Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

Techniken zur Visualisierung von retinalen Zytoarchitektur direkt an einzelnen Elektroden innerhalb eines Retina-Stimulator.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Sicherheit von Netzhautprothesen besser zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche eines optimal fixierten enukleierten Auges mit Gewebefarbstoffen markiert wird, um die Position einer implantierten Elektrode anzuzeigen. Im zweiten Schritt wird der Elektrodenträger entfernt und das Augengewebe in Streifen präpariert.

Anschließend werden die Streifen in Agar stabilisiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Im letzten Schritt werden die markierten Interessenbereiche geschnitten und auf Objektträgern zum Färben gesammelt. Letztendlich kann der Zustand der implantierten Bereiche in der Nähe jeder Elektrode durch Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass fixationsbedingte Artefakte und Delaminationen minimiert werden können, während elektrodenbenachbarte Geweberegionen in großen Proben genau verfolgt werden können. Es kann auch zur Bewertung der Sicherheit neuer Implantate für andere Augenkrankheiten verwendet werden. Im Allgemeinen wird es für Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, eine Herausforderung darstellen, da eine Netzhaut anfällig für Delamination ist und ein hohes Maß an Geschicklichkeit für die Handhabung der Proben erforderlich ist.

visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da das Markieren und Hantieren mit dem fragilen Gewebe schwer zu erlernen ist. Vor dieser Studie wurden die Augen nach der Implantation mit einem suprachoroidalen Elektrodenarray mit einer nicht optimalen Technik bearbeitet, wie durch den Stern angezeigt. Dieses erste Bild zeigt einen repräsentativen orthogonalen Schnitt durch den Elektrodenarray-Hohlraum.

Beachten Sie, dass sich die Netzhaut vom äußeren Augengewebe löst. Dies ist besonders deutlich unter dem implantierten Bereich, wie durch die Pfeilspitze angedeutet. Es ist auch zu beachten, dass es nicht möglich ist zu bestimmen, welcher Teil der Netzhaut an jede einzelne Elektrode des Arrays angrenzt.

In dieser höheren Vergrößerung gibt es mehrere auf regelmäßiger Freisetzung basierende Artefakte in den Netzhautschichten, wie durch die Pfeilspitzen angezeigt, sowie eine größere Ablösung von der Torpedoschicht, der reflektierenden Schicht im Katzenauge. Bei weiterer Vergrößerung kann beobachtet werden, dass die äußeren Segmente der Photorezeptoren sowie das pigmentierte Epithel jedoch intakt bleiben, was darauf hindeutet, dass zuvor beobachtete Ablösungen oder künstliche Nebenwirkungen der Verarbeitung im Gegensatz zu einem in vivo Trauma oder einer Pathologie resultieren. Daher wurde die folgende Technik implementiert, um diese fixationsbedingten Artefakte und Delaminationen zu minimieren.

Nach der Keimbildung und Fixierung der Augen beginnen Sie damit, einen implantierten Augengloben aus Ethanol zu entfernen und das überschüssige Gewebe, einschließlich der Bindehaut und der Sehnenkapsel, vorsichtig abzuschneiden. Schneiden Sie den Sehnerv auf eine Länge von zwei bis drei Millimetern ab. Das Elektrodenarray ist durch die halbdurchsichtige Sklera sichtbar.

Tragen Sie dann mit einem feinen Pinsel vorsichtig histologische Farbstoffe auf das Gewebe auf, um die Elektroden mit einem vordefinierten Farbcode zu beschriften. Achten Sie darauf, die Farbe nicht zu verschmieren. Zusätzliche Farbmarkierungen können vorgenommen werden, um Points of Interest zu definieren oder die Ausrichtung von Abschnitten zu erleichtern.

Hier wurden die maximal stimulierten Elektroden grün markiert. Die anderen aktiven Elektroden wurden rot markiert. Die Rückführelektroden mit größerem Durchmesser wurden gelb eingefärbt, und alle zusätzlichen Führungen oder anatomischen Markierungen wurden mit blauem Farbstoff markiert.

Nach fünf Minuten Lufttrocknung setzen Sie die Kugel wieder auf 70 % Ethanol, um den Farbstoff zu dehydrieren. Nachdem Sie das überschüssige Gewebe aus dem nicht gepflanzten Kontrollaugenglobus abgeschnitten haben, wie gerade gezeigt, verwenden Sie die acht Nylonnähte, die während des Nukleations- und Fixationsschritts angebracht wurden, um die Kontrollaugen und die implantierten Augen als gespiegeltes Paar auszurichten. Platzieren Sie dann eine Silikonschablone mit den gleichen Abmessungen wie das Elektrodenarray auf einer gespiegelten Stelle auf der Steuerung I, die der Position des Arrays im implantierten Auge entspricht.

Beschriften Sie dann den Kontrollglobus als gerade demonstriert, so dass jede implantierte Elektrodenstelle ein Kontrollpaar an einer anatomisch vergleichbaren Stelle hat. Entfernen Sie als Nächstes das Implantat-Array aus dem Auge und entfernen Sie dann die Vorderseite des Auges, einschließlich der Hornhaut, der Iris und der Linse. Entfernen Sie anschließend die Glasflüssigkeit aus der restlichen Augenmuschel.

Präparieren Sie nun das implantierte Auge in mehrere zwei Millimeter dicke Streifen. Jeder enthält eine Teilmenge der gestanzten markierten Bereiche. Die Ausrichtung der Streifen sollte so gewählt werden, dass sie bei der Beurteilung verschiedener Aspekte der Gewebereaktion auf das Implantat hilft und die Position der Stanzmarkierungen auf den Proben für zukünftige Referenzen sorgfältig dokumentiert.

Legen Sie dann den Streifen mit der zu schneidenden Seite zuerst nach unten in ein flaches Becken aus verflüssigtem Agar. Sobald der Agar fest geworden ist, schneiden Sie um die Probe herum und legen Sie sie in eine Gewebekassette, die von Schaumstoffeinlagen getragen wird. Nach dem Präparieren und Einbetten des Kontrollauges legen Sie die Kassetten in eine neutral gepufferte Form und verarbeiten sie über Nacht mit einer standardmäßigen automatisierten 12-Stunden-Paraffinverarbeitungstechnik.

Am nächsten Tag betten Sie das aufbereitete Gewebe mit der zu schneidenden Seite zuerst nach unten in Paraffin ein. Schneide nun die Paraffinblöcke in fünf Mikrometer-Abschnitte. Montieren Sie dann die Abschnitte aus jeder der eingefärbten Regionen auf Objektträger.

Um den DY-Bereich regelmäßig zu lokalisieren, überprüfen Sie die Objektträger unter dem Mikroskop. Die Regionen, die unmittelbar an jeden gefärbten Punkt der Sklera angrenzen, sind diejenigen, die sich in unmittelbarer Nähe der entsprechenden Elektrode aus dem Array befanden. Zum Schluss färben Sie die Abschnitte wie gewünscht.

Hoher Dynamikbereich. Makrofotografien eines enukleierten Katzenauges mit einem suprachoroidalen Elektrodenarray in situ werden nach der Fixierung mit dem Davidson-Fixativ und vor der Entfernung des Arrays gezeigt. Die transluzente Sklera ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Elektroden im Array.

Wie mit der Pfeilspitze angedeutet, sind die Elektroden mit einem vordefinierten Farbschema gekennzeichnet. Diese Farbstoffmarkierungen, die in regelmäßigem Abstand zu anatomischen Orientierungspunkten platziert werden, werden verwendet, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten. Nach der Entnahme des Elektrodenarrays wird das Auge von Hand in Probenstreifen präpariert.

Die Pfeilspitzen zeigen zwei der an die Elektrode angrenzenden Stellen auf der Sklera an. Die gestrichelte Linie zeigt die Schnittebene in diesem repräsentativen Schnitt, die durch das Schneiden der Probe aus der vorherigen Abbildung erhalten wurde, wobei die grobe Form des Probenstreifens mit minimalen unterschiedlichen Gewebeartefakten erhalten blieb. Beide Farbstoffmarkierungen sind noch auf der Sklera sichtbar, wie die Pfeilspitzen anzeigen.

Obwohl der grüne Farbstoff elastischer war als der rote, zeigt die Position des Farbstoffs die Position einer Elektrode an. Daher kann das angrenzende Netzhautgewebe auf die durch elektrische Stimulation verursachte Schädigung, falls vorhanden, untersucht werden, wie bei dieser Vergrößerung zu sehen ist, die Netzhautschichten, die an den grünen Farbstoff in dem vorherigen Bild angrenzen, wurden faktisch nicht abgelöst, und die Netzhautmorphologie wurde hier beibehalten. In diesem ersten Bild sind repräsentative Spezialfärbungen und Immunhistochemie von Netzhautgewebeschnitten, die nach dem aktuellen Protokoll bearbeitet wurden, zu sehen.

Hämatin färbte die Zellkerne blau, während das Eoin das Zellzytoplasma, das Kollagen und das Stützgewebe färbte, verschiedene Rosatöne In diesem Bild färbte das luxuriöse schnelle Blau das Myelinblau. Die krestal-violette Gegenfärbung wurde verwendet, um die Ganglienzellen zu identifizieren, indem die Raketenkörper im Peric-Blau gefärbt und die umgebenden Satellitenzellen hervorgehoben wurden. In diesem mit Trion Blau behandelten Abschnitt dieses Maurers färbte die BRIC Scarlet Acid Fusion Solution die Muskelfasern rot, während das Lin Blau das Kollagen färbte.

In diesem Fall erscheint das Sklerablau für diesen Abschnitt, das durch periodischen Säureschiff gefärbt wurde, die Glykoproteinkomponenten der Basalmembran und die Bindegewebskomponenten violett, während die Hämattoin-Gegenfärbung der Zellkerne blau erscheinen. Der subsklerale Abschnitt, der in diesem Bild zu sehen ist, wurde an der Stelle der Blutung mit Perlmutt-Preußischblau behandelt. Die Bildung von Hämosiderin aus abgebauten roten Blutkörperchen und die Freisetzung von Eisenkomplexen erzeugten eine violette Farbe.

Die Zugabe von neutralem Rot färbte die Lysosomen in diesem Bild rot, Anti-Glutamin Synthes wurde gefärbt. Dieses Neurotransmitter-abbauende Enzym, das in grünen Mueller-Zellen vorkommt, erstreckt sich in beide Richtungen, wobei sich die Mueller-Zellkörper innerhalb der inneren Kernschicht und der Mueller-Zellendnahrung ausdehnen und die innere Grenzmembran für die Färbung des Neurofilament-Proteins bilden. Dieses schwerkettige Zytoskelettprotein wurde als grün markiert und befindet sich im Zellsoma und verarbeitet die Vernetzung des Neurofilamentproteins mit anderen Neurofilamenten, um die Struktur der Neuronen aufrechtzuerhalten.

Ganglienzellen und ihre Axone sind in den Ganglienzell- und Nervenfaserschichten zu beobachten, während die Axone der horizontalen Zellen, die sich am äußeren Rand der inneren Kernschicht in der Netzhaut der Katze befinden, grün erscheinen. In diesem letzten Bild ist das saure Protein der Gliafaser zu sehen: Dieses Zytoskelettprotein in Rot proliferiert in Mueller-Zellen und Astrozyten während der Gliose und ist zu sehen, wie es die Nervenfaserschicht auskleidet, wobei Mueller-Zellen dünne Fortsätze durch die inneren zu den äußeren Netzhautschichten bilden. Die Gegenfärbung mit einer DPI in Blau ermöglicht die Visualisierung der Netzhautschichten.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen Probenablauf in drei Dimensionen zu visualisieren und die Ausrichtung der Proben während des gesamten Verfahrens regelmäßig zu berücksichtigen. Nach diesem Verfahren können alle histologischen Methoden verwendet werden, um zusätzliche sicherheitsrelevante Fragen nach der Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher in der bionischen Augenentwicklung, um die sicheren Stimulationsniveaus für blinde Patienten langfristig zu bewerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sicherheit eines bionischen Augenimplantats bewerten können.