Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

Dieses Experiment testet die Fähigkeit von Staphylococcus aureus, menschliches Hämoglobin als alleinige Eisenquelle zu nutzen. Isolieren Sie zunächst rote Blutkörperchen aus frischem menschlichem Blut. Reinigen Sie das Hämoglobin durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um die Integrität des Hämoglobins zu gewährleisten.

Geben Sie nun Hämoglobin in ein eisenarmes Medium, um das Eisen in Form von Hämoglobin zuzuführen. S reus. In Gegenwart von Hämoglobin und messen Sie seine Fähigkeit, Hämoglobin als Eisenquelle zu nutzen.

Die Ergebnisse zeigen, dass sich Reus in Gegenwart von Hämoglobin als alleiniger Eisenquelle vermehrt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. ob ein Krankheitserreger Wirtsproteine als Eisenquellen nutzen kann und welche Mechanismen erforderlich sind, um Eisen mit diesem Verfahren zu nutzen. Diese Methode kann also einen Einblick in die Eisenaufnahme von Staphylokokken reus aus Hämoglobin geben.

Es kann auch auf die Studien anderer Bakterien angewendet werden und darauf, wie sie eisenhaltige Proteine aus dem Wirt verwenden. GLA Ani und Catherine Haley aus meinem Labor werden diese Technik vorführen. Zuerst erhalten Sie frisch isoliertes menschliches Blut, ergänzt mit einem Antikoagulans und halten Sie es während der gesamten Reinigung bei vier Grad Celsius Pelletieren Sie die roten Blutkörperchen durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 Gs. Aspirieren Sie die Schlinge vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in eiskalter, 0,9% iger Natriumchloridlösung Nach drei Wäschen, reanimation, suspendieren Sie das Pellet in einem Volumen eiskalter 10 Millimolar Triss, HCL zur Lyse der Erythrozyten durch osmotischen Druck.

Dann Toluol auf 20 % Endvolumen zugeben und über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren. Nächste Zentrifuge. Das Lysat bei 20.000 Gs pro Stunde.

Die mittlere Hämolysatfraktion wird aufgefangen, wobei die obere Toluolschicht und das Pellet ungestört bleiben. Führen Sie das Hämolysat durch einen 0,44-Mikrometer-Spritzenfilter. Wenn die Lösung Partikel enthält und nicht durch den Filter geleitet werden kann, wiederholen Sie die Hochgeschwindigkeitszentrifugation.

Reinigen Sie nun das Hämoglobin mit einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Anionenaustauschsäule. Verwenden Sie eine mobile Phase A mit 10 Millimolar Tris, HCL, und eine mobile Phase B mit 10 Millimolar Tris, HCL plus 0,5 molar Natriumchlorid. Lassen Sie einen Gradienten von 0 % bis 100 % Lösungsmittel B über zwei Minuten bei einer Durchflussrate von zwei Millilitern pro Minute laufen.

Überwachen Sie die Elution basierend auf der Absorption bei 410 Nanometern und 280 Nanometern. Sammeln Sie die Fraktion, die sich durch eine leuchtend rote Farbe und einen markanten Absorptionspeak auszeichnet. Dialysieren Sie die Elution gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung für ca. 16 Stunden.

Um die Probe zu sterilisieren, führen Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration. Bereiten Sie HP Standardlösungen in PBS vor. Mischen Sie nun die Standardlösungen bzw. die Probenlösungen mit zwei Röntgenreagen im Verhältnis eins zu eins in 96 Well-Platten nach einer 15-minütigen Inkubation messen Sie die Absorption bei 540 Nanometern.

Erstellen Sie eine Standardkurve und bestimmen Sie die HP-Konzentration der Proben von fünf bis 15 Milligramm pro Milliliter. Die Ausbeuten sind typische Laufaliquoten von 15 bis 20 Mikrogramm gereinigter Hämoglobinprobe auf zwei 15%-STS-Seitengelen. Färben Sie eines der Gele und übertragen Sie die Proteine aus einem anderen Gel auf eine Nitrozellulosemembran zum Immunblot für Hämoglobin, frieren Sie ein und lagern Sie einen Milliliter Aliquots des isolierten Hämoglobins in flüssigem Stickstoff aus einem gefrorenen Stock Streak S aureus auf Triptychon, Soja-Agar, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden.

Inokulieren Sie einzelne Kolonien in fünf Milliliter RPMI, die E-D-D-H-A enthalten, und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 180 RP M über Nacht. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 7.500 Gs. Dann resusen Sie die Bakterien, suspendieren Sie die Bakterien in RPMI, das 0,5 Millimolare E-D-D-H-A enthält, und normalisieren Sie sich auf einen OD 600 von etwa drei. Als nächstes bereiten Sie N-R-P-M-I mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, HB und 0,1 bis einem Millimolar E-D-D-H-A vor, um das freie Eisen zu chelatisieren.

Subkulturieren Sie nun 10 Mikroliter Bakteriensuspension in einen Milliliter N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP, inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius für bis zu 48 Stunden und schütteln Sie sie alle sechs bis 12 Stunden bei 180 RRP M. Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Kulturmischung mit 150 Mikrolitern PBS in 96-Well-Platten und messen Sie OD 600. Bei dieser HPLC-Aufreinigung von humanem Hämoglobin aus Hämolysat wird die Absorption von Eluat bei Wellenlängen von 280 und 410 Nanometern gemessen, wobei die fünfte Fraktion das Hämoglobin enthält.

In der Regel werden Gehalte von fünf bis 15 Milligramm Hämoglobin pro Milliliter pro Zubereitung erzielt. Das gereinigte Hämoglobin wurde mittels SDS-Seite in doppelter Form analysiert, und die Gele wurden entweder für Proteine stehen oder auf Nitrocellulose übertragen und immunblottiert. Als nächstes wurde das gereinigte menschliche Hämoglobin auf seine Fähigkeit getestet, das Wachstum von Wildtyp-Asus und ASUS zu unterstützen, denen der Hämoglobinrezeptor fehlt, der für die Aufnahme von Hämoglobin abgeleitetem Eisen erforderlich ist.

Die Zunahme der optischen Dichte der Kulturen im Laufe der Zeit deutet darauf hin, dass sich in N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb der Wildtyp ASUS vermehrt, die Mutante jedoch nicht. Im Gegensatz dazu ist die Fähigkeit, ergänztes freies Eisen zu verwerten, sowohl in Wildtyp- als auch in mutierten Stämmen identisch, keiner von beiden vermehrt sich in Abwesenheit einer Quelle. Bei diesem Vergleich von Medien, die mit Hämoglobin ergänzt werden, das aus frischem Blut gereinigt wurde, oder lyophilisiertem Hämoglobin, benötigt das aus Blut gereinigte Hämoglobin ISDB für das Wachstum.

Während lyophilisiertes Hämoglobin die Proliferation der ISDB-Mutante ermöglicht, kann eine ordnungsgemäße Reinigung des Hämoglobins nach der Beherrschung in wenigen Stunden abgeschlossen werden. Denken Sie daran, dass die Spender potenzielle Träger von durch Blut übertragbaren Krankheitserregern sind, also behandeln Sie menschliches Blut als biologisch gefährliches Material.