Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Dieses experimentelle System nutzt die Agroinfiltration, um Genkonstrukte effektiv an die Blätter zu liefern, damit sie einen hohen Gehalt an rekombinantem Protein produzieren können. Bauen Sie zunächst Hamana-Pflanzen sechs Wochen lang in einer kontrollierten Umgebung an, drei Tage bevor Sie infiltrieren. Bereiten Sie die Agrobacterium-Kulturen vor, die das Zielgen enthalten, das am Tag der Infiltration in den Pflanzen exprimiert werden soll.

Führen Sie die Agrobacterium-Kulturen entweder durch Spritze oder Vakuuminfiltration in das Pflanzengewebe ein. Ergebnisse wie die Intensität der grünen Fluoreszenz von GFP in Tabakblättern unter UV-Licht zeigen eine robuste Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen, die mit der aktueller bakterieller und insektenbasierter Expressionssysteme von Säugetieren konkurrieren kann. Die Agro-Infiltration ist ein wirksames Mittel, um Trans-Gene in Pflanzenzellen einzuführen, die zu einer hohen Expression rekombinanter Proteine führen.

Es kann für eine breite Palette von Pflanzenarten verwendet werden. Am wichtigsten ist, dass es für die kommerzielle Produktion von pharmazeutischen Proteinen skaliert werden kann. Diese Methode kann also Einblicke in die Kinetik und Expression von GFP geben und auf andere Proteine wie Untereinheiten-Impfstoffe, rekombinante monoklonale Antikörper und bei der Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten angewendet werden.

Ein erfolgreiches Experiment erfordert optimale Bedingungen sowohl für die Bakterienkultur als auch für das Pflanzenmaterial. Dieser Infiltrationsprozess ist nach visueller Demonstration leichter zu replizieren. Beginnen Sie damit, bis zu 60 Torfpellets in eine Anzuchtschale zu geben.

Füge vier Liter Leitungswasser hinzu und lass die Erbsenpellets das Wasser zwei Stunden lang aufnehmen. Gib nun zwei und Hamana-Samen in jedes Torfpellet und decke die Schale mit einer transparenten Plastikkuppel zum Keimen ab. Lege die Samen in eine Umgebung mit 25 Grad Celsius und 84% Luftfeuchtigkeit.

Zwei Wochen nach der Aussaat entfernen Sie die Kuppel und setzen Sie die Pflanzen in eine neue Schale um. Fügen Sie dann zwei Liter à 1,48 Gramm pro Liter hinzu. Jack's Dünger Lassen Sie die Pflanzen bei 25 Grad Celsius weiter wachsen.

50% Luftfeuchtigkeit alle zwei Tage. Liefern Sie zwei Liter Jack's Dünger pro Schale. In der vierten Woche füllst Du die Pflanzen mit Torfpellets in eine neue Schale um, in der sich sechs Pflanzen befinden, um sie bis zu einem Alter von sechs Wochen weiter wachsen

Wählen Sie vier, sechs Wochen alte und Hamama-Pflanzen mit jeweils fünf bis sechs Blättern, drei Blätter für eine vollständige Infiltration mit den Agrobakterienstämmen, die die interessierenden Gene beherbergen. Ein Blatt für die Negativkontrolle und ein Blatt für die punktuelle Infiltration. Mache mit einer Nadel einen kleinen Kerb in die Epidermis auf der Rückseite des Blattes und achte darauf, dass das Blatt nicht von beiden Seiten durchbohrt wird.

Fassen Sie die Vorderseite des ersten Blattes fest und üben Sie dabei einen sanften Gegendruck auf den Hals aus. Mit dem Daumen einer Hand. Injizieren Sie die Agrobacterium-Mischungen in Infiltrationspuffer mit einer Spritze oder einer Nadel in den Hals.

Injizieren Sie die Agrobacterium-Mischungen weiter in den Kerbe, bis sich der dunklere grüne Kreis nicht mehr ausdehnt. Erstellen Sie dann einen weiteren Kerb und wiederholen Sie die Injektionen, bis das gesamte Blatt infiltriert ist und das gesamte Blatt dunkler grün wird. Vollständige Infiltrationen der ersten drei Blätter und des letzten Blattes für das vierte Blatt jeder Pflanze infiltrieren mit Vektorkombinationen aus entweder allen vier Gemini-Virusvektoren oder drei Magcon-Vektoren.

Machen Sie außerdem einen Kerb für jede Kombination von Agrobacterium-Stämmen und infiltrieren Sie jeden Kerb mit einer Kombination. Nach der Infiltration bringst Du die Pflanzen zurück in den Anbauraum und überwachst die Proteinexpression zwischen zwei und 15 Tagen. Nach der Infiltration eine Wanne in ein Vakuumtrockenmittel stellen und drei Liter Infiltrationspuffer mit den Agrobacterium-Stämmen einfüllen.

Schließen Sie dann das Trockenmittel an eine Membran-Vakuumpumpe der Marke Vakuum an. Stellen Sie nun eine Pflanze kopfüber auf die Trockenplatte und senken Sie die Platte mit der Pflanze ab, bis das gesamte Blatt- und Stängelsystem in den Versickerungspuffer eingetaucht ist, wobei die Platte auf dem Kübel aufliegt. Positionieren Sie als Nächstes den Trocken-O-Ring entlang des Randes.

Nachdem Sie den Trockenmitteldeckel auf die Kammer gesetzt haben, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und starten Sie die Zeitmessung, wenn das Vakuum 100 Millibar erreicht. Öffnen Sie nach dem Ausschalten der Vakuumpumpe das Ablassventil an der Trockenblase nach einer Minute langsam bei 100 Millibar, um das Eindringen von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebes zu ermöglichen. Wiederholen Sie diese Infiltration.

Schritte eins, um eine gute Infiltration zu gewährleisten. Nehmen Sie dann die Pflanze aus dem Trockenmittel und stellen Sie sie wieder in ihre aufrechte Position. Bringen Sie die Pflanzen zurück in den Anbauraum und überwachen Sie die Proteinexpression zwischen zwei und 15 Tagen nach der Infiltration.

Um die Wirksamkeit der Spritze und der Infiltration von Agrobakterien in Pflanzengewebe zu demonstrieren, haben wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen, GFP und Ds rot, durch zwei verschiedene dekonstruierte pflanzliche Virusvektoren, Gemini, viral und magcon for end, getestet. Hamana-Blätter, die vollständig mit Agrobakterien infiltriert wurden, die Zwillinge-Virusvektoren enthalten. Die GFP-Expression wurde über die gesamte Blattfläche unter UV-Licht beobachtet, beginnend bei 2D PI und erreichte den Höhepunkt der Akkumulation bei vier DPI.

Im Gegensatz dazu zeigten Blätter, die mit Magcon-Vektoren infiltriert waren, die Agrobacterium-Kombinationen enthielten, erst nach fünf DPI eine GFP-Fluoreszenz und erreichten ihre maximale Akkumulation bei sieben DPI. Es wurde keine grüne Fluoreszenz von Blättern beobachtet, die mit Negativkontroll-Agrobakterienmischungen von EP 10 plus P 19 infiltriert waren, was darauf hindeutet, dass die Fluoreszenz spezifisch für das GFP-Gen war und nicht das Ergebnis von Hintergrundfluoreszenz von den Blättern war. Bei maximaler Akkumulation ist die Fluoreszenz des Magcon-Vektors, der in GFP exprimiert wird, intensiver als die des Gemini-Virusvektors.

Auf Blättern, die mit GFP-Konstrukten infiltriert waren, wurde keine größere Nekrose beobachtet, wenn beide fluoreszierenden Proteine über Gemini-Virusvektoren mit Spritzenspot-Infiltration auf demselben Blatt exprimiert wurden, sie wurden mit ihrer erwarteten fluoreszierenden Farbe an der Stelle nachgewiesen, an der sie infiltriert wurden. Interessanterweise führte die Co-Infiltration von GFP und DS RED zu einer gelblichen Fluoreszenz. Die Vakuuminfiltration wurde auch untersucht, um eine skalierbare Agroinfiltrationsmethode zu entwickeln, die für die großtechnische Produktion von rekombinanten Proteinen durch pflanzliche transiente Expressionssysteme verwendet werden kann.

Wie erwartet wurde für alle Blätter der infiltrierten Pflanze eine GFP-Fluoreszenz im Vergleich zur Spritzeninfiltration beobachtet. Es ist robuster und kann die Infiltration jeder Pflanze in einem viel kürzeren Zeitrahmen erreichen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 48 Stunden durchgeführt werden.

Meistens handelt es sich um die Agrobakterienkultur, da die tatsächliche Infiltrationszeit nur wenige Minuten beträgt. Für eine optimale Infiltrationseffizienz und gezielte Proteinexpression. Befolgen Sie das Protokoll. Denken Sie daran, die kritischen Parameter zu kontrollieren, einschließlich der Wachstumsbedingungen der Pflanzen, der Konzentration der Agrobakterien, des Vakuumdrucks und der Dauer im Bereich der Pflanzenbiotechnologie.

Dieser experimentelle Ansatz kann genutzt werden, um die Entwicklung und Bioproduktion neuartiger pharmazeutischer Proteine in einem breiten Spektrum von Pflanzenarten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die Agroinfiltration nutzen können, um Zielgenkonstrukte in die Pflanze zu bringen und es pflanzlichen transienten Expressionssystemen zu ermöglichen, rekombinantes Protein zu produzieren, das mit dem von Bakterien- und Insektenzellkulturen von Säugetieren konkurriert.