Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Beurteilung der Sicherheit einer Netzhautprothese zu verbessern. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche eines optimal fixierten enukleierten Auges mit Gewebefarbstoffen markiert wird, um die Position einer implantierten Elektrode anzugeben. Im zweiten Schritt wird das Elektrodenarray entfernt und das Augengewebe in Streifen zerlegt.

Anschließend werden die Streifen in Agar stabilisiert und danach in Paraffin eingebettet. Im letzten Schritt werden die markierten Bereiche von Interesse geschnitten und auf Objektträgern zur Färbung aufgebracht. Letztendlich kann die Gesundheit der implantierten Bereiche benachbart zu jeder Elektrode mittels Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass artefaktbedingte Fixierungsprobleme und Delamination minimiert werden können, während Geweberegionen in der Nähe der Elektrode bei großen Proben genau verfolgt werden können. Sie kann auch zur Beurteilung der Sicherheit neuer Implantate bei anderen Augenerkrankungen verwendet werden. Personen, die mit dieser Methode nicht vertraut sind, werden sie in der Regel als anspruchsvoll empfinden, da eine Netzhaut anfällig für Delamination ist und ein hohes Maß an Geschicklichkeit für die Handhabung der Proben erforderlich ist.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da das Markieren und Bearbeiten des empfindlichen Gewebes schwer zu erlernen ist. Vor dieser Studie wurden die Augen nach der Implantation mit einem suprachoroidalen Elektrodenarray mithilfe einer nicht optimalen Technik aufbereitet, wie durch den Stern angegeben. Dieses erste Bild zeigt einen repräsentativen orthogonalen Schnitt durch den Hohlraum des Elektrodenarrays.

Beachten Sie, dass die Netzhaut von dem äußeren Augengewebe abgelöst ist. Dies ist insbesondere unterhalb des implantierten Bereichs sichtbar, wie durch den Pfeil angezeigt. Beachten Sie außerdem, dass nicht feststellbar ist, welcher Bereich der Netzhaut jeweils an einer einzelnen Elektrode des Arrays lag.

Bei dieser höheren Vergrößerung sind mehrere regelmäßige, auf der Freisetzung basierende Artefakte in den Netzhautschichten vorhanden, wie durch die Pfeilspitzen angezeigt, sowie eine erhebliche Ablösung von der Torpedoschicht, der reflektierenden Schicht im feline Auge. Bei weiterer Vergrößerung ist zu erkennen, dass die äußeren Segmente der Photorezeptoren sowie das pigmentierte Epithel jedoch intakt bleiben, was darauf hindeutet, dass zuvor beobachtete Ablösungen oder artefaktbedingte Nebenwirkungen der Probenvorbereitung auftraten und nicht auf ein in-vivo-Trauma oder eine Pathologie zurückzuführen sind. Daher wurde die folgende Technik angewandt, um diese fixierungsbedingten Artefakte und Delaminationen zu minimieren.

Nach der Nukleation und Fixierung beginnen Sie damit, einen implantierten Augapfel aus Ethanol zu entnehmen und vorsichtig das überschüssige Gewebe, einschließlich der Bindehaut und der Sehnenscheide, zu entfernen. Kürzen Sie den Sehnerv auf eine Länge von zwei bis drei Millimetern. Das Elektrodenarray ist durch die halb durchscheinende Sklera sichtbar.

Verwenden Sie dann einen feinen Pinsel, um histologische Farbstoffe vorsichtig auf das Gewebe aufzutragen, um die Elektroden mit einem vordefinierten Farbcode zu markieren. Achten Sie darauf, dass die Farbe nicht verwischt. Zusätzliche Farbmarkierungen können angebracht werden, um interessierende Punkte zu definieren oder die Ausrichtung der Schnitte zu erleichtern.

Hier wurden die maximal stimulierten Elektroden mit Grün markiert. Die anderen aktiven Elektroden wurden mit Rot markiert. Die größeren Rückführungselektroden sind gelb gefärbt, und zusätzliche Führungen oder anatomische Markierungen wurden mit blauer Farbe gekennzeichnet.

Nach fünfminütigem Trocknen an der Luft wird das Bulbusgewebe erneut in 70 % Ethanol gegeben, um den Farbstoff zu dehydrieren. Danach wird das überschüssige Gewebe am unbehandelten Kontrollbulbus wie zuvor gezeigt entfernt und die acht Nylonfäden, die während der Kernentnahme und Fixierung angebracht wurden, verwendet, um den Kontroll- und den implantierten Bulbus als spiegelbildliches Paar auszurichten. Anschließend wird eine Silikonvorlage mit denselben Abmessungen wie das Elektrodenarray an einer entsprechenden spiegelbildlichen Position auf dem Kontrollbulbus platziert, die der Lage des Arrays im implantierten Auge entspricht.

Dann beschriften Sie die Kontrollkugel wie gerade gezeigt, sodass jede implantierte Elektrodensite ein Kontrollpaar an einer anatomisch vergleichbaren Position aufweist. Entfernen Sie anschließend das Implantatarray aus dem Auge und danach die vordere Augenpartie, einschließlich der Hornhaut, der Regenbogenhaut und der Linse. Entfernen Sie danach die Glaskörperflüssigkeit aus der verbleibenden Augentasse.

Nun dissezieren Sie das implantierte Auge in mehrere zwei Millimeter dicke Streifen, von denen jeder eine Teilmenge der mit Farbstoff markierten Bereiche enthält. Die Orientierung der Streifen sollte so gewählt werden, dass die Beurteilung verschiedener Aspekte der Gewebereaktion auf das Implantat erleichtert wird. Dokumentieren Sie sorgfältig die Position der Farbstoffmarkierungen an den Proben für zukünftige Referenzen.

Legen Sie anschließend den Streifen mit der Seite, die zuerst geschnitten werden soll, nach unten in eine flache Pfütze aus flüssigem Agar. Sobald das Agar erstarrt ist, schneiden Sie rund um die Probe und legen Sie diese in ein Gewebekästchen, das durch Schaumstoffeinsätze gestützt wird. Nach der Dissektion und Einbettung des Kontrollauges werden die Kästchen in neutral gepuffertes Formalin gegeben und über Nacht mithilfe einer standardmäßigen automatisierten Paraffineinbettungstechnik über 12 Stunden verarbeitet.

Am nächsten Tag das aufbereitete Gewebe in Paraffin einbetten, wobei die zuerst zu schneidende Seite nach unten weisen soll. Anschließend die Paraffinblöcke in fünf Mikrometer dünne Schnitte schneiden. Danach die Schnitte aus jedem der angefärbten Bereiche auf Objektträger aufbringen.

Um den DY-Bereich zu lokalisieren, überprüfen Sie die Objektträger regelmäßig unter dem Mikroskop. Die Bereiche, die unmittelbar an jeder gefärbten Stelle der Sklera angrenzen, entsprechen den Regionen, die der entsprechenden Elektrode aus dem Array am nächsten waren. Färben Sie die Schnitte abschließend nach Wunsch an.

Hoher Dynamikbereich. Makroaufnahmen eines enukleierten katzenartigen Auges mit einer suprachoroideal implantierten Elektrodenanordnung in situ werden nach Fixierung mit Davidson-Fixiermittel und vor der Entfernung der Anordnung gezeigt. Die durchscheinende Sklera ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Elektroden in der Anordnung.

Wie durch den Pfeil angezeigt, sind die Elektroden mit einem vordefinierten Farbschema markiert. Diese Farbmarkierungen, die in regelmäßigen Abständen zu anatomischen Landmarken angebracht sind, dienen der Gewährleistung von Konsistenz über verschiedene Experimente hinweg. Nach dem Entfernen des Elektrodenarrays wird das Auge von Hand in Probestreifen zerlegt.

Die Pfeilspitzen zeigen zwei der elektrodenadjazenten Stellen auf der Sklera. Die gestrichelte Linie markiert die Schnittebene in diesem repräsentativen Schnitt, der durch Zerschneiden der Probe aus der vorherigen Abbildung gewonnen wurde; die grobe Form des Probestreifens wurde mit minimalen differenziellen Gewebeartefakten erhalten. Beide Farbmarkierungen sind auf der Sklera weiterhin sichtbar, wie durch die Pfeilspitzen angegeben.

Obwohl der grüne Farbstoff widerstandsfähiger war als der rote, zeigt die Position des Farbstoffs den Ort einer Elektrode an. Daher kann das angrenzende Netzhautgewebe auf eventuell durch elektrische Stimulation verursächte Schäden untersucht werden; bei dieser Vergrößerung waren die Netzhautschichten neben dem grünen Farbstoff, der im vorherigen Bild zu sehen war, faktisch nicht abgelöst, und die Netzhautmorphologie blieb hier erhalten. In diesem ersten Bild sind repräsentative Spezialfärbungen und immunhistochemische Aufnahmen von Netzhautgewebeschnitten dargestellt, die gemäß dem vorliegenden Protokoll aufgearbeitet wurden.

Das Hämatin färbte die Zellkerne blau, während das Eosin das Zellzytoplasma, Kollagen und das Stützgewebe in verschiedenen Rosatönen anfärbte. In diesem Bild färbte Luxol Fast Blue das Myelin blau. Die Gegenfärbung mit Crestalviolett wurde verwendet, um die Ganglienzellen zu identifizieren, indem die Nissl-Körper innerhalb des perikaryalen Bereichs blau angefärbt und die umgebenden Satellitenzellen hervorgehoben wurden. In diesem mit Masons Trichromblau behandelten Schnitt färbte die Bric-Scarlet-Säure-Fusionslösung die Muskelfasern rot, während Linblau das Kollagen anfärbte.

In diesem Fall erscheint die Sklera blau, da für diesen Abschnitt die glykoproteinartigen Bestandteile der Basalmembran und die Bindegewebsbestandteile durch die Periodsäure-Schiff-Färbung lila gefärbt sind, während die Zellkerne durch die Gegengefärbung mit Hämalumin blau erscheinen. Der in diesem Bild gezeigte subsklerale Bereich wurde am Ort der Blutung mit Pearlscher Prussianblau-Lösung behandelt. Die Bildung von Hemosiderin aus abgebauten roten Blutkörperchen und die Freisetzung von Eisenkomplexen führten zu einer violett gefärbten Reaktion.

Die Zugabe von Neutralrot färbte die Lysosomen in diesem Bild rot, während Anti-Glutamin-Synthetase angefärbt wurde. Dieses, in Müller-Zellen vorkommende, neurotransmitterabbauende Enzym erscheint grün und erstreckt sich in beide Richtungen, wobei sich die Zellkörper der Müller-Zellen in der inneren Kernschicht befinden und ihr Endfuß die innere Begrenzungsmembran bildet. Dieses zytoskelettale Protein der schweren Kette wurde grün markiert und ist in den Zellkörpern sowie Fortsätzen nachweisbar; das Neurofilamentprotein vernetzt sich mit anderen Neurofilamenten, um die Struktur der Neuronen aufrechtzuerhalten.

Ganglienzellen und ihre Axone sind in der Ganglienzellschicht und der Nervenfaserschicht sichtbar, während die Axone der horizontalen Zellen, die sich am äußeren Rand der inneren Kernschicht der feline Retina befinden, grün erscheinen. In diesem Endbild ist das Zytoskelettprotein Glialfaszillesaures Protein in Rot dargestellt, das bei Gliose in Müllerzellen und Astrozyten proliferiert und entlang der Nervenfaserschicht sichtbar ist, wobei die Müllerzellen dünne Fortsätze von der inneren bis zur äußeren Retinaschicht bilden. Eine Gegenfärbung mit DAPI in Blau ermöglicht die Visualisierung der Retinaschichten.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich einen Beispielablauf dreidimensional vorzustellen und die Orientierung der Proben während des gesamten Verfahrens regelmäßig zu überprüfen. Nach Abschluss dieses Verfahrens können alle histologischen Methoden angewendet werden, um zusätzliche, sicherheitsrelevante Fragen zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher in der Entwicklung von bionischen Augen, um langfristig sichere Stimulationsniveaus für blinde Patienten zu ermitteln.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Sicherheit eines bionischen Netzhautimplantats beurteilt werden kann.