Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Dieses experimentelle System nutzt die Agroinfiltration, um Genkonstrukte effektiv in Blätter einzubringen, um hohe Mengen rekombinanten Proteins zu produzieren. Zunächst werden End-hamana-Pflanzen sechs Wochen lang unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet, drei Tage vor der Infiltration. Am Tag der Infiltration bereiten Sie Agrobacterium-Kulturen vor, die das Zielgen enthalten, das in den Pflanzen exprimiert werden soll.

Führen Sie die Agrobakterienkulturen mittels Spritzen- oder Vakuuminfiltration in das Pflanzengewebe ein. Ergebnisse wie die Intensität der grünen Fluoreszenz von GFP in Tabakblättern unter UV-Licht zeigen einen starken Ausdruck rekombinanter Proteine in Pflanzen, der mit dem gegenwärtiger Säugetier-, Bakterien- und Insekten-basierter Expressionssysteme konkurrieren kann. Die Agroinfiltration ist eine effektive Methode, um Transgene in Pflanzenzellen einzubringen, was zu einer hohen Expressionsebene rekombinanter Proteine führt.

Es kann für eine breite Palette von Pflanzenarten verwendet werden. Vor allem kann es für die kommerzielle Produktion pharmazeutischer Proteine hochskaliert werden. Daher kann diese Methode Einblicke in die Kinetik und Expression von GFP liefern und auf andere Proteine wie Untereinheitsimpfstoffe, rekombinante monoklonale Antikörper angewendet werden sowie bei der Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten eingesetzt werden.

Ein erfolgreicher Versuch erfordert optimale Bedingungen sowohl für die Bakterienkultur als auch für das Pflanzenmaterial. Dieser Infiltrationsprozess lässt sich nach einer visuellen Demonstration leichter reproduzieren. Beginnen Sie damit, bis zu 60 Torfperlen in eine Anzuchtschale zu legen.

Geben Sie vier Liter Leitungswasser hinzu und lassen Sie die Erbsenpellets das Wasser zwei Stunden lang aufnehmen. Geben Sie nun jeweils zwei Hamana-Samen in jedes Torfmulchpellet und bedecken Sie die Schale mit einer transparenten Kunststoffhaube zur Keimung. Stellen Sie die Samen in ein Umfeld mit 25 Grad Celsius und 84 % Luftfeuchtigkeit.

Zwei Wochen nach der Aussaat die Haube entfernen und die Pflanzen in eine neue Schale umsetzen. Anschließend zwei Liter einer Lösung mit 1,48 Gramm pro Liter Jack's Dünger hinzufügen. Die Pflanzen weiterhin bei 25 Grad Celsius kultivieren.

50%ige Luftfeuchtigkeit alle zwei Tage. Geben Sie zwei Liter Jacks Dünger pro Schale zu. Überführen Sie die Pflanzen mit Torfperlen in der vierten Woche in eine neue Schale, die sechs Pflanzen aufnimmt, um sie bis zum Alter von sechs Wochen weiter wachsen zu lassen.

Wählen Sie vier sechs Wochen alte Hamama-Pflanzen mit jeweils fünf bis sechs Blättern aus – drei Blätter für die vollständige Infiltration mit den Agrobakterienstämmen, die die Gene des Interesses tragen, ein Blatt für die negative Kontrolle und ein Blatt für die Spot-Infiltration. Erzeugen Sie mit einer Nadel einen kleinen Einschnitt in die Epidermis auf der Blattunterseite, wobei darauf zu achten ist, das Blatt nicht vollständig durch beide Seiten zu durchstechen.

Greifen Sie die Vorderseite des ersten Blattes fest an, während Sie mit der anderen Hand sanften Gegendruck auf den Hals ausüben. Mit dem Daumen einer Hand injizieren Sie die Agrobacterium-Mischungen in Infiltrationspuffer mithilfe einer Spritze und einer Nadel in den Hals.

Fahren Sie fort, die Agrobacterium-Mischungen in den Einschnitt zu injizieren, bis sich der dunkelgrüne Kreis nicht weiter ausdehnt. Erstellen Sie dann einen weiteren Einschnitt und wiederholen Sie die Injektionen, bis das gesamte Blatt infiltriert ist und das gesamte Blatt dunkelgrün gefärbt ist. Führen Sie vollständige Infiltrationen der ersten drei Blätter sowie des letzten Blatts – des vierten Blatts – jeder Pflanze mit Vektorkombinationen entweder aus allen vier Gemini-Virusvektoren oder aus drei Magcon-Vektoren durch.

Erstellen Sie außerdem einen Einschnitt für jede Kombination von Agrobacterium-Stämmen und infiltrieren Sie jeden Einschnitt mit einer Kombination. Nach der Infiltration bringen Sie die Pflanzen zurück in den Wachstumsraum und überwachen die Proteinexpression zwischen zwei und 15 Tagen. Nach der Infiltration stellen Sie einen Behälter in einen Vakuum-Exsikkator und geben drei Liter Infiltrationspuffer mit den Agrobacterium-Stämmen hinzu.

Verbinden Sie dann das Exsikkator mit einer Membranvakuum-Pumpe. Platzieren Sie nun eine Pflanze kopfüber auf der Exsikkatorplatte und senken Sie die Platte mit der Pflanze so weit ab, bis das gesamte Blatt- und Stängelsystem in den Infiltrationspuffer eingetaucht ist, wobei die Platte auf dem Behälter aufliegt. Bringen Sie danach die Exsikkator-O-Ring-Dichtung am Rand an.

Nachdem der Deckel des Exsikkators auf die Kammer gesetzt wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und beginnen Sie mit der Zeitmessung, sobald das Vakuum 100 Millibar erreicht hat. Nach einer Minute bei 100 Millibar schalten Sie die Vakuumpumpe aus und öffnen langsam das Entlüftungsventil am Exsikkator, um das Eindringen von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebes zu ermöglichen. Wiederholen Sie diese Infiltration.

Schritt eins, um eine gute Infiltration sicherzustellen. Entfernen Sie dann die Pflanze aus dem Exsikkator und stellen Sie sie wieder in ihre aufrechte Position. Stellen Sie die Pflanzen zurück in den Wachstumsraum und überwachen Sie die Proteinexpression zwischen zwei und 15 Tagen nach der Infiltration.

Um die Wirksamkeit der Spritzeninfiltration von Agrobakterien in Pflanzengewebe zu demonstrieren, testeten wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen, GFP und DsRed, mithilfe zweier verschiedener dekonstruierter pflanzlicher Virusvektoren, Gemini viral und magcon for end. Hamana-Blätter, die vollständig mit Agrobakterien, die Gemini-Virusvektoren enthielten, infiltriert worden waren. Die GFP-Expression war unter UV-Licht über den gesamten Blattbereich hinweg sichtbar, beginnend bereits ab 2 Tagen nach der Infiltration (dpi), und erreichte ihre maximale Akkumulation am vierten Tag nach der Infiltration (dpi).

Im Gegensatz dazu zeigten Blätter, die mit einer MagCon-Vektor enthaltenden Agrobakterien-Kombination infiltriert wurden, die GFP-Fluoreszenz erst nach fünf Tagen post Infiltration (DPI) und erreichten ihre maximale Akkumulation nach sieben DPI. Keine grüne Fluoreszenz wurde in Blättern beobachtet, die mit negativen Kontroll-Agrobakterien-Mischungen aus EP1 10 plus P19 infiltriert wurden, was darauf hindeutet, dass die Fluoreszenz spezifisch für das GFP-Gen war und nicht auf Hintergrundfluoreszenz der Blätter zurückzuführen war. Bei maximaler Akkumulation war die Fluoreszenz des MagCon-Vektors, der GFP exprimierte, intensiver als die des Gemini-Virusvektors.

Es wurde keine signifikante Nekrose auf Blättern beobachtet, die mit GFP-Konstrukten infiltriert wurden, wobei beide fluoreszierenden Proteine über Gemini-Virusvektoren mittels Spritzenpunktinfiltration auf demselben Blatt exprimiert wurden; sie wurden an der Infiltrationsstelle in ihrer erwarteten fluoreszierenden Farbe detektiert. Interessanterweise führte die Ko-Infiltration von GFP und DS RED zu einer gelblichen Fluoreszenz. Die Vakuuminfiltration wurde ebenfalls untersucht, um eine skalierbare Agro-Infiltrationsmethode zu entwickeln, die für die großtechnische Produktion rekombinanter Proteine mittels pflanzlicher transienter Expressionssysteme verwendet werden kann.

Wie erwartet wurde im Vergleich zur Spritzeninfiltration eine GFP-Fluoreszenz für alle Blätter der infiltrierten Pflanze beobachtet. Die Methode ist robuster und ermöglicht die Infiltration jeder Pflanze in einem deutlich kürzeren Zeitraum. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 48 Stunden durchgeführt werden.

Meistens wird es für die Agrobakterienkultur verwendet, da die eigentliche Infiltrationszeit nur wenige Minuten beträgt. Für eine optimale Agro-Infiltrationseffizienz und gezielte Proteinausprägung befolgen Sie das Protokoll. Denken Sie daran, die kritischen Parameter zu kontrollieren, einschließlich der Pflanzenwachstumsbedingungen, der Agrobakterienkonzentration, des Vakuumdrucks und der Dauer im Bereich der Pflanzenbiotechnologie.

Dieser experimentelle Ansatz kann verwendet werden, um die Entwicklung und biotechnologische Produktion neuartiger pharmazeutischer Proteine in einer breiten Palette von Pflanzenarten zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Agroinfiltration nutzt, um Konstrukte mit Zielgenen in die Pflanze einzubringen, und wie man pflanzliche Transientexpressionssysteme zur Produktion rekombinanter Proteine verwendet, die mit der von Säuger-, Bakterien- und Insektenzellkulturen konkurrieren kann.