RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen vollständigen und detaillierten Prozess zur Anwendung von RNA-Seq, einer leistungsstarken DNA-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation, zur Profilierung von Transkriptomen vorzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gesamt-RNA aus humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombinbehandlung isoliert und die RNA-Qualität überprüft wird. Der zweite Schritt besteht darin, DNA-Bibliotheken aus diesen RNA-Proben zu erstellen.

Optimieren Sie die Cluster-Generierung mit dem cbot-Instrument und führen Sie die DNA-Sequenzierungsaufgabe auf dem HighSeq 1000 durch. Als nächstes wird eine Datenanalyse durchgeführt, um schließlich differentiell exprimierte Gentranskripte zu identifizieren und darzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, die RN-aeq-Ergebnisse durch RT TP CR zu validieren. Der Hauptvorteil der IC gegenüber bestehenden Methoden wie einem DNA-Microarray für die Transkriptomanalyse besteht darin, dass die IC ein vollständiges Transkriptom profilieren kann, digitale Daten liefert und sich nicht auf eine bekannte genomische Aktivierung der Genexpression in Zellen verlässt.

Die Messung des MRA-Spiegels ist ein nützliches Instrument, um zu bestimmen, wie die Transkription der Maschinerie der Zelle durch externe Signale beeinflusst wird oder wie sich Zellen zwischen einem Gesundheitszustand und einem Krankheitszustand unterscheiden. In diesem Protokoll demonstrieren wir die IC-Analyse von Transkriptomen in mit Trobin behandelten und der Kontrolle menschlicher pulmonaler mikrovaskulärer Indo-Syn-Zellen. Dieses Protokoll basiert auf unserer kürzlich veröffentlichten Studie, in der wir erfolgreich die erste vollständige Transkriptomanalyse von humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen durchgeführt haben, die mit Thrombin unter Verwendung von RNA-Seq auf dem High SEQ 1000, einer beliebten DNA-Sequenzierungsplattform der nächsten Generation, behandelt wurden. Frau

Suman Shaha wird die DNA-Sequenzierung auf dem High SEQ 1000-Instrument sowie das R-T-P-C-R-Validierungsexperiment demonstrieren. Unter Verwendung des VS seven R-T-P-C-R-Systems wird Dr.Denova die Thrombinbehandlung von humanen pulmonalen, mikrovaskulären Endothelzellen und die Isolierung von Zell-RNA demonstrieren.Frau Margaret Gibson wird das Experian-System zur Überprüfung der RNA-Qualität und der DNA-Bibliothek sowie der Cluster-Generierung auf dem cbot demonstrieren.

Und Dr. Dimitri Gregor wird die Datenanalyse demonstrieren, um diese Protokollkultur zu beginnen. Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge mit einer Konfluenz zwischen 90 und 100 % in sechs Vertiefungen, Platten in EGM, zwei Medien mit 5 %FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika. Wechseln Sie das Medium 30 Minuten vor der Behandlung mit Thrombin auf das Hungermedium.

Behandeln Sie die Zellen nach 30 Minuten mit 0,05 Einheiten pro Milliliter, Thrombin oder lassen Sie sie unbehandelt als Kontrolle. Inkubieren Sie die Zellen sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach einer sechsstündigen Behandlung.

Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den behandelten und Kontrollzellen mit dem Nirvana-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beurteilen Sie die Qualität der RNA mit einem eukaryotischen RNA-Chip von Experian gemäß dem Standardprotokoll auf der automatisierten Elektrophoresestation von Experian. Quantifizieren Sie schließlich die RNA mit einer standardmäßigen spektrophotometrischen Methode für den Bibliotheksaufbau.

Verwenden Sie ein Mikrogramm hochwertiger Gesamt-RNA pro Probe als Ausgangsmaterial für den Aufbau der Bibliothek. Befolgen Sie das Standardprotokoll des Herstellers. In diesem Protokoll werden zwei Runden von Poly-Selektionen durchgeführt, die Mr.mRNA-Selektionen enthalten.

Um unsere RNA zu entfernen und so die RNA-Sequenzierung zu minimieren, bewerten Sie die Qualität der Bibliotheken mit einem Experian DNA One K-Chip. Gemäß dem Standardprotokoll auf der automatisierten Elektrophoresestation von Experian. Quantifizieren Sie die Bibliothek mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion.

Abgekürzt Q-R-T-P-C-R, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Begleitend zu diesem Video führen Sie den Q-R-T-P-C-R gemäß dem cyber green MM-Protokoll aus und berechnen die ursprüngliche Bestandskonzentration jeder Bibliothek. Verdünnen Sie die Bibliotheksbestände auf 10 Nanomolar und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius.

Wenn eine Durchflusszelle zum Clustern bereit ist, tauen Sie die Cbot-Reagenzplatte in einem Wasserbad auf. CBOT ist ein Instrument zur Rationalisierung des Cluster-Generierungsprozesses. Nach dem Waschen des cbot-Instruments denaturieren Sie die Bibliotheken, indem Sie zunächst 13 Mikroliter eines XTE und sechs Mikroliter 10 Nanomolar kombinieren.

Bibliothekieren Sie dann an der Seite jedes Röhrchens, fügen Sie einen Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids hinzu, wirbeln Sie die Röhrchen nach unten und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie dann die vergällten Bibliotheken auf Eis. Als nächstes verdünnen Sie die denaturierten Bibliotheken mit vorgekühltem Hybridisierungspuffer, indem Sie 996 Mikroliter Puffer und 4,0 Mikroliter denaturierte Bibliothek für eine Endkonzentration von 12 Picomolar kombinieren.

Legen Sie die denaturierten verdünnten Bibliotheken auf. Drehen Sie dann jede Reihe von Röhrchen der Cbot-Platte um und stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien aufgetaut sind. Nach dem Abdrehen der Platte die Foliendichtung aus der Reihe der Natronlauge entfernen und auf das Cbot Aliquot laden.

120 Mikroliter der verdünnten denaturierten Bibliotheken in ein Streifenröhrchen mit der Bezeichnung eins bis acht. Geben Sie 1,2 Mikroliter der verdünnten denaturierten PHI X-Kontrollbibliothek in jedes Röhrchen als Anstieg der Kontrolle. Nachdem Sie die Rohre vortext und heruntergeschleudert haben, laden Sie sie in der richtigen Ausrichtung auf den Cbot, wobei Rohr Nummer eins nach rechts zeigt.

Laden Sie eine Durchflusszelle und einen Verteiler auf den cbot. Schließen Sie die Flow-Überprüfung ab, und starten Sie die Clustering-Ausführung. Überprüfen Sie nach Abschluss des Laufs die Reagenzienabgabe in allen Bahnen.

Notieren Sie sich alle Anomalien. Starten Sie entweder sofort den Sequenzierlauf oder lagern Sie die Durchflusszelle im mitgelieferten Röhrchen bei vier Grad Celsius. Um mit der Sequenzierung zu beginnen.

Tauen Sie die Sequenzierung mit Synthesereagenzien auf. Legen Sie die Reagenzien an die entsprechenden Stellen auf den Reagenzienschalen und achten Sie darauf, die anderen Reagenzien nicht zu berühren. Nach dem Berühren der Spaltmischung werden die Reagenzlinien mit einer Non-S-Sequenzierungs-Durchflusszelle zweimal grundiert und die Sequenzierflusszelle mit 70 % Ethanol und Kim-Tüchern gereinigt, gefolgt von 70 % Ethanol und Linsenpapier.

Untersuchen Sie die Durchflusszelle auf Schlieren und reinigen Sie sie gegebenenfalls erneut. Laden Sie die Durchflusszelle auf den Sequenzer und führen Sie eine Durchflussprüfung durch, um sicherzustellen, dass die Dichtung zwischen den Verteilern und der Durchflusszelle dicht ist. Starten Sie den Sequenzlauf.

Bewerten Sie die Qualitätsmetriken, sobald sie während des Laufs verfügbar werden Überwachen Sie die Intensität während des gesamten Laufs. Nachdem 101 Zyklen abgeschlossen sind. Führen Sie eine Turnaround-Chemie durch, um den zweiten Lesevorgang abzuschließen.

Der erste Vater paarte und die Reagenzien und der zweite Read Incorporation Puffer. Laden Sie dann die Reagenzien, setzen Sie die Sequenzierung fort und führen Sie die Bewertung durch. Zweitens: Lesen Sie die Intensität, das 3. Quartal und andere Qualitätskennzahlen im Laufe des Laufs.

Um mit der Datenanalyse zu beginnen, verwenden Sie die neueste Version von cassava und konvertieren Sie die Basisaufrufdateien in FAST Q-Dateien. Festlegen der Anzahl der schnellen Q-Cluster auf Null, um die Erstellung einer einzelnen schnellen Q-Datei sicherzustellen. Entpacken Sie für jede Probe die schnellen Q-Dateien für die nachgelagerte Analyse.

Führen Sie Paired und Alignment mit der neuesten Version von Top Hat durch, die RNA-Seq-Reads mit den Short-Read- und SAM-Tools mit ultrahohem Durchsatz an Genome in Säugetiergröße ausrichtet, die verschiedene Dienstprogramme für die Nachbearbeitung von Alignments im SAM-Format implementieren. Das humane Referenztranskriptom kann von I genomes in running top hat heruntergeladen werden. Alle Standardparametereinstellungen wurden verwendet, einschließlich der Option für den Bibliothekstyp, da das Fragment mit dem Programm cuff diff Teil des Cufflinks-Softwarepakets entsträngt wird. Vergleichen Sie die mit Thrombin behandelten Zellen mit den Kontrollzellen.

Filtern Sie die differentiell exprimierten Gentranskripte in den mit Thrombin behandelten Zellen basierend auf dem humanen Referenztranskriptom heraus. Verwenden Sie dann eine Tabelle, um das Ergebnis in Tabellenform zu visualisieren. In diesem Fall wurden alle Standardparametereinstellungen verwendet und diejenigen Gentranskripte mit FPKM kleiner als 0,05 und p größer als 0,05 herausgefiltert, um neue Isoformen zu erkennen, die Manschettenknöpfe ohne Referenz ausführen.

Transkriptom: Vergleichen Sie die Beispieltranskriptdateien mit dem Referenzgenom mithilfe des Manschettenvergleichs. Testen Sie die differentielle Expression mit Cuff Diff unter Verwendung der kombinierten Thrombin-Transkriptdateien als Referenzgenom für eine Analyse und der kombinierten Kontrolltranskriptdateien als Referenzgenom für eine zweite Analyse, und verwenden Sie erneut eine Tabelle, um das Ergebnis in Tabellenform zu visualisieren. Wie zuvor wurden jene Gentranskripte mit FPKM kleiner 0,05 und p größer als 0,05 herausgefiltert.

Nach diesem Schritt können sich die Prüfärzte dafür entscheiden, eine Liste der neu gemeldeten Transkripte auf die UC SC Genome-Browser-Website hochzuladen, um ihre Gültigkeit durch eine manuelle Inspektion zu überprüfen. Listen von differentiell exprimierten Genen können auch einer Analyse des Einfallsreichtums unterzogen werden, um die Gene und Signalwege zu charakterisieren, die von der Thrombinbehandlung betroffen sind. In diesem Schritt können sich die Ermittler für die Verwendung von Kummerbund entscheiden, einem R-Paket, das entwickelt wurde, um die Analyse der RN-AEQ-Ausgabe von Manschettenknöpfen zu unterstützen und zu vereinfachen, um alle von einer Manschettendiff-Analyse erzeugten Daten zu verwalten, zu visualisieren und zu integrieren.

Die Validierung der RN-aeq-Ergebnisse erfolgt dann zunächst durch Q-R-T-P-C-R, die vollständige RNA-Isolierung aus kontrollierten und mit Thrombin behandelten mikrovaskulären Lungen-Endothelzellen, die Bewertung der RNA-Qualität und die RNA-Quantifizierung, wie zuvor im Video gezeigt. Generieren Sie dann komplementäre DNA aus einem Mikrogramm Gesamt-RNA jeder Probe mit einem hochgestellten Dreistrang-Erststrangsynthesesystem rt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie schließlich eine Q-R-T-P-C-R-Analyse an einem VI-System mit sieben Echtzeit-PCR-Systemen durch, indem Sie den TAC MAN Assay on Demand verwenden, entworfene Nukleotide, die in dem schriftlichen Protokoll aufgeführt sind, das diesem Video beigefügt ist, und messen Sie die Quantifizierung, wie dort beschrieben.

Das Verhältnis von 28 s zu 18 S wird traditionell als Indikator für den RNA-Abbau verwendet. Um den Abbau genauer zu quantifizieren, berechnet das Erfahrungssystem einen RNA-Qualitätsindikator oder eine RQI-Zahl. Der RQI-Algorithmus vergleicht das Elektropherogramm von RNA-Proben mit Daten aus einer Reihe standardisierter degradierter RNA-Proben und gibt automatisch eine Zahl zwischen 10 und eins zurück. Die RNA-Probe sollte einen RQI von mindestens sieben und idealerweise mehr als acht haben.

Diese Experian-Ergebnisse deuten auf eine qualitativ hochwertige RNA-Probe mit einem RQI von 8,4 hin. Die Bibliotheken sollten über ein Breitband von etwa 250 bis 300 Basenpaaren verfügen, wie in dieser Abbildung der Experian-Ergebnisse für eine qualitativ hochwertige Bibliothek gezeigt. Hier sind die Q-R-T-P-C-R-Ergebnisse von Standardkurvenproben und einer unbekannten Probe dargestellt.

Der Fortschritt und die Qualität des Sequenzierungslaufs sollten während des gesamten Laufs ständig beobachtet werden. Diese Abbildung zeigt die entsprechende Clusterdichte während des ersten Bildgebungsschritts des Zyklus. Dies ist der erste Hinweis auf den Lauf.

Hochwertige Cluster sollten hell und fokussiert sein. Ein Beispiel für den ersten Basisbericht, der nach Abschluss des ersten Zyklus generiert wurde, ist dargestellt. An dieser Stelle ist es wichtig, die geschätzte Clusterdichte, Intensität und Fokusqualität zu bewerten.

Der nächste Qualitäts-Checkpoint nach dem vierten Zyklus wird hier gezeigt. Hier wird die absolute Cluster-Dichte für jede Lane angezeigt. Die Clusterdichte sollte nach Zyklus 13 nicht über 850 K pro Quadratmillimeter liegen.

Es werden Phasing- und Pre-Phasing-Statistiken berechnet. Typische Zahlen liegen zwischen 0,1 und 0,25. Die große Qualitätsbewertung ist nach Zyklus 24 möglich, wenn mehrere Qualitätsmetriken berechnet werden.

Der Prozentsatz der Lesewerte über Q3 ist ein Maß für das Vertrauen in die Basis. Das Aufrufen eines Lesevorgangs mit einem Q-Score von drei bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit, dass der Basisaufruf falsch ist, bei eins zu 1000 liegt. Die Q-Scores nehmen im Laufe des Laufs ab, sollten jedoch damit beginnen, dass mehr als 95 % der Lesevorgänge erreicht werden oder Q3 überschritten werden. Die Cluster, die Filter oder pf passieren, sind die Cluster, aus denen die eigentlichen Sequenzdaten entnommen werden.

Idealerweise sollte dieser über 85 % liegen. Der Cluster pf basiert auf vielen Faktoren, darunter Phasing, Pre-Phasing-Intensität und Q3.It sich im Laufe des Laufs nicht ändern. Der ausgerichtete Prozentsatz ist ein Maß für die Reads, die in Echtzeit mit dem FI x-Genom übereinstimmen. Da etwa 1 %FI x Bibliothek in die Stichprobenbibliotheken eingefügt wurde, sollte der ausgerichtete Prozentsatz zwischen 0,5 und eins liegen.

Diese Statistik zeigt, dass der Bibliotheksinhalt durch die Cluster gut repräsentiert wird und es keine Verzerrung der Clustergenerierung gab. Hier sind exprimierte Gene und Isoformen sowohl in kontrollierten als auch in mit Thrombin behandelten humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen aufgeführt. Bemerkenswert ist, dass etwa 26.000 neue Isoformen nachgewiesen wurden, was die Stärke von RN aeq verdeutlicht. Es kann unbekannte RNAs identifizieren.

Alternativ können gespleißte Transkripte und alternative Promotoren verwendet werden, die mit Microarray-Techniken nicht nachweisbar sind. RNA-Seq kann auch die weniger häufig vorkommenden Transkripte messen, die ungenau, quantifiziert oder von Microarrays nicht nachgewiesen werden, um die RNA-Seq-Ergebnisse mit einem alternativen Ansatz zu validieren. Das A-Q-R-T-P-C-R-Experiment wurde durchgeführt, um drei verschiedene Gene in RNA-Seq-Daten zu testen: TR eins war um das 7,96-fache hochreguliert

Eine wurde um das 1,16-fache herunterreguliert und zwei wurde um das 1,70-fache in den Q-R-T-P-C-R-Daten herunterreguliert, diese entsprechenden Zahlen sind plus 7,25-fach minus 1,15-fach bzw. minus 2,07-fach. Die Ergebnisse dieser drei Gene, die mit RNA-Seq und Q-R-T-P-C-R untersucht wurden, stimmen gut überein, was die RNA-Seq-Ergebnisse bestätigt. Dieses Protokoll ist spezifisch für IC zu einem einmaligen Zeitpunkt von mit Trobin behandelten menschlichen pulmonalen mikrovaskulären Zellen in den älteren Zellen, aber es könnte leicht an eine Mehrzeitstudie oder Studien an anderen Zellgeweben angepasst werden, die mit verschiedenen Stimuli oder Inhibitoren behandelt wurden, oder an den Vergleich von Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand und dem Krankheitszustand.

Obwohl es spezifisch für den hohen SQ 1000 ist, ist dieses Protokoll auf jedes Mitglied der HighSeq-Familie oder den Genomanalysator anwendbar. Zwei Instrumente mit geringfügigen Modifikationen der Cluster-Erzeugungsschritte und Sequenzierungsreagenzien. Andere DNA-Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation, wie z. B. die feste Serie.

Die GS-Systeme, sowie einige aufstrebende neuere Systeme werden ebenfalls für den Zweck der RNA-Seq eingesetzt. Obwohl ihre Bibliothekskonstruktion und Sequenzierungsverfahren leicht unterschiedlich sein können, können die in diesem Protokoll vorgestellten Tipps zur RNA-Handhabung, die Datenanalyseabschnitte und die Validierung durch R-T-P-C-R von Referenzwert für ihre RNA-Seq-Anwendungen sein.