Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese
9. Januar 2026
Diese Arbeit beschreibt einen mikrofluidischen Assay, der Scherspannung nutzt, um die Thrombusbildung im Blut auszulösen, und charakterisiert den Thrombus anhand mehrerer Auswertungsdimensionen. Der Test kann die prothrombotische Tendenz von Blutproben messen und ist daher nützlich für die Krankheitsdiagnose, Arzneimittelentwicklung sowie grundlegende mechanistische Studien im Zusammenhang mit Thrombose.
Wir haben eine neue Methode entwickelt, die die biomechanischen Eigenschaften der Thrombose ausreichend erfassen und gleichzeitig prothrombotische Anomalien beim Menschen nachweisen kann. Zu Beginn verwenden Sie einen Siliziumwafer, um eine SU8-Photoresist-Masterform mittels Standardphotolithographie basierend auf dem Design herzustellen und die Masterform am Boden einer 15 Zentimeter großen Petrischuppel mit Klebeband zu befestigen. Bereiten Sie die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Mischung vor, indem Sie die Präpolymerbasis und das Aushärtungsmittel aus dem Silikon-Elastomer-Set im Verhältnis von 10 zu 1 mischen.
Gieße die PDMS-Mischung auf die Hauptform. Dann legen Sie die Platte mit dem PDMS-Gemisch in einen Vakuum-Desikator, um sie zu entmagnetisieren. Die PDMS-Mischung thermisch aushärten, indem Sie sie für zwei Stunden in einen auf 75 Grad Celsius eingestellten Inkubator legen.
Nachdem die Probe aus dem Inkubator entnommen wurde, schneiden Sie vorsichtig das ausgehärtete PDMS aus der Masterform heraus und teilen Sie das ausgehärtete PDMS in einzelne Chipeinheiten. Mit einer Sondennadel werden Löcher an den vorgesehenen Stellen gestanzt, um Ein- und Auslass zu schaffen. In einer chemischen Haube verwenden Sie ein mit 75 % benetztem Ethanol benetztes Arbeitstuch, um die Glasscheiben zu reinigen und zu trocknen.
Als Nächstes behandeln Sie mit einem Hochfrequenzgenerator die Glasschlitten 30 Sekunden lang und die PDMS-Chips 20 Sekunden. Richten Sie jeden Chip mit einem Glasschlitten aus und drücken Sie den Splitter vorsichtig auf die Glasschietenoberfläche, um ihn zu binden. Verbinden Sie die Geräte nun thermisch, indem Sie sie für 15 Minuten in einen Ofen stellen, der auf 150 Grad Celsius eingestellt ist.
Nach dem Verbinden werden die Geräte bei Raumtemperatur unter staubfreien Bedingungen aufbewahrt. Dann wird mit einer Zange der Kunststoffteil der Sondennadeln entfernt und die Metallrohre um 90 Grad gebogen, um Steckverbinder für die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Nachdem die Reaktionen zur Konjugation von Fibrinogen und benötigten Antikörpern mit Alexa Fluor eingerichtet wurden, zentrifugieren Sie die Reinigungssäulen bei 1.100 G für zwei Minuten, um den Speicherpuffer zu entfernen.
Nach dem Entsorgen des Durchflusses wird die Reaktionslösung fünf Minuten lang auf die Reinigungssäule geladen, die in einem kompatiblen Sammelfläschchen montiert ist und bei 1.100 G Zentrifuge gelagert, um die benötigte Mischung zu gewinnen. Mit einem Spektrophotometer misst man die Absorptionsfähigkeit des Proteins und des Farbstoffsignals. Berechnen Sie die Proteinkonzentration und das fluoreszenz-zu-protein-molare Verhältnis.
Die Farbstoffe bei vier Grad Celsius im Dunkeln aufbewahren. Gib Heparin zum Tyrodenpuffer zu einer Endkonzentration von 0,32 Einheiten pro Milliliter und 10 Millilitern zu entnehmendem Blut und bereite die Spritze vor, indem 500 Mikroliter Tyrodenpuffer bei pH 7,4 eingesaugt werden. Nachdem das Blut durch Venenpunktion in der heparinhaltigen Spritze gesammelt wurde, wird es in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen und bei 37 Grad Celsius gehalten.
Verdünne das Von-Willebrand-Faktormonomer auf zwei Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Schichten Sie die mikrofluidischen Geräte mit dem verdünnten von-Willebrand-Faktor-Monomer vor und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nun die Blutprobe mit einem fluoreszierenden Sensor, Einstellung 1 oder 2, für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Als Nächstes verbinden Sie ein mikrofluidisches Gerät mit Ein- und Auslassanschlüssen sowie Schläuchen. Verbinden Sie das andere Ende des Einlassanschlusses mit einem Rohr mit PBS und dann das andere Ende des Auslassanschlusses mit einer Spritze. Die Spritze wird auf eine Spritzenpumpe montiert und das mikrofluidische Gerät auf ein umgekehrtes Mikroskop.
Manövrieren Sie die Mikroskopstufe manuell, um die Stelle der Stenose zu lokalisieren. Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal und den Schlauch mit PBS und der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Inspiziere das Gerät, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen an der Stelle der Stenose vorhanden sind.
Schließen Sie den Einlassschlauch an die Blutprobe an und perfundieren Sie die Blutprobe durch den mikrofluidischen Kanal mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,018 Millilitern pro Minute. In einem invertierten Mikroskop stellen Sie die Belichtungszeit und den Verstärkungswert für jeden Fluoreszenzkanal in der Software ein. Führen Sie eine Echtzeit-Mehrfarb-Fluoreszenzbildaufnahme durch, indem Sie zwischen den vier Kanälen wechseln und jeweils einen Fluoro-4 anregen.
Stellen Sie die Fokusebene auf den Thrombus an und zeichnen Sie fluoreszierende Signale an der Stenosestelle für 15 bis 30 Minuten auf. Für die Datenanalyse öffnen Sie die Datendatei mit ImageJ Version 1.53. Verwenden Sie den SZ 22 fit C-Kanal, um die Kontur des Thrombus zu identifizieren.
Dann wähle ich mit Polygonauswahl grob die Fläche des Thrombus aus. Für jeden Kanal eliminieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie Bild auswählen, Anpassen auswählen und dann Schwellenwert auswählen. Schließlich messen Sie die Fläche und die durchschnittliche Signalintensität innerhalb des Thrombus, indem Sie Analysieren auswählen und Messung auswählen.
Repräsentative Schnappschüsse zeigten, dass sich Thromben im gesunden Blut innerhalb des stenotischen Kanals mit Thrombozyten, Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor und P-Selectin mit Sensorsatz 1 sowie Thrombozyten, Phosphatidylserin, E-positives Integrin alpha IIb beta 3, ein aktiviertes Integrin alpha IIb beta 3, visualisiert mit Sensorsatz 2, gebildet wurden. Ein einzelnes Fluoreszenzkanalbild wurde verarbeitet, indem der Thrombusbereich ausgewählt, das Hintergrundsignal entfernt und die Signalfläche sowie die durchschnittliche Helligkeit gemessen wurden, um eine quantitative Analyse zu ermöglichen. Die kontinuierliche Analyse der fluoreszenten Signalintensität über die Zeit erzeugte eine Signal-Zeit-Kurve für die Blutplättchenansammlung während der Thrombusbildung.
Für jeden Zeitpunkt wurden die Gesamtsignalintensitäten für vier Biomarker im Sensorsatz eins und vier Biomarker im Sensorsatz zwei ermittelt. Die Thrombusgröße wurde berechnet und ein siebendimensionales Thrombusprofil erzeugt. Derzeit ist kein Bioassay verfügbar, um die prothrombotische Tendenz menschlicher Patienten zu bewerten, und unsere Arbeit versucht, diese Lücke zu schließen.
Durch die Erkennung der biomechanischen Aktivität von Blutproben kann unser Test die prothrombotischen Eigenschaften der Probanden umfassend bewerten. Unser Assay kann zu einem klinischen Test zur Erkennung der prothrombotischen Tendenz bei Patienten entwickelt werden und auch zum Screening von Antithrombotika der nächsten Generation verwendet werden.
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Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Biomechanical thrombogenesis presents a critical challenge in cardiovascular drug discovery, as traditional assays often fail to capture the complexity of thrombus formation under arterial shear conditions. The microfluidics-based thrombus profiling assay enables comprehensive, quantitative characterization of thrombus size, composition, and platelet activation, directly supporting predictive confidence in early-stage anti-thrombotic agent evaluation. This platform advances portfolio decision-making by providing mechanistic insights and robust risk assessment for candidate therapies targeting arterial thrombosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biomechanical pathways driving arterial thrombosis.
- Supports functional validation of targets involved in platelet activation and aggregation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying multiple thrombus biomarkers simultaneously.
- Improves predictive confidence for triaging anti-thrombotic candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for high-content screening of anti-thrombotic compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative multi-parametric readouts.
- Enables scalable, platform-based evaluation of compound efficacy under physiologically relevant shear conditions.
- Supports reliable comparison of compound effects on thrombus formation and biomarker expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro thrombus formation with disease-relevant arterial shear profiles.
- Provides translational biomarker data for continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive thrombus profiling.
- Supports mechanistic studies of arterial thrombosis relevant to human pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker validation for anti-thrombotic drug development.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical triggers and pathways of thrombogenesis for hypothesis testing and biological de-risking.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a physiologically relevant context.
- Analytics: Generates seven-dimensional thrombus profiles, enabling robust statistical comparison across conditions and compounds.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant arterial thrombosis mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic and imaging platform adaptable to diverse anti-thrombotic R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-thrombotic target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales multi-parametric thrombus analysis for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-thrombotic candidates based on comprehensive mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized instrumentation, including microfabrication and multi-channel fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different blood sources or disease models to ensure translational relevance.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret multi-dimensional thrombus profiles.
