Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese

Wir haben eine neue Methode entwickelt, die die biomechanischen Eigenschaften der Thrombose ausreichend erfassen und gleichzeitig prothrombotische Anomalien beim Menschen nachweisen kann. Zu Beginn verwenden Sie einen Siliziumwafer, um eine SU8-Photoresist-Masterform mittels Standardphotolithographie basierend auf dem Design herzustellen und die Masterform am Boden einer 15 Zentimeter großen Petrischuppel mit Klebeband zu befestigen. Bereiten Sie die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Mischung vor, indem Sie die Präpolymerbasis und das Aushärtungsmittel aus dem Silikon-Elastomer-Set im Verhältnis von 10 zu 1 mischen.

Gieße die PDMS-Mischung auf die Hauptform. Dann legen Sie die Platte mit dem PDMS-Gemisch in einen Vakuum-Desikator, um sie zu entmagnetisieren. Die PDMS-Mischung thermisch aushärten, indem Sie sie für zwei Stunden in einen auf 75 Grad Celsius eingestellten Inkubator legen.

Nachdem die Probe aus dem Inkubator entnommen wurde, schneiden Sie vorsichtig das ausgehärtete PDMS aus der Masterform heraus und teilen Sie das ausgehärtete PDMS in einzelne Chipeinheiten. Mit einer Sondennadel werden Löcher an den vorgesehenen Stellen gestanzt, um Ein- und Auslass zu schaffen. In einer chemischen Haube verwenden Sie ein mit 75 % benetztem Ethanol benetztes Arbeitstuch, um die Glasscheiben zu reinigen und zu trocknen.

Als Nächstes behandeln Sie mit einem Hochfrequenzgenerator die Glasschlitten 30 Sekunden lang und die PDMS-Chips 20 Sekunden. Richten Sie jeden Chip mit einem Glasschlitten aus und drücken Sie den Splitter vorsichtig auf die Glasschietenoberfläche, um ihn zu binden. Verbinden Sie die Geräte nun thermisch, indem Sie sie für 15 Minuten in einen Ofen stellen, der auf 150 Grad Celsius eingestellt ist.

Nach dem Verbinden werden die Geräte bei Raumtemperatur unter staubfreien Bedingungen aufbewahrt. Dann wird mit einer Zange der Kunststoffteil der Sondennadeln entfernt und die Metallrohre um 90 Grad gebogen, um Steckverbinder für die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Nachdem die Reaktionen zur Konjugation von Fibrinogen und benötigten Antikörpern mit Alexa Fluor eingerichtet wurden, zentrifugieren Sie die Reinigungssäulen bei 1.100 G für zwei Minuten, um den Speicherpuffer zu entfernen.

Nach dem Entsorgen des Durchflusses wird die Reaktionslösung fünf Minuten lang auf die Reinigungssäule geladen, die in einem kompatiblen Sammelfläschchen montiert ist und bei 1.100 G Zentrifuge gelagert, um die benötigte Mischung zu gewinnen. Mit einem Spektrophotometer misst man die Absorptionsfähigkeit des Proteins und des Farbstoffsignals. Berechnen Sie die Proteinkonzentration und das fluoreszenz-zu-protein-molare Verhältnis.

Die Farbstoffe bei vier Grad Celsius im Dunkeln aufbewahren. Gib Heparin zum Tyrodenpuffer zu einer Endkonzentration von 0,32 Einheiten pro Milliliter und 10 Millilitern zu entnehmendem Blut und bereite die Spritze vor, indem 500 Mikroliter Tyrodenpuffer bei pH 7,4 eingesaugt werden. Nachdem das Blut durch Venenpunktion in der heparinhaltigen Spritze gesammelt wurde, wird es in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen und bei 37 Grad Celsius gehalten.

Verdünne das Von-Willebrand-Faktormonomer auf zwei Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Schichten Sie die mikrofluidischen Geräte mit dem verdünnten von-Willebrand-Faktor-Monomer vor und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nun die Blutprobe mit einem fluoreszierenden Sensor, Einstellung 1 oder 2, für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Als Nächstes verbinden Sie ein mikrofluidisches Gerät mit Ein- und Auslassanschlüssen sowie Schläuchen. Verbinden Sie das andere Ende des Einlassanschlusses mit einem Rohr mit PBS und dann das andere Ende des Auslassanschlusses mit einer Spritze. Die Spritze wird auf eine Spritzenpumpe montiert und das mikrofluidische Gerät auf ein umgekehrtes Mikroskop.

Manövrieren Sie die Mikroskopstufe manuell, um die Stelle der Stenose zu lokalisieren. Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal und den Schlauch mit PBS und der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Inspiziere das Gerät, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen an der Stelle der Stenose vorhanden sind.

Schließen Sie den Einlassschlauch an die Blutprobe an und perfundieren Sie die Blutprobe durch den mikrofluidischen Kanal mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,018 Millilitern pro Minute. In einem invertierten Mikroskop stellen Sie die Belichtungszeit und den Verstärkungswert für jeden Fluoreszenzkanal in der Software ein. Führen Sie eine Echtzeit-Mehrfarb-Fluoreszenzbildaufnahme durch, indem Sie zwischen den vier Kanälen wechseln und jeweils einen Fluoro-4 anregen.

Stellen Sie die Fokusebene auf den Thrombus an und zeichnen Sie fluoreszierende Signale an der Stenosestelle für 15 bis 30 Minuten auf. Für die Datenanalyse öffnen Sie die Datendatei mit ImageJ Version 1.53. Verwenden Sie den SZ 22 fit C-Kanal, um die Kontur des Thrombus zu identifizieren.

Dann wähle ich mit Polygonauswahl grob die Fläche des Thrombus aus. Für jeden Kanal eliminieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie Bild auswählen, Anpassen auswählen und dann Schwellenwert auswählen. Schließlich messen Sie die Fläche und die durchschnittliche Signalintensität innerhalb des Thrombus, indem Sie Analysieren auswählen und Messung auswählen.

Repräsentative Schnappschüsse zeigten, dass sich Thromben im gesunden Blut innerhalb des stenotischen Kanals mit Thrombozyten, Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor und P-Selectin mit Sensorsatz 1 sowie Thrombozyten, Phosphatidylserin, E-positives Integrin alpha IIb beta 3, ein aktiviertes Integrin alpha IIb beta 3, visualisiert mit Sensorsatz 2, gebildet wurden. Ein einzelnes Fluoreszenzkanalbild wurde verarbeitet, indem der Thrombusbereich ausgewählt, das Hintergrundsignal entfernt und die Signalfläche sowie die durchschnittliche Helligkeit gemessen wurden, um eine quantitative Analyse zu ermöglichen. Die kontinuierliche Analyse der fluoreszenten Signalintensität über die Zeit erzeugte eine Signal-Zeit-Kurve für die Blutplättchenansammlung während der Thrombusbildung.

Für jeden Zeitpunkt wurden die Gesamtsignalintensitäten für vier Biomarker im Sensorsatz eins und vier Biomarker im Sensorsatz zwei ermittelt. Die Thrombusgröße wurde berechnet und ein siebendimensionales Thrombusprofil erzeugt. Derzeit ist kein Bioassay verfügbar, um die prothrombotische Tendenz menschlicher Patienten zu bewerten, und unsere Arbeit versucht, diese Lücke zu schließen.

Durch die Erkennung der biomechanischen Aktivität von Blutproben kann unser Test die prothrombotischen Eigenschaften der Probanden umfassend bewerten. Unser Assay kann zu einem klinischen Test zur Erkennung der prothrombotischen Tendenz bei Patienten entwickelt werden und auch zum Screening von Antithrombotika der nächsten Generation verwendet werden.