Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte Proteine des Interesses in kommerziell erhältlichen Insektenzellen zu exprimieren, um die Aufklärung der Proteinfunktion und/oder des zellulären Proteintransports zu verbessern. Diese Methode kann helfen, zentrale, auf Zellbiologie und Biochemie basierende Fragen bezüglich der Proteinfunktionalität, Proteininteraktionen und/oder der subzellulären Proteinlokalisierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Konstrukte rasch erzeugt werden können und exprimierte Proteine funktional in lebenden Zellen untersucht werden können, ohne dass schädliche Effekte im Zusammenhang mit der Baculovirus-Expression auftreten, wodurch die Durchsatzrate verbessert wird.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von Insektenproteinen ermöglicht, kann sie auch auf jedes andere System angewendet werden, bei dem die Untersuchung der Proteinfunktion oder zellulären Lokalisation gewünscht ist. Die Demonstration des Verfahrens für die Kultur und Transfektion von Insektenzellen übernimmt Danni LeRoy, eine Technikerin aus meinem Labor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie die Vorratsgefäße mit eingefrorenen SF9- und Tni-Zellen dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und lassen sie im 37-Grad-Celsius-Wasserbad auftauen.

Nach dem Auftauen die Vials mit 70 % Ethanol desinfizieren und auf Eis stellen. Alle Zellmanipulationen, bei denen Vials und Zellkulturflaschen geöffnet werden müssen, sind unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Luftströmungskabine durchzuführen. Vier Milliliter serumfreies Insektenmedium in eine neue T25-Flasche und vier Milliliter TNM-FH-Medium in eine andere T25-Flasche geben.

Übertragen Sie ein Milliliter aufgetautes Tni-Gewebe in den Kolben mit serumfreiem Insektenmedium und ein Milliliter aufgetaute SF9-Zellen in den Kolben mit TNM-FH-Medium. Stellen Sie die Kolben in einen nicht befeuchteten Inkubator bei 28 Grad Celsius und lassen Sie die Zellen 30 bis 45 Minuten anheften. Ersetzen Sie das Ansiedlungsmedium durch fünf Milliliter des jeweils geeigneten Mediums.

Und stellen Sie die Kolben zurück in den nicht befeuchteten Inkubator bei 28 Grad Celsius. Überwachen Sie die Zellkonfluenz täglich. Passagieren Sie die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, wie in diesen repräsentativen Bildern dargestellt.

Kippen Sie den Kolben mit den konfluenten Zellen so, dass das Medium in eine Ecke abfließt, die sich vom Zellmonolayer entfernt befindet, und entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer sterilen fünf Milliliter-Serologischen Pipette, ohne die Zellen zu stören. Bei Tni-Zellen fügen Sie mit einer neuen sterilen fünf Milliliter-Serologischen Pipette vorsichtig vier Milliliter serumfreies Insektenmedium auf den konfluenten Monolayer hinzu. Bewegen Sie die Pipettenspitze über den Kolben und spülen Sie langsam, um Zellen zu entfernen, die nur locker an der Kolbenunterseite haften.

Um die ausreichende Ablösung der Zellen zu überprüfen, entfernen Sie sämtliches Medium, drehen Sie die Flasche um und prüfen Sie, ob der Boden der Flasche klar ist. Bei SF9-Zellen, die fester haften, geben Sie vier Milliliter frisches TNM-FH-Medium hinzu und lösen die anhaftenden Zellen mit einem Zellkratzer ab. Verwenden Sie eine fünf Milliliter-Serologische Pipette, um die Zellen vorsichtig zu mischen und Zellklumpen zu reduzieren.

Nach dem Lösen der Zellen etwa 0,1 Milliliter der jeweiligen Zell- und Mediummischung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. In ein separates 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen jeweils 10 Mikroliter der Zell- und Mediummischung zu 10 Mikrolitern Trypanblau hinzufügen. Die Kammer für den Zellzähler von ihrer Verpackung entfernen und 10 Mikroliter der Mischung aus Zellmedium und Trypanblau auf jeder Seite des Zählpräparats auftragen.

Fügen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein und bestimmen Sie die Zelldichte und Vitalität. Überführen Sie etwa 1 bis 1,5 × 10⁶ Zellen in T25-Flaschen mit frischem Medium. Beschriften Sie die Flaschen mit dem Zellliniennamen, Datum, verwendeten Medium, Anzahl der hinzugefügten Zellen und Passagezahl.

Stellen Sie die Kolben bis zu 72 Stunden in einen 28 Grad Celsius warmen Inkubator. Das Verfahren zur Transfektion von Insektenzellen muss zudem in einer laminaren Luftströmungsabsaughaube durchgeführt werden. Säen Sie einen T25-Kolben mit bis zu einer mal 10 hoch 6 Tni- oder SF9-Zellen in einem geeigneten Insektenzellmedium an.

Tni-Zellen werden in dieser Demonstration verwendet. Kultivieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bis zur Konfluenz bei 18 Grad Celsius. 72 Stunden später entfernen und verwerfen Sie das alte Medium und lösen Sie die Tni-Zellen mit vier Milliliter frischem serumfreiem Insektenmedium, wie zuvor gezeigt, ab.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist das Erreichen der geeigneten Zelldichte, die während der Transfektion an den Glasbodenplatten haften. Pro Platte sollten nicht mehr als sieben mal 10 hoch 5 Zellen hinzugefügt werden. Nach der Abschätzung der Zelldichte mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts die Zellsuspension gründlich, aber vorsichtig durch Umstülpen des Reaktionsgefäßes mischen und etwa sieben mal 10 hoch 5 Zellen in einzelne 35-Millimeter-Glasbodenplatten geben.

Lassen Sie die Zellen 20 bis 25 Minuten bei 28 Grad Celsius anheften. Geben Sie für jede Transfektion zwei Mikrogramm Plasmid-DNA in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 0,1 Milliliter serumfreies Insektenmedium ohne FBS enthält. Mischen Sie in einem separaten Röhrchen acht Mikroliter Transfektionsreagenz mit 0,1 Milliliter serumfreiem Insektenmedium.

Überführen Sie die Lösung anschließend in das Röhrchen mit der gewünschten Plasmid-DNA. Vortexen Sie vorsichtig und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten. Verdünnen Sie danach die Plasmid-Transfektionsmischung mit 0,8 Milliliter serumfreiem Insektenmedium, sodass das Gesamtvolumen ein Milliliter beträgt.

Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der Glasschale mit den angehefteten Zellen. Überlagern Sie die angehefteten Zellen mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 28 Grad Celsius für fünf Stunden.

Nach fünf Stunden das Transfektionsmedium entfernen und verwerfen und die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter serumfreiem Insektenmedium waschen, wobei darauf zu achten ist, die Zellen nicht zu lösen. Zwei Milliliter frisches serumfreies Insektenzellmedium hinzufügen und 48 bis 72 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren. 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion der Insektenzellen die Zellen einmal mit einem Milliliter IPL-41-Insektenmedium waschen und anschließend mit zwei Millilitern IPL-41 für die Bildgebung bedecken.

Gebe vier Tropfen des Hoechst-Färbe-Reagenz für lebende Zellen zum Medium hinzu und inkubiere 20 bis 25 Minuten bei 28 Grad Celsius. Platziere die 35-Millimeter-Schale in das selbstgeschlossene Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. Obwohl viele Glas-Schalen im Handel erhältlich sind, ist es wichtig, dass sie auf die Mikroskop-Bühne passen, und es kann notwendig sein, empirisch zu ermitteln, welches Glaswerk am besten mit der Zelladhärenz verträglich ist.

Stellen Sie das Mikroskop auf die Beobachtungsbedingungen für Hoechst, EGFP und mCherry ein. 359 Nanometer und 461 Nanometer für die Anregung und Emission von Hoechst. 489 Nanometer und 510 Nanometer für die Anregung und Emission von EGFP.

Und 580 Nanometer bzw. 610 Nanometer für Anregung und Emission von mCherry. Führen Sie mit einem 10X-Objektiv einen ersten Scan durch, um die fluoreszierende Expression zu bestätigen. Danach wechseln Sie in den Scanmodus mit einem 60X-Phasenkontrast-Wasserimmersionsobjektiv.

Stellen Sie die Laserleistung, die Detektorempfindlichkeit, die Scangeschwindigkeit, die Tiefe der Z-Achse und den digitalen Zoom ein, um den Bildkontrast und die Auflösung zu optimieren. Bilden Sie die Zellen mit 1,5-fachem digitalem Zoom ab, um eine Gesamtvergrößerung von 90-fach zu erreichen. Speichern und exportieren Sie die Rohdaten als TIFF-Bilddateien zur späteren Analyse.

Tni-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert und die Expression rekombinanter Proteine mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Ein erfolgreicher Transfektionsnachweis und die Expression von rekombinantem BtDrip1-EGFP zeigen sich durch das Vorhandensein grüner Fluoreszenz auf der Zelloberfläche. Zellen, die mit BtDrip2-Version eins EGFP transfiziert wurden, weisen innere grüne Fluoreszenz auf, was die intrazelluläre Expression von BtDrip2-Version eins anzeigt.

Ebenso zeigen Zellen, die mit PIB DmSPR-mCherry oder PIB PLA2G15-mCherry transfiziert wurden, rote Fluoreszenz, was die Expression der jeweiligen Chimären anzeigt. In den überlagerten Bildern deuten orange oder gelbe Bereiche darauf hin, dass sowohl EGFP als auch mCherry exprimiert werden, was darauf schließen lässt, dass die Proteine in denselben subzellulären Strukturen ko-lokalisiert sind. Eine Überlagerung von Zellen, die doppelt mit PIB BtDrip1-EGFP und PIB DmSPR-mCherry transfiziert wurden, deutet auf eine Ko-Lokalisation von BtDrip1-EGFP und DmSPR-mCherry an der Zelloberfläche hin.

Zellen, die mit BtDrip2-Version eins EGFP und PIB DmSPR-mCherry doppelt transfiziert wurden, zeigen eine geringe Kolokalisation der grünen und roten Fluoreszenzsignale, was die intrazelluläre Expression von BtDrip2-Version eins bestätigt. Im Gegensatz dazu führte die Koexpression von PIB BtDrip2-Version eins EGFP und dem lysosomalen Marker PIB PLA2G15-mCherry zu einer signifikanten Überlappung der zytoplasmatischen grünen und roten Fluoreszenzsignale. Dies deutet stark darauf hin, dass BtDrip2 in intrazelluläre Lysosomen transportiert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende Proteinchimären in kultivierten Insektenzellen exprimiert. Dieses System ermöglicht eine schnelle Vektor-Konstruktion bei der Proteinsynthese, vermeidet die Probleme virusbasierter Expressionssysteme und bietet eine robuste Methode, um die zelluläre Transportproteine zu beobachten.