schnell und genau zu messen. Dies wird erreicht, indem zuerst Fliegen in einen Flugzylinder fallen gelassen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Landefläche mit einer Digitalkamera abzubilden.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten mit Hilfe einer Bildgebungssoftware zu analysieren, indem die Landehöhe jeder Fliege gemessen wird. Letztendlich hilft dieses Verfahren, Mutationen und Erkrankungen wie Alterung oder Neurodegeneration zu identifizieren, die die Flugfähigkeit beeinträchtigen, und hilft, die Flugleistung zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem ursprünglichen Flugtester, besteht darin, dass sie besser für Hochdurchsatz-Screenings auf Mutanten und andere Bedingungen geeignet ist, die den Flug beeinträchtigen.

Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir feststellten, wie viel Zeit es kostet, eine große Anzahl von Genotypen mit dem ursprünglichen Flugtester zu testen. Befestigen Sie den Flugzylinder mit Kettenklemmen an einem Ringständer. Lassen Sie etwa drei Zentimeter unter dem Zylinder für die Wegschüssel.

Beladen Sie die Führungsschale mit einer dünnen Schicht Mineralöl und schieben Sie sie unter den Flugzylinder. Befestigen Sie den Trichter an einem zweiten Ringständer. Stellen Sie die Höhe des Trichters so ein, dass der Boden des Trichters bündig mit der Oberseite des Flugzylinders abschließt.

Die schmalste Stelle des Trichters muss schmaler sein als ein Fliegenfläschchen. Der Durchmesser des Tropfrohrs sollte etwas breiter sein als bei einem Fliegenfläschchen, damit das Fläschchen frei fallen kann. Führen Sie das Fallrohr oben in den Trichter ein und sichern Sie es mit einer Klauenklemme.

Schneiden Sie dann aus einer Polyacrylamidplatte ein rechteckiges Stück in der Länge des Flugzylinders mit einer Breite aus, die etwas kleiner ist als der Innenumfang des Flugzylinders. Trage eine dünne Schicht Tangle Trap-Kleber auf das Blatt auf und lasse oben und unten genügend Platz, um das Blatt zu halten. Nachdem der Kleber auf dem Blech eine Stunde lang getrocknet ist, schieben Sie das Blech mit dem Kleber nach innen in den Flugzylinder.

Montieren Sie als Nächstes die Kameraschiene mit Halterungen aus Kiefernholz. Stellen Sie sicher, dass die Unterseite der Schiene die Kamera stützen kann, ohne das Objektiv zu blockieren. Schrauben Sie dann die Stopper so fest, dass sie die Sicht der Kamera auf die Plastikfolie nicht unterbrechen.

Sammeln Sie Fläschchen mit Fliegen, die mit nicht mehr als 20 Fliegen pro Durchstechflasche getestet werden sollen. Klopfen Sie mit den Fliegen vorsichtig auf den Boden des Fläschchens. Ziehen Sie den Netzstecker aus der Steckdose und setzen Sie sie in das Fallrohr ein.

Lassen Sie die Durchstechflasche los. Wenn das Fläschchen auf die Wände des sich verengenden Trichters trifft, fliegen die Fliegen, die in den Flugzylinder ausgestoßen werden. Hebe das Fallrohr an, um das leere Fläschchen zu entfernen und bei Bedarf weitere Fliegen zu laden.

Bis zu 200 Fliegen, die aus 10 Fläschchen geladen sind, können problemlos auf einer einzigen Polyacrylamidplatte getestet und abgebildet werden. Entfernen Sie nun die Plastikfolie und legen Sie sie auf eine flache weiße Oberfläche, wenn die Arbeitsplatten dunkel gefärbt sind. Montieren Sie die Kameraschiene über der Kunststofffolie.

Die Kamera sollte sich ausreichend hoch über dem Blatt befinden, um sowohl die Ober- als auch die Unterseite des Blattes im Sichtfeld zu haben. Schieben Sie die Kamera entlang der Strecke, während Sie die Aufnahmetaste gedrückt halten, um ein Panoramabild aufzunehmen. Die Anzahl der Fliegen, die im Öl in der Schüssel unterhalb der Flugkammer landen, kann manuell gezählt werden.

Für jeden Versuch zwischen den Versuchen können Fliegen aus dem Blatt entfernt und das Blatt wiederverwendet werden. Öffnen Sie die Bilddateien in der Image J-Software, schneiden Sie die Bilder bei Bedarf so zu, dass nur die Landefläche enthalten ist. Die flächenbeschichtete Verwicklungsfalle.

Konvertieren Sie die Bilder in Acht-Bit-Graustufen und erstellen Sie einen Schwellenwert. Um den weißen Hintergrund herauszufiltern. Legen Sie die Parameter fest, um jede Fliege zu identifizieren.

Definieren Sie im Menü "Partikel analysieren" die Parameter. Wird verwendet, um ein Partikel mit dem Demonstrationsgerät zu identifizieren. Ein Bereich von fünf bis 90 Pixeln im Quadrat und eine Kreisförmigkeit von 0,4 bis 1,0 ermöglichen eine genaue Identifizierung aller Proben.

Messen Sie nun die Position jeder Fliege anhand der generierten Koordinatenliste für jedes Partikel. Die X-Koordinate in Pixel kann in Zentimeter umgerechnet werden. Um die Podesthöhe zu berechnen, importieren Sie die Tabelle in eine Tabelle und fahren Sie mit der Analyse fort.

Die Flugleistung von Slow-Poke-Mutantenfliegen, die einen bekannten Flugdefekt aufweisen, wurde mit Wildtyp-Kantonsfliegen verglichen. Alle Fliegen waren drei Tage alt und wurden bei Raumtemperatur aufgezogen. Die Fliegen landeten durchweg in der Nähe der Oberseite des Zylinders. Die Streuung der Landung war bei Mutanten mit langsamem Poke viel größer.

Die durchschnittliche Landehöhe für Kantone war mit 73 Zentimetern signifikant höher als die von Slow-Poke-Mutanten mit 44 Zentimetern. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie die Histologie verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur strukturellen Integrität von Flugmuskeln, Motoneuronen oder neuromuskulären Verbindungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Flugleistung in oph schnell beurteilen können.