Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Netzhautprothesen mit Hartmetallkomponenten sind mit herkömmlichen histologischen Verfahren nicht kompatibel. Hier beschreiben wir Techniken zur Beurteilung der Gesundheit des Auges, das direkt an ein retinales implantatgesichertes epiretinales Auge mit einem Metall-T angrenzt.Dies wird erreicht, indem zuerst das Auge gemäß dem in einem Begleitvideo beschriebenen Protokoll nukleiert und fixiert wird und dann eine Gewebeprobe präpariert wird, die das Implantat und das retinale T umfasst.Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebeprobe schrittweise zu dehydrieren und sie dann in ein Epoxidharz einzubetten. die gewünschte Orientierung durch einen zweistufigen Einbettungsprozess zu erreichen. Anschließend wird der finale Kunststoffblock in eine spezielle Halterung montiert und schrittweise abgeschliffen, bis ein Querschnitt durch das Implantat und das umgebende Augengewebe auf der gewünschten Höhe freigelegt ist.

Der letzte Schritt besteht darin, das freiliegende Gewebe oberflächenfärblich zu färben und dann mit einem Hochleistungs-Dissektionsmikroskop abzubilden und zu fotografieren, um die zelluläre Architektur neben der implantierten Prothese sichtbar zu machen. Diese Schritte werden dann bei Bedarf mehrmals wiederholt. Letztendlich wird eine Reihe von Schnittbildern durch die Gewebeprobe, einschließlich des Implantats in situ, gesammelt und kann verwendet werden, um das Design des Geräts oder der Operation zu verfeinern sowie bei der Beurteilung der Sicherheit der speziellen Prothese zu helfen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der traditionellen klingenbasierten Schneidhistologie besteht darin, dass herzimplantierte Objekte, einschließlich metallischer Komponenten, während des Eingriffs in situ bleiben können, was eine Visualisierung der Schnittstelle des Implantatgewebes ermöglicht. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Netzhautprothesen beantworten, wie z. B. die Beurteilung der strukturellen Integrität des empfindlichen Augengewebes, das an eine implantierte Netzhautprothese angrenzt. Nach der Enukleation des Auges und der Fixierung, wie in einem begleitenden JoVE-Video beschrieben, visualisieren Sie das Implantat und den Punkt, an dem es an der Außenseite des Auges befestigt ist.

Mit einer 15-Grad-Klinge. Machen Sie einen umlaufenden transhornealen Schnitt und entfernen Sie die Hornhautkappe, um das Innere des Augapfels freizulegen. Beachten Sie, dass die Linse zuvor während der Linsensektomie-Vitrektomie entfernt wurde, die Teil des chirurgischen Eingriffs für dieses epiretinale Implantat ist.

Dann disinieren, die Iris und alle verbleibenden Z-Fasern der Linse einführen, um die Hinterkammer mit dem epiretinalen Implantat und das Metall-T in situ freizulegen. Je nach Implantat und durchgeführter Studie sind vor der weiteren Dissektion Fremdbestandteile zu entfernen. Im vorliegenden Beispiel besteht das evaluierte epiretinale Array aus einem Prototyp einer hermetischen Diamantelektrode und einem Elektronikgehäuse, das in einem konformen Silikonträger untergebracht ist.

Präparieren Sie vorsichtig eine Probe, die die Reißzwecke und das umgebende Gewebe in der gewünschten Ausrichtung umfasst. Schneide mit einer feinen Präparierschere Streifen in voller Dicke aus dem Augenhintergrund, einschließlich Sklera, Aderhaut und Netzhaut. Hier wird das Diamantelektrodenpaket vorsichtig durch feine Dissektion mit dem Skalpell extrahiert.

Lassen Sie den Silikonkörper des Implantats zusammen mit dem Netzhautkleber und den Resten der Platinverdrahtung. Entnehmen Sie eine Probe, die einen Längsschnitt der Reißzwecke zeigt, der alle an die Reißzwecke angrenzenden Netzhautschichten zeigt. Geben Sie dann die Probe an 70% Ethanol zurück.

Dehydrieren Sie die Probe über drei Tage in progressiven Ethanolstufen. Dehydrieren Sie die Probe zunächst zweimal zwei Stunden lang in 70%igem Ethanol. Als nächstes dehydrieren Sie die Probe zweimal zwei Stunden lang in 80 % Ethanol und dann am nächsten Tag über Nacht in 90 % Ethanol für zwei Stunden, fahren Sie fort, die Probe zweimal zwei Stunden lang in 100 % Ethanol zu dehydrieren, und dann über Nacht.

Zum Schluss dehydrieren Sie die Probe zweimal zwei Stunden lang in 100%igem Aceton. Nehmen Sie die Probe aus dem Aceton und beobachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop, während sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknet. Das Entfernen von Flüssigkeit aus den Weichteilen führt zum Kollaps der Zellen und zur Schrumpfung.

Die Probe wird auf Epoxidharz übertragen, kurz bevor sie sich zu kräuseln und zu kollabieren beginnt. Mit der Erfahrung wird ein Verständnis dafür entwickelt, wann sich das Gewebe kräuselt und kollabiert. Um die Probe in klares Epoxidharz einzubetten, tauchen Sie das Augengewebe in verflüssigtes Epoxidharz in einen geeigneten verschließbaren Behälter.

Entgasen Sie das Epoxidharz vorsichtig in einer Vakuumkammer und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Achten Sie darauf, die Probe in die gewünschte Ausrichtung einzubetten, indem Sie die Größe des ausgehärteten Epoxidharzes und der Probe mit einer Bandsäge und einem Rohrblatt ändern. Der verkleinerte Block, der das Augengewebe in frischem verflüssigtem Epoxidharz enthält, so dass die Längsachse der Reißzwecke parallel zum Boden der Form ausgerichtet ist. Verwenden Sie einen Fleck Sekundenkleber, um die Größenänderungsprobe an der Unterseite des Probenhalters zu befestigen.

Füllen Sie den Probenhalter mit verflüssigtem Epoxidharz und entgasen Sie ihn wie zuvor und lassen Sie ihn über Nacht aushärten. Montieren Sie dann das Harz in einen Schleifprobenhalter und schleifen Sie die Probe manuell bei 230 bis 250 U/min mit dem Wasser auf Silikonkarbidpapier. Tauchen Sie zum Färben die geschliffene Oberfläche drei bis fünf Minuten lang in toinblauen Fleck oder bis sich der Fleck bildet.

Nachdem Sie die Probe mit Leitungswasser gespült haben, bilden Sie die geschliffene Oberfläche der Probe mit einer Dissektion mit höherer Leistung ab. Umfang. Um die Zellschichten der Netzhaut sichtbar zu machen, tragen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberseite des Epoxidharzes direkt über der Probe auf. Um die Beugung an der Luft-Epoxid-Grenzfläche zu glätten.

Verwenden Sie eine optische Glasfaser-Schwanenhals-Lichtquelle, um die Probe zu beleuchten. Wiederholen Sie die Schleif- und Bildgebungsschritte jedes Mal, wenn Sie eine voreingestellte Probendicke abschleifen. Das minimale präzise und reproduzierbare Schleifinkrement des Probenhalters beträgt 20 Mikrometer.

Dieser Vorgang wird schrittweise wiederholt, bis ein Querschnitt durch das Implantat und das umgebende Augengewebe auf der gewünschten Höhe freigelegt ist. Gezeigt. Hier sind Beispielbilder von Netzhautgewebe, das unmittelbar neben einem retinalen T aus Titan an verschiedenen Stellen während des Schleifprozesses visualisiert wurde. Die Bilder zeigen Längsschnitte der Reißnase, die durch das Auge eindringen und aus der Sklera austreten, angrenzend an Silikon und Toluidinblau, gefärbte und ungefärbte Netzhaut.

Nicht-künstliche Netzhautablösung und -faltung sind auf beiden Seiten des Silikons sowohl bei niedriger als auch bei hoher Leistung zu sehen. Der Heftschaft ist sichtbar in Silikon eingebettet, und der Kopf des Reißnagels ist in die Netzhaut und Sklera eingedrungen. Hier ist es offensichtlich, dass es eine nicht künstliche Netzhautablösung in der ungefärbten Netzhaut auf beiden Seiten des Silikons gibt, die sowohl bei niedriger als auch bei hoher Leistung sichtbar gemacht wird.

Das Beispiel hat gezeigt, dass es aufgrund eines schrägen Einführwinkels zu einer retinalen Desorganisation neben der Klebrigkeit und einer Kompression der Netzhaut auf einer Seite kommt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Probe sorgfältig einzubetten, auszurichten und zu reeden, so dass die resultierenden geschliffenen Oberflächen im gewünschten Plan ausgerichtet sind. Darüber hinaus sollten bei jeder Mahlstufe mehrere Fotos gesammelt werden, da die gemahlenen Proben heute nicht mehr gewonnen werden können.

Diese Methode kann Aufschluss über die Histologie von Netzhautprothesen geben. Es kann auch zur Visualisierung der Gewebeschnittstelle des Geräts in anderen Systemen angewendet werden, die hart implantierte Komponenten verwenden, wie z. B. tiefe Hirnimplantate, vaskuläre Stents oder orthopädische Prothesen.