Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Flugleistung von Drosophila schnell und genau zu messen. Dies wird erreicht, indem man die Fliegen zunächst in einen Flugzylinder fallen lässt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Landefläche mit einer Digitalkamera abzubilden.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten mithilfe einer Bildanalyse-Software zu analysieren, indem die Landehöhe jeder Fliege gemessen wird. Letztendlich hilft dieses Verfahren, Mutationen sowie Bedingungen wie das Altern oder Neurodegeneration zu identifizieren, die die Flugfähigkeit beeinträchtigen, und ermöglicht die Quantifizierung der Flugleistung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise dem ursprünglichen Flugtestgerät, liegt darin, dass sie besser für Hochdurchsatz-Screenings von Mutanten und anderen Bedingungen geeignet ist, die die Flugfähigkeit beeinträchtigen.

Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir erkannten, wie viel Zeit der Test einer großen Anzahl von Genotypen mit dem ursprünglichen Flugtester in Anspruch nahm. Befestigen Sie den Flugzylinder mit Klemmen am Stativring. Lassen Sie unterhalb des Zylinders etwa drei Zentimeter Platz für die Auffangschale.

Bestreichen Sie die Laufplatte mit einer dünnen Schicht Mineralöl und schieben Sie sie unter den Flugzylinder. Befestigen Sie das Trichter an einem zweiten Stativ. Stellen Sie die Höhe des Trichters so ein, dass das untere Ende des Trichters bündig mit der Oberseite des Flugzylinders abschließt.

Der engste Teil des Trichters muss schmaler sein als ein Fliegenfläschchen. Der Durchmesser des Fallrohrs sollte etwas größer als das Fliegenfläschchen sein, damit das Fläschchen frei herunterfallen kann. Setzen Sie das Fallrohr in die Öffnung des Trichters ein und befestigen Sie es mit einer Klemme.

Schneiden Sie als Nächstes aus einem Polyacrylamid-Blatt ein rechteckiges Stück mit der Länge des Flugzylinders und einer Breite, die geringfügig kleiner ist als der Innenumfang des Flugzylinders. Tragen Sie eine dünne Schicht Tangle-Trap-Klebstoff auf das Blatt auf, wobei oben und unten genügend unbeschichteter Randbereich verbleibt, um das Blatt halten zu können. Nachdem der Klebstoff auf dem Blatt eine Stunde lang getrocknet ist, schieben Sie das Blatt mit der klebenden Seite nach innen in den Flugzylinder.

Bauen Sie als Nächstes die Kamera-Schiene mit Kiefern-Halterungen zusammen. Stellen Sie sicher, dass die Unterseite der Schiene die Kamera tragen kann, ohne das Objektiv zu verdecken. Schrauben Sie anschließend die Stopper an Stellen ein, an denen sie die Sicht der Kamera auf das Kunststoffblatt nicht behindern.

Sammeln Sie Röhrchen mit Fliegen für die Untersuchung, wobei nicht mehr als 20 Fliegen pro Röhrchen verwendet werden. Klopfen Sie vorsichtig, damit die Fliegen sich am Boden des Röhrchens sammeln. Ziehen Sie den Stopfen heraus und setzen Sie das Röhrchen in das Fallrohr ein.

Lassen Sie das Vial los. Wenn das Vial auf die Wände des sich verengenden Trichters trifft, werden die Fliegen in den Flugzylinder ausgestoßen. Heben Sie das Fallrohr an, um das leere Vial zu entfernen, und füllen Sie bei Bedarf weitere Fliegen nach.

Bis zu 200 Fliegen, die aus 10 Gefäßen entnommen wurden, können problemlos auf einem einzigen Polyacrylamid-Gel getestet und abgebildet werden. Entfernen Sie nun die Kunststofffolie und legen Sie sie auf eine ebene, weiße Unterlage; ein weißer Pappkarton kann verwendet werden, wenn die Laboroberflächen dunkel sind. Bauen Sie die Kamerabahn über der Kunststofffolie auf.

Die Kamera sollte hoch genug über dem Blatt angebracht sein, damit sowohl der obere als auch der untere Rand des Blattes im Sichtfeld liegen. Verschieben Sie die Kamera entlang der Schiene, während Sie die Aufnahmetaste gedrückt halten, um ein Panoramabild aufzunehmen. Die Anzahl der Fliegen, die in das Öl in der Schale unterhalb der Flugkammer landen, kann manuell gezählt werden.

Für jeden Versuch zwischen den Durchgängen können die Fliegen von dem Blatt entfernt und das Blatt wiederverwendet werden. Öffnen Sie die Bilddateien in der Bild-J-Software und beschneiden Sie die Bilder gegebenenfalls, sodass nur der Landeoberflächenbereich sichtbar bleibt. Der behandelte Bereich ist eine Fangfalle.

Konvertieren Sie die Bilder in ein 8-Bit-Graustufenformat und erstellen Sie eine Schwellwertgrenze, um den weißen Hintergrund herauszufiltern. Legen Sie die Parameter fest, um jede Fliege zu identifizieren.

Definieren Sie mithilfe des Menüs „Teilchen analysieren“ die Parameter. Dient zur Identifizierung eines Teilchens mit dem Demonstrationsgerät. Ein Bereich von fünf bis 90 Quadratpixeln und eine Kreisförmigkeit von 0,4 bis 1,0 ermöglichen die genaue Identifizierung aller Proben.

Messen Sie nun die Position jeder Fliege mithilfe der generierten Liste der Koordinaten für jedes Teilchen. Die X-Koordinate in Pixeln kann in Zentimeter umgerechnet werden. Importieren Sie die Tabelle in eine Tabellenkalkulation, um die Landehöhe zu berechnen, und fahren Sie mit der Analyse fort.

Die Flugleistung von Slow-Poke-Mutanten-Fliegen, die einen bekannten Flugdefekt aufweisen, wurde mit der von Wildtyp-Canton-s-Fliegen verglichen. Alle Fliegen waren drei Tage alt und bei Raumtemperatur aufgezogen. Kontrollfliegen landeten regelmäßig nahe der Oberseite des Zylinders. Die Streuung der Landepositionen war bei den Slow-Poke-Mutanten deutlich größer.

Die durchschnittliche Landehöhe für Kantone bei 73 Zentimetern war signifikant größer als die der Slow-Poke-Mutanten bei 44 Zentimetern. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie die Histologie verwendet werden, um weitere Fragen bezüglich der strukturellen Integrität von Flugmuskeln, motorischen Neuronen oder neuromuskulären Verbindungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Flugleistung bei Oph schnell beurteilen können.