Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinale Prothesen mit harten Metallbestandteilen sind nicht mit herkömmlichen histologischen Verfahren kompatibel. Hier beschreiben wir Techniken zur Beurteilung der Gesundheit des Auges direkt benachbart zu einem epiretinal befestigten retinalen Implantat mit einem metallenen T. Dies wird erreicht, indem das Auge zunächst gemäß dem in einem begleitenden Video beschriebenen Protokoll fixiert und präpariert wird und anschließend eine Gewebeprobe, die das Implantat und das retinale T umfasst, präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebeprobe schrittweise zu dehydrieren und sie dann in einer zweistufigen Einbettung in einem Epoxidharz in der gewünschten Orientierung zu verarbeiten. Danach wird der endgültige Harzblock in einer speziellen Halterung befestigt und schrittweise abgeschliffen, bis ein Querschnitt durch das Implantat und das umgebende okulare Gewebe auf der gewünschten Ebene freigelegt ist.

Der letzte Schritt besteht darin, das exponierte Gewebe oberflächlich anzufärben und anschließend mit einem hochauflösenden Auflichtmikroskop abzubilden und zu fotografieren, um die zelluläre Architektur in der Nähe der implantierten Prothese sichtbar zu machen. Diese Schritte werden dann nach Bedarf mehrfach wiederholt. Letztendlich wird eine Reihe von Querschnittsbildern durch die Gewebeprobe, einschließlich der Prothese im situ, aufgenommen, die zur Optimierung des Gerätedesigns oder der chirurgischen Vorgehensweise sowie zur Beurteilung der Sicherheit der jeweiligen Prothese herangezogen werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der traditionellen histologischen Schnitttechnik mit Schneidemessern besteht darin, dass im Herzen implantierte Objekte, einschließlich metallischer Komponenten, während des Verfahrens in situ verbleiben können, was die Visualisierung der Grenzfläche zwischen Implantat und Gewebe ermöglicht. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Netzhautprothese beantworten, beispielsweise die Beurteilung der strukturellen Integrität des empfindlichen okularen Gewebes in der Nähe einer implantierten Netzhautprothese. Nach der Enukleation des Auges und der Fixierung, wie in einem begleitenden JoVE-Video beschrieben, visualisieren Sie die Prothese und die Stelle, an der sie an der Außenseite des Auges befestigt ist.

Unter Verwendung einer 15-Grad-Klinge wird ein zirkumferentieller transkornealer Schnitt angelegt und die Hornhautkappe entfernt, um das Innere des Augapfels freizulegen. Beachten Sie, dass die Linse im Rahmen der vorausgegangenen Lensektomie-Vitrektomie, die Teil des chirurgischen Verfahrens für diese epiretinale Implantation ist, bereits entfernt wurde.

Desinfizieren Sie anschließend, setzen Sie die Iris ein und entfernen Sie alle verbleibenden Z-Fasern der Linse, um die hintere Augenkammer mit dem epiretinalen Implantat und dem metallischen T in situ freizulegen. Entfernen Sie je nach Implantat und durchgeführter Studie überflüssige Komponenten, bevor Sie die Präparation fortsetzen. Im vorliegenden Beispiel besteht das zu evaluierende epiretinale Array aus einem prototypischen hermetischen Gehäuse mit Diamant-Elektrode und Elektronikbauteilen, das in einem formangepassten Silikonträger untergebracht ist.

Dissezieren Sie vorsichtig eine Probe, die den Tack und das umgebende Gewebe in der gewünschten Orientierung enthält. Schneiden Sie mit feinen Dissektionscheren vollständig durch die Dicke reichende Streifen von der Augenhinterseite ab, einschließlich Sklera, Choroidea und Retina. Entfernen Sie hier sorgfältig das Diamant-Elektrodenpaket durch feine Dissektion mit dem Skalpell.

Lassen Sie den Silikonkörper des Implantats zusammen mit der Netzhautklammer und den Resten der Platindrähte zurück. Entnehmen Sie eine Probe, die einen Längsschnitt durch die Klammer zeigt und alle Netzhautschichten in der Nähe der Klammer erfasst. Danach bringen Sie die Probe zurück in 70 % Ethanol.

Trocknen Sie die Probe über drei Tage in fortschreitenden Ethanol-Stufen. Zuerst wird die Probe zweimal zwei Stunden lang in 70 % Ethanol dehydriert. Anschließend wird die Probe zweimal zwei Stunden lang in 80 % Ethanol dehydriert und am nächsten Tag über Nacht zweimal zwei Stunden lang in 90 % Ethanol. Danach wird die Probe zweimal zwei Stunden lang in 100 % Ethanol dehydriert und anschließend über Nacht.

Entwässern Sie die Probe abschließend zweimal für jeweils zwei Stunden in 100 % Aceton. Entfernen Sie die Probe aus dem Aceton und betrachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop, während sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknet. Das Entfernen der Flüssigkeit aus den Weichgeweben führt zum Kollaps der Zellen und zu Schrumpfungserscheinungen.

Die Probe wird kurz bevor sie anfängt, sich aufzurollen und zusammenzufallen, in Epoxidharz überführt. Der Zeitpunkt, zu dem das Aufrollen und Zusammenfallen des Gewebes eintritt, wird mit Erfahrung eingeschätzt. Um die Probe in klarem Epoxidharz einzubetten, tauchen Sie das Augengewebe in eine flüssige Epoxidharzlösung in einem geeigneten verschließbaren Behälter.

Entgasen Sie den Epoxidharz vorsichtig in einer Vakuumkammer und lassen Sie ihn zur Aushärtung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Achten Sie darauf, die Probe in der gewünschten Orientierung einzubetten, indem Sie den ausgehärteten Epoxidblock und die Probe mit einer Bandsäge und einer Raspel entsprechend zurechtschneiden. Platzierten Sie den zurechtgeschnittenen Block mit dem Augengewebe in frischem, flüssigen Epoxidharz so, dass die Längsachse der Probe parallel zum Boden der Form ausgerichtet ist. Befestigen Sie die zurechtgeschnittene Probe mit einem Tropfen Sekundenkleber am Boden des Probenhalters.

Füllen Sie den Probenhalter mit flüssigem Epoxidharz und entgasen Sie wie zuvor beschrieben, lassen Sie anschließend über Nacht aushärten. Danach montieren Sie das Harz in einem Schleifprobenhalter und schleifen die Probe manuell bei 230 bis 250 U/min unter Zufuhr von Wasser mit Siliziumkarbid-Papier. Zum Anfärben tauchen Sie die geschliffene Oberfläche drei bis fünf Minuten oder bis zur sichtbaren Färbungsentwicklung in Toluidinblau-Färbemittel.

Nachdem die Probe mit Leitungswasser gespült wurde, bildet die geschliffene Oberfläche des Präparats mit einem Stereomikroskop höherer Vergrößerung ab. Um die zellulären Schichten der Netzhaut sichtbar zu machen, gibt man einen Tropfen destilliertes Wasser auf die obere Oberfläche des Epoxys direkt über dem Präparat, um die Beugung an der Grenzfläche Luft-Epoxidharz zu verringern.

Verwenden Sie eine Lichtquelle mit optischem Faser-Schwanenhals, um die Probe zu beleuchten. Wiederholen Sie die Schritte des Mahlens und der Bildaufnahme jedes Mal, nachdem eine voreingestellte Dicke der Probe abgetragen wurde. Das minimale präzise und reproduzierbare Mahlintervall des Probenträgers beträgt 20 Mikrometer.

Dieser Vorgang wird schrittweise wiederholt, bis ein Querschnitt durch das Implantat und das umgebende okulare Gewebe auf der gewünschten Ebene freigelegt ist. Hier sind Beispielbilder von Retinagewebe, das unmittelbar neben einem titanbasierten Netzhaut-T-Befestigungselement an verschiedenen Stellen während des Schleifvorgangs sichtbar gemacht wurde. Die Bilder zeigen Längsschnitte des Tacks, der durch das Auge hindurchgeht und in die benachbarte Sklera austritt, sowie das anliegende Silikon und mit Toluidinblau gefärbtes und ungefärbtes Retinagewebe.

Ein nicht artefaktbedingtes Netzhautablösung und -falten ist auf beiden Seiten des Silikons bei niedriger und hoher Vergrößerung sichtbar. Der Tackenschaft ist im Silikon eingebettet sichtbar, und der Kopf der Tacke hat die Netzhaut und die Sklera durchdrungen. Hier zeigt sich deutlich, dass eine nicht artefaktbedingte Netzhautablösung in der ungefärbten Netzhaut auf beiden Seiten des Silikons bei niedriger und hoher Vergrößerung vorliegt.

Das Beispiel hat gezeigt, dass eine Netzhaut-Desorganisation benachbart zum Tack sowie eine Kompression der Netzhaut auf einer Seite aufgrund eines schrägen Einfügewinkels vorliegt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe sorgfältig einzubetten, auszurichten und einzulegen, sodass die resultierenden Schliffebenen in der gewünschten Ebene ausgerichtet sind. Darüber hinaus sollten in jedem Schleifschritt mehrere Fotografien angefertigt werden, da die geschliffenen Proben heute nicht mehr zurückgewonnen werden können.

Diese Methode kann Einblicke in die Histologie von Netzhautprothesen liefern. Sie kann außerdem zur Visualisierung der Schnittstelle zwischen Gerät und Gewebe in anderen Systemen angewendet werden, die feste implantierte Komponenten verwenden, wie beispielsweise Tiefenhirnimplantate, vaskuläre Stents oder orthopädische Prothesen.