Name: Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Staphylococcus aureus menschliches Hämoglobin als Eisenquelle nutzt. Diese Methode identifiziert bakterielle Faktoren für die Eisenaufnahme und liefert Erkenntnisse für antimikrobielle Therapien.

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Diese Arbeit wurde von der US Public Health Service Zuschüsse AI69233 und AI073843 aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. EPS ist ein Burroughs Wellcome Fellow in der Pathogenese von Infektionskrankheiten. KPH wurde von der Cellular and Molecular Microbiology Training Grant Program 5 T32 A107611-10 finanziert.

Ein. Reinigung von Hämoglobin aus frischem Blut <ol><li> Erwerben frisches menschliches Blut mit einem Antikoagulans ergänzt. Halten Sie Blut auf Eis oder bei 4 ° C während der Reinigung. </li><li> Zentrifuge Blut für 20 min bei 1.500 x g beträgt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wird am Boden der Röhre liegen. Vorsichtig den Überstand aspirieren und sanft das Pellet in eiskaltem 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation und 3 x waschen. </li><li> Das Pellet in 1 Volumen eiskaltem 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dies induziert die Lyse der Erythrozyten durch osmotischen Druck. Fügen Toluol zu ~ 20% Endvolumen. </li><li> Inkubation bei 4 ° C auf einem Drehspieß Nacht. </li><li> Zentrifuge das Lysat bei 20.000 xg für 1 Stunde. Sammeln Sie die Mitte Hämolysat Bruchteil Verlassen des Toluol (floating on top) und Pellet unberührt. Verwenden Sie einen Langhals-Pipette auf die mittlere Fraktion zu sammeln. </li><li> Fahren Sie durch 0,44 um Spritzenfilter. Enthält die Lösung teilchenförmigenMaterie und nicht durch das Filter geleitet werden, Schritt 1.5. </li><li> Läutern Hämoglobin (Hb) mit einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Anionenaustauschersäule (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 um, 150 mm × 4,6 mm). Die mobile Phase A ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und die mobile Phase B ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% Gradienten von Lösungsmittel B ist über 2 min bei 2,0 ml / min Flussrate laufen. Die Elution wird basierend auf Absorption überwacht (λ: 410 nm und 280 nm). Sammeln nur den Bruch durch eine leuchtend rote Farbe und ein prominenter Absorptionspeak (Abbildung 1). </li><li> Dialysieren die Elution gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) über Nacht und dann für einige Stunden wieder. Sterilisieren, indem sie durch eine 0,22 um Spritzenfilter. </li><li> Um Hb-Konzentration zu messen, bereiten Standard-Hb-Lösungen bekannter Konzentrationen in PBS. Bestimmung der Konzentration von Hb in der Probe durch Mischen der Standard-Lösungen (siehe Tabelle mit den Reagenzien unsed) oder die Probenlösung mit 2x Drabkin-Reagenz (hergestellt aus Pulver) im Verhältnis 1:1. Beispielsweise mischen 100 ul Hb-Lösung mit 2x 100 ul Drabkin-Reagenz in 96-Well-Platten. Inkubieren für 15 min und Messung der Extinktion bei 540 nm. Plotten einer Standardkurve und bestimmen die Hb-Konzentration in der Probe. Fünf bis fünfzehn mg / ml Erträge sind typisch. </li><li> Führen 15-20 ug gereinigtes Hämoglobin auf einem 15% SDS-PAGE in zweifacher Ausfertigung. Flecken eines der Gele; übertragen die Proteine ​​aus einem anderen Gel auf eine Nitrocellulosemembran und Immunoblot für Hämoglobin (Abbildung 2). </li><li> Einfrieren und lagern 1 ml Aliquots von Hämoglobin in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 2. Herstellung von Eisen-Abbau Growth Media <ol><li> Planen Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Brühe durch Auflösen des Pulvers in RPMI Wasser, fügt Natriumhydrogencarbonat, wie vom Hersteller und 1% cassamino Säuren (CA) (w / v) empfohlen. Sterilisieren, indem sie durch einen 0,2 um Filter und Speicher refrigerated. </li><li> Planen Metall abgereicherten RPMI (NRPMI) durch Zugabe von 7% (w / v) Chelex 100 und Mischen über Nacht auf einer Rührplatte. Entfernen Chelex 100, indem sie durch einen 0,2 um Filter und gekühlt. Zuschlag Medien mit wesentlichen Nicht-Eisen-Metalle: 25 uM ZnCl 2, 25 uM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2 im Voraus als sterile 1.000 x Lösung hergestellt. Verwenden Sie Einweg-Kunststoff-Behältern für diesen Schritt, um Eisen Kontamination von wieder verwendbaren Lieferengpässe zu vermeiden. </li></ol> 3. Staphylococcus aureus Wachstum mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle <ol><li> Streak S. aureus zur Isolierung von tryptischen Soja-Agar (TSA) aus einem gefrorenen Lager. Bei 37 ° C für 20-24 Stunden. </li><li> Resuspendieren Ethylendiamin-N, N&#39;-Bis (2-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA) in wasserfreiem Ethanol zu 100 mM. EDDHA nicht in Lösung gehen, aber durch Ethanol sterilisiert. </li><li> Hinzufügen EDDHA zu RPMI bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM. ErlaubenEDDHA für mindestens 30 min, bevor zum nächsten Schritt aufzulösen. Aufgrund von Charge zu Charge Variation kann endgültigen EDDHA Konzentration müssen bis 0,25 mM abgesenkt werden, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen. </li><li> Beimpfen einzelne Kolonien von S. aureus in 5 ml RPMI mit EDDHA in 15 ml mit Schraubverschluss konische Röhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln mit 180 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 16-20 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Übernacht-Kulturen für 5 min bei 7.500 xg und das Pellet in NRPMI mit 0,5 mM EDDHA. Normalisieren OD 600 bis ~ 3. </li><li> Bereiten NRPMI mit 2,5 ug pro ml Hb und 0,1-1,0 mM EDDHA. Durch Variation zwischen den Losen kann die EDDHA Konzentration erforderlich, um freies Eisen in NRPMI Chelat variieren. </li><li> Subculture 10 ul der Bakteriensuspension von Schritt 3,5 in 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb in einem 15 ml mit Schraubverschluss konischen Rohr. </li><li> Inkubieren der Kulturen bei 37 ° C für bis zu 48 Stunden unter Schütteln bei 180 UpM oder einer Rolltrommel. </li><li&gt; Jeder 6-12 hr nehmen OD 600 Lesungen, indem 50 ul der Kultur und Mischen mit 150 ul PBS in 96-Well-Platten. </li></ol>

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<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Eisen ist ein wichtiger Nährstoff, die durch Organismen aus allen Reichen des Lebens 15 erforderlich. Bei Wirbeltieren wird Eisen sequestriert, um die Toxizität von diesem Element zu vermeiden. Diese Sequestrierung birgt auch Eisen aus eindringende Mikroben in einem Prozess als Nahrungsergänzungsmittel Immunität 16 bekannt. In Reaktion darauf haben die Erreger Strategien, Ernährung Immunität zu umgehen entwickelt. Ein solcher Mechanismus beruht auf Hämoglobin, das ist der häufigste Quelle von Eisen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> HPLC Anionenaustauschersäule </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkin-Reagenz </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Hämoglobin-Standard </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 Natrium-Form </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hämoglobin ein Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc. </td><td> SC-21.005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> CASO-Agar </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus wachstum mit menschlichen hämoglobins als eisenquelle

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus ist ein Bakterium, das Eisen durchzuführen lebenswichtige Stoffwechselfunktionen und Krankheiten verursachen erfordert. Das häufigste Reservoir von Eisen im menschlichen Wirt Häm, das der Cofaktor von Hämoglobin ist. Eisen aus Hämoglobin erwerben, S. aureus nutzt ein ausgeklügeltes System, wie der Eisen-regulierten Oberfläche Determinante (Isd) System 1 bekannt. Komponenten des Isd System zuerst bind Host Hämoglobin, dann extrahieren und importieren Häm, und schließlich befreien Eisen aus Häm in dem bakteriellen Zytoplasma 2,3. Dieser Weg ist durch zahlreiche in-vitro-Studien 4-9 wurden seziert. Ferner hat der Beitrag des Isd-System auf eine Infektion immer wieder in Mausmodellen 8,10-14 demonstriert. Gründung der Beitrag des Isd System Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme und das Wachstum hat sich als größere Herausforderung. Growth Assays mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle kompliziert by die Instabilität von handelsüblichen Hämoglobin, kontaminierenden freiem Eisen im Nährmedium und Toxizität mit Eisenchelatoren verbunden. Hier präsentieren wir eine Methode, die diese Beschränkungen überwindet. Hochqualitative Hämoglobin wird aus frischem Blut hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Gereinigtes Hämoglobin in ergänzt Eisen-Abbau Mediums imitiert die Eisen-armen Umgebung von Krankheitserregern in der Wirbeltier-Wirt gestoßen. Von hungernden S. aureus von freiem Eisen und Ergänzung mit einer minimal manipulierte Form von Hämoglobin zu induzieren wir Wachstum in einer Weise, die völlig abhängig von der Fähigkeit, Hämoglobin binden, zu extrahieren Häm, Häm passieren durch die bakterielle Zellwand und degradieren Häm im Zytoplasma ist. Dieser Test wird für Forscher, die die Mechanismen der hemoglobin-/heme-derived Eisenaufnahme in S. aufzuklären nützlich aureus und möglicherweise auch andere bakterielle Erreger.

Wir haben gereinigtes humanes Hämoglobin aus Hämolysat mit HPLC (Protocol Schritt 1,7). Abbildung 1 zeigt aufgezeichnete Absorption des Eluats bei 280 und 410 nm Wellenlänge. Fraktion 5 wurde gesammelt und anderen Fraktionen wurden verworfen. Ausbeuten von fünf bis fünfzehn Milligramm Hämoglobin pro Milliliter des Eluats werden typischerweise erworben. Gereinigtes Hämoglobin wurde durch SDS-PAGE analysiert und in doppelter Ausführung wurden die Gele entweder für Proteine ​​gefärbt oder auf Nitrocellulos...

Hier beschreiben wir ein Wachstum Assay für<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Hämoglobin als die alleinige Quelle der verfügbaren Nährstoff Eisen. Dieser Test stellt die Rolle der bakteriellen Faktoren in Hämoglobin-derived Eisenaufnahme beteiligt.

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Dieses Experiment testet die Fähigkeit von Staphylococcus aureus, menschliches Hämoglobin als alleinige Eisenquelle zu nutzen. Isolieren Sie zunächst rote Blutkörperchen aus frischem menschlichem Blut. Reinigen Sie das Hämoglobin durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um die Integrität des Hämoglobins zu gewährleisten.Geben Sie nun Hämoglobin in ein eisenarmes Medium, um das Eisen in Form von Hämoglobin zuzuführen. S reus. In Gegenwart von Hämoglobin und messen Sie seine Fähigkeit, Hämoglobin als Eisenquelle zu nutzen.Die Ergebnisse zeigen, dass sich Reus in Gegenwart von Hämoglobin als alleiniger Eisenquelle vermehrt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. ob ein Krankheitserreger Wirtsproteine als Eisenquellen nutzen kann und welche Mechanismen erforderlich sind, um Eisen mit diesem Verfahren zu nutzen. Diese Methode kann also einen Einblick in die Eisenaufnahme von Staphylokokken reus aus Hämoglobin geben.Es kann auch auf die Studien anderer Bakterien angewendet werden und darauf, wie sie eisenhaltige Proteine aus dem Wirt verwenden. GLA Ani und Catherine Haley aus meinem Labor werden diese Technik vorführen. Zuerst erhalt

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich...

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Quelle: Gupta, S., et al. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenlimitierten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen, um Eisenstress zu induzieren und die Sekretion von Siderophoren zu fördern, die das Überleben der Bakterien unterstützen.

Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen

Quelle: Maurakis, S., et al. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae zur Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallaufnahme aus Wirtsliganden. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video zeigt einen metallbegrenzten Bakterienwachstumsassay, um die Rolle von metallresponsiven Genen zu untersuchen. Wildtyp- und mutierte Bakterien, die in metallabgereichertem Medium gezüchtet werden, werden mit Metallliganden inkubiert und ihr Wachstum wird mit einem Plattenleser überwacht. Unter...

Metallbegrenzter bakterieller Wachstumsassay zur Untersuchung der Rolle von metallresponsiven Genen

Quelle: Behera, R.K. et al., Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Untersuchung der bakteriellen Genregulation in infizierten Geweben. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die Herstellung hämolytischer Staphylococcus aureus-Kulturen , um das Bakterienwachstum zu standardisieren und die metabolische Synchronisation für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien zu erreichen.

Vorbereitung einer hämolytischen Staphylococcus aureus-Kultur für Studien zur Wirts-Pathogen-Interaktion

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zum Nachweis der Zytotoxizität von virulenten und weniger virulenten Staphylococcus aureus-Stämmen gegen humane Neutrophile nach Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

Zytotoxizitätstest von Staphylococcus aureus-Stämmen an Neutrophilen nach Phagozytose

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion von Metaboliten von Staphylococcus aureus und deren anschließenden Analyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie.

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Wir beschreiben hier eine Methode für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae in metallbeschränkten flüssigen Medien, um die Expression von Genen für die Metallaufnahme zu erleichtern. Wir skizzieren auch nachgelagerte Experimente, um den Phänotyp von Gonokokken zu charakterisieren, die unter diesen Bedingungen angebaut werden. Diese Methoden können angepasst werden, um für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen in anderen Bakterien geeignet zu sein.

Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallakquise von Host Ligands

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie das Ausmaß der Internalisierung von Staphylococcus aureus und seine Überlebensfähigkeit in der menschlichen Wirtszelle sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen untersucht werden können.

Verbesserter Enzymschutzassay zur Untersuchung der Internalisierung von Staphylococcus aureus und der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Beurteilung des Überlebens von Antibiotika für Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zur Verfügung, indem wir Plasmide in P. aeruginosa und S. aureus transformieren, um Reporterstämme zu erzeugen und phänotypische Varianten, wie z.B. Persistere, durch Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.

Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Erfahren Sie, wie Staphylococcus aureus menschliches Hämoglobin als Eisenquelle nutzt. Diese Methode identifiziert bakterielle Faktoren für die Eisenaufnahme und liefert Erkenntnisse für antimikrobielle Therapien.

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

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