Name: Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Expression fluoreszenzmarkierter Proteine in Insektenzellen zur Untersuchung von Proteinfunktion und zellulärem Transport. Diese Methode ermöglicht schnelle Vektorherstellung und funktionelle Analyse in lebenden Zellen ohne Viren.

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Wir danken Lynn Forlow-Jech und Dannialle LeRoy für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Basis CRIS Finanzierung USDA ARS, Nationales Programm 304 unterstützt - Crop Protection and Quarantine [Projekt # 2020-22620-022-00D] JAF und JJH Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten in diesem Artikel ausschließlich zum Zweck ist die Bereitstellung spezifische Information und stellen keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture implizieren. USDA eine Politik der Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

1. OE-PCR für die Konstruktion von Expressionsplasmiden Hinweis: Siehe Tabelle 1 für alle verwendeten Primer in OE-PCR. Die Verwendung einer High-Fidelity DNA-Polymerase wird für alle Amplifikationen empfohlen. Da jedoch diese Enzyme häufig nicht verlassen, ein 3&#39; A, ist es notwendig, eine kurze, nicht-Amplifizierung Inkubation mit einer Taq-DNA-Polymerase zu ‚A-tail‘ auszuführen, um die PCR-Produkte, bevor sie in einen TA-Insektenzellen-Expressions klonen Vektor. Dieses Protokoll zeigt ein Verfahren insect Expressionsplasmide Proteine beherbergt chimäre zu erzeugen, mit den fluoreszierenden Proteinen in-Rahmen zu dem Carboxylterminus der Gene von Interesse fusioniert ist (in diesem Fall zu zwei Bemisia tabaci Aquaporin - Proteine) oder subzellulären Markerproteine (Abbildung 1). <ol><li> Verwenden OE-PCR, die aus zwei unabhängigen Amplifikationsrunden bestehen, zu erzeugen: (1) Sequenzen , die die Gene von Interesse (B. tabaciAquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci Aquaporin 2: BtDrip2_v1) , fusioniert in-frame mit einem grün fluoreszierenden Protein EGFP Variante genannt , oder (2) die subzelluläre Marker (Drosophila melanogaster sex peptide receptor: DmSPR; Homo sapiens Phospholipase A2: HsPLA2) mit der mCherry kodierenden Sequenz. Direkt abzubinden die endgültigen OE-PCR-Produkte in das PIB / V5-His-TA-Plasmid. <ol><li> Für die erste Runde des OE-PCR (angezeigt durch AD und A&#39;-D‘in Figur 1), mit einem Gen-spezifischer Sense - Primer und einen chimäres Antisense - Primer (in Fettdruck in Tabelle 1 gezeigt) (kursiv dargestellt in Tabelle 1) entspricht , an die letzten 15 bp (ohne das Stopcodon) des Gens von Interesse / subzellulären Marker und auf 15 bp des 5&#39;-Endes des fluoreszierenden Proteins (EGFP oder mCherry) gewünscht wird, ein Produkt mit einem 3&#39;-Überhang zu erzeugen. Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. </li><li> In einem separaten Röhrchen, mit einem Gen-spezifIC - fluoreszierender Protein - Antisense - Primer und ein chimären Sense - Primer (mit einer Unterstreichungs in Tabelle 1 gezeigt), die 15 bp von dem 3&#39;-Ende des Gens von Interesse / subzellulären Marker und 15 bp von dem 5&#39;-Ende der gewünschten Fluoreszenz enthält Protein, das ein Produkt mit einem 5&#39;-Überhang zu erzeugen. Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. Das Template PCR kann entweder ein sequenz validierte PCR-Produkt oder stärker bevorzugt sein, Plasmid-DNA die gewünschte Sequenz enthält. Die hier beschriebene Studie verwendet sequenz validiert Plasmide. </li><li> Trennt die PCR-Produkte mit 1% Agarose-Gelelektrophorese (unter Verwendung von Standard-Agarose Molekular-grade). </li><li> Verbrauch und reinigen , die Produkte der erwarteten Größen (siehe Tabelle 2) einen im Handel erhältlichen DNA Gel - Extraktions - Kits (siehe die Tabelle von Materialien für die spezifische Kit in diesem Protokoll verwendet). </li><li> Mithilfe der gelgereinigten PCR-Produkte aus Schritt 1.1.4 die endgültige Überdeckung E zu erzeugen,xtension Produkte (angegeben durch A &#39;&#39; - D &#39;&#39; in Figur 1). Verwenden, um einen genspezifische Sense-Primer für das Gen von Interesse / subzellulären Marker und dem entsprechenden genspezifische Antisense-Primer für das fluoreszierende Protein der gewünschten chimäre Sequenz zu erzeugen. Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. Es kann notwendig sein, um empirisch die optimalen Mengen der ersten Runde Überlappungsverlängerungsprodukte zu bestimmen, zu dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um das endgültige, in voller Länge chimären PCR-Produkt zu ergeben. </li><li> Trennt die zweite Runde OE-PCR-Produkte durch 1% Agarose-Gelelektrophorese. Verbrauch und reinigen, die Produkte eines im Handel erhältlichen DNA Gel-Extraktions-Kit. </li><li> Inkubieren gelgereinigt zweite Runde OE-PCR - Produkte mit 1 Einheit Taq - DNA - Polymerase - Master - Mix für 10 min bei 72 ° C , um die 3&#39; adenyliert (dh A-tailed) Produkte für TA Cloning erforderlich zu erzeugen. </li><li> Ligieren der resultierenden Produkte adenyliertein den PIB - Expressionsvektor und Standard molekularer Klonierungstechniken verwenden chemisch kompetente (Hitzeschock) oder elektro (Elektroporation) Escherichia coli - Zellen zu transformieren. Platte über Nacht auf dem Medium das geeignete Selektionsmarker enthält (dh Ampicillin oder Carbenicillin). </li><li> Kolonie - PCR durchzuführen 12 einen Vektor-spezifischen Primer und einen Einsatz-spezifische Primer insert-positive Kolonien zu identifizieren , die mit Expressionsplasmide beherbergen ein Insert in der Orientierung 5&#39;-3&#39; transformiert wurden. Bereiten Sie über Nacht Kulturen von Kolonien zu erzeugen PCR-Produkte der erwarteten Größen. </li><li> Isolieren Plasmid - DNA eines im Handel erhältlichen DNA - Reinigungs - Kits unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Werkstoff - Tabelle für den spezifischen Kit in diesem Protokoll verwendet). Überprüfen der Sequenzintegrität jeden Einsatz durch direkte DNA-Sequenzierung. </li></ol></li></ol> Hinweis: Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen alle Manipulationen Zelle die Öffnung der Gewebekulturflasche in einer Laminarströmungshaube erforderlich ist. Schalten Sie den Laminarströmungshaube UV-Entkeimungslampe mindestens 1 h vor der Zellmanipulationen. Nitril-Handschuhe tragen und dekontaminieren, die Oberfläche der Bank, Pipetten, Geräte, Röhren und Flaschen mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Die Vertrautheit mit grundlegenden Zellkulturtechniken wird 13 empfohlen. <ol><li> Verwenden Tni - Zellen (eine etablierte Zellkulturlinie , abgeleitet von Trichoplusia ni Ovarialgewebe), die an serumfreies Medium angepasst sind , und halten sie als adhärente Monolayer - Kultur in serumfreien Insektenmedium bei 28 ° C in T25 - Gewebekulturflaschen. </li><li> Pflegen Sf9 - Zellen (eine etablierte Zellkulturlinie von Spodoptera frugiperda abgeleitet Ovarialgewebe) in ähnlicher Weise , aber unter Verwendung TNM-FH Insektenkulturmedium Ergänzunged mit 10% fötalen Rinderserum (FBS). </li><li> Seed die Vorkultur von gefrorenem Sf9 oder Tni Zellen durch Vorratsröhrchen von -80 ° C zu entfernen und so dass sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad auftauen. Dekontaminieren die Fläschchen mit 70% Ethanol nach dem Auftauen und legen sie auf Eis. </li><li> 4 ml Insektenzellmedium auf eine neue T25-Kolben gegeben und 1 ml der aufgetauten Insektenzellsuspension. Der Kolben wird in einem 28 ° C, nicht-befeuchteten Inkubator und lassen die Zellen für 30-45 min befestigen. </li><li> Ersetzen das Seeding-Mediums mit 5 ml des entsprechenden Mediums und übertragen die Kolben zu einem 28 ° C nicht-befeuchteten Inkubator. Überwachen Sie Zellkonfluenz täglich. Passage der Zellen, wenn sie erreichen 90% Konfluenz. Hinweis: Vollständige Abdeckung der T25 - Flasche entspricht ca. 5 x 10 6 Zellen. </li><li> Insektenzellpassage. <ol><li> Zu den Zellen Passage, entfernen zuerst das erschöpfte Medium aus dem Kolben, die konfluenten Zellen mit einer sterilen 5 ml serologischen Pipette.Neigen des Kolbens, so dass das Medium zu einer Ecke strömt, weg von der Zellmonolayer. Entfernen Sie vorsichtig das Medium mit einer Pipette, ohne die Zellen zu stören. </li><li> Abzulösen die Tni-Zellen durch vorsichtiges die T25-Kolben Spülen der konfluenten Monoschicht mit 4 ml serumfreien Insektenmedium unter Verwendung von neuen, sterilen, 5 ml serologische Pipette enthält. Bewegen, um die Pipettenspitze in den Kolben gegeben und langsam bewässern Zellen lose an dem Kolbenboden zu entfernen. <ol><li> Überprüfen Sie für die angemessene Ablösung von Zellen durch alle Medien zu entfernen, drehen die Kolben über, und die Beobachtung, dass der Boden des Kolbens ist klar. </li></ol></li><li> Für Sf9-Zellen, die festen haften, 4 ml frischen TNM-FH-Medium und einen Zellschaber verwenden, um die anhaftenden Zellen abzulösen. Verwenden, um eine 5 ml serologische Pipette vorsichtig mischen und Zelle Verklumpen zu reduzieren. </li><li> Verwenden eines automatisierten Zellzähler die Anzahl von lebensfähigen Insekten- Zellen pro Volumen des Mediums zu schätzen. Übertragung von 0,1 ml Zellen / Medium Gemisch in einen 1,5-mlMicrofuge-Röhrchen. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 ml, werden 10 &amp; mgr; l Zellen / Medium-Gemisch zu 10 &amp; mgr; l von Trypanblau. </li><li> Entfernen eines Zellzählers Kammer Schieber aus seiner Verpackung und dann werden 10 ul der Zell / mittel / Trypanblau-Mischung auf jeder Seite des Zählens Folie. Legen Sie die Folie in den Zellenzähler und bestimmt die Zelldichte und Lebensfähigkeit. </li><li> Unter Verwendung der Zelldichte, berechnen und das richtige Volumen von Insektenzellmedium hinzu (bis zu 5 ml), um neue, sterile T25-Kolben. </li><li> Übertragen etwa 1-1,5 × 10 6 Zellen auf T25 - Kolben mit frischen Medien; bezeichnet die Kolben mit der Zelllinie, Datum, Medium verwendet, die Anzahl der Zellen zugegeben, und Passagezahl (P n + 1 - Generation, wobei P n die Kanal - Nummer für die vorherige Generation von Zellen ist); und legt die Kolben in einem 28 ° C Inkubator für bis zu 72 h. Hinweis: Insektenzellen können kontinuierlich vermehrt werden, obwohl Zellen weniger empfänglich sein können, um die Transfektion und / oder heterologenProtein-Expression nach 30 Durchgängen. Behandeln alle verworfen Zellen / Medium mit 10% Bleichlösung und autoklaviert Einwegplastikware vor der Entsorgung. </li></ol></li></ol> 3. Insect Zelltransfektion <ol><li> Samt eine T25 - Kolbe mit bis zu 1 x 10 6 Tni oder Sf9 - Zellen in einem geeigneten Insektenzellmedium (serumfreien Insektenmedium für Tni und TNM-FH für Sf9) und wachsen zu Konfluenz für 72 h bei 28 ° C. </li><li> Entfernen und das alte Medium verworfen und die Zellen mit 4 ml frischem serumfreien Insektenmedium entfernen (siehe Schritte 2.6.2 und 2.6.3, oben). </li><li> Abschätzen, ob die Zelldichte eines automatisierten Zellzähler (siehe Schritt 2.6.4, oben). </li><li> Mit ca. 7 x 10 5 Zellen zu einzelnen 35 mm Glasbodenschalen und lassen die Zellen bei 28 ° C für 20-25 min befestigen. </li><li> Für jede Transfektion, add 2 ug Plasmid-DNA (entweder von einem Plasmid für die einzelnen Transfektionen oder 2 &amp; mgr; g von jedem der beiden Plasmide für double Transfektionen) zu 0,1 ml serumfreien Insektenmedium (ohne FBS für beide Sf9 und Tni Transfektionen) in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In einem separaten Röhrchen, mischte 8 uL Transfektionsreagenz mit 0,1 ml serumfreien Insektenmedium, und dann diese Lösung in das Röhrchen übertragen, den Plasmid-DNA von Interesse enthält. Leicht verwirbeln und 20 bei RT inkubieren - 30 min. </li><li> Verdünne die Plasmid-Transfektionsgemisch aus den Schritten 3.5 und 3.6 mit 0,8 ml serumfreien Insektenmedium, so daß das Gesamtvolumen 1 ml beträgt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Medien aus den Glasschalen haftenden Zellen enthält. Überlagern die anhaftenden Zellen mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsmedium. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 28 ° C für 5 Stunden. Anmerkung: Die Bedingungen für die Transfektion erfordern empirische Optimierung für maximale Transfektionseffizienz (beispielsweise über Nacht Transfektion anstatt 5 h beträgt die Menge an Plasmid - DNA verwendet, die Chemie des TransfektionsreagenzGebrauchte, etc.). </li><li> Entfernen und die Transfektionsmedium verwerfen und die Zellen vorsichtig mit 1 ml serumfreien Insektenmedium waschen, darauf achten, daß Zellen zu entfernen. </li><li> Fügen Sie 2 ml frischen Insektenzellmedium (serumfreien Insektenmedium für Tni und TNM-FH für Sf9) und inkubiere bei 28 ° C für 48-72 h. Hinweis: Auch hier Bedingungen erfordern empirische Optimierung für maximale heterologe Proteinexpression. </li></ol> 4. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bei 48-72 h nach der Transfektion, wäscht die Zellen einmal mit 1 ml IPL-41-Insektenmedium, und dann die Abdeckung mit 2 ml IPL-41 für die Bildgebung. Anmerkung: Dieser Waschschritt vermindert die Hintergrund-Autofluoreszenz mit Insektenzellmedium beobachtete in normaler Zell Wartung verwendet. </li><li> 4 Tropfen Hoechst Lebendzell-Färbereagenz (siehe die Tabelle von Materialien für die spezifische Kernfärbung in diesem Protokoll verwendet) zum Medium und Inkubation bei 28 ° C für 20-25 min. Hinweis: Weitere NukLear Flecken substituiert sein kann, obwohl der Farbstoff ein Fluoreszenzprofil einzigartig von EGFP und mCherry haben sollte. </li><li> Legen Sie eine 35 mm-Schale in die in sich geschlossenen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (siehe die Tabelle von Materialien für das jeweilige Instrument in diesem Protokoll verwendet). </li><li> Stellen Sie das Mikroskop für Hoechst, EGFP und mCherry Beobachtungsbedingungen: Hoechst Anregungs- / Emissions - 359/461 nm; EGFP Anregungs- / Emissions - 489/510 nm; mCherry Anregungs- / Emissions - 580/610 nm. </li><li> Durchführen einen anfänglichen Scan ein 10-fach Objektiv unter Verwendung von fluoreszierender Expression zu bestätigen und dann wechseln Abtastmodus ein 60X Phasenkontrastwasserimmersionsobjektiv. </li><li> Justieren der Laserleistung (5-7%), Detektorempfindlichkeit (47-49%), Abtastgeschwindigkeit, Z-Achsen-Tiefe, und Digitalzoom den Bildkontrast und die Auflösung zu optimieren. Bild die Zellen bei 1,5X digitalem Zoom insgesamt 90X Verstärkung zu geben. Hinweis: Mikroskop Parameter erfordern empirische Anpassung für eine optimaleBildsammlung und kann mit dem Instrument in Gebrauch sein spezifisch. </li><li> Exportieren Sie die Rohdaten als TIFF-Bilddateien und ändern (Ernte und Overlay) für Abbildung Generation. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Heterologe Proteinexpressionssysteme sind wichtige Werkzeuge für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in zahlreichen Anwendungen eingesetzt Downstream 4. Die Auswahl aus den verschiedenen Expressionssystemen zur Verfügung, hängt vom Endziel für das Protein von Interesse. Mehr Insektenzellexpressionssysteme zur Verfügung , die flexible Alternativen zu pro- und eukaryotischen Zellexpressionssystemen 5, 6 bieten. Insektensysteme Bacul...

Die Herstellung von rekombinanten Proteinen Insektenzellexpressionssysteme bietet zahlreiche Vorteile für die Untersuchung von eukaryotischen Proteinen. Und zwar besitzen Insektenzellen ähnliche post-translationale Modifikationen, die Verarbeitung und Sortiermechanismen wie jene , die in Säugetierzellen, die zur Herstellung von korrekt gefalteten Proteinen 1, 2, 3 vorteilhaft sind. Insektenzellsysteme , auch benötigen in der Regel weniger Ressourcen und weniger Zeit und Aufwand für die Wartung als Säugetier-Zelllinien 4, 5. Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein solches Insektenzell-basiertes System, das heute weit verbreitet in vielen Disziplinen verwendet wird, einschließlich der Herstellung von rekombinanten Proteinen für die Proteincharakterisierung und Therapeutika, die immunogene Präsentation von Fremdpeptiden und virale Proteine, die für die Impfstoffherstellung, die Synthese von mehr -Protein KomplexeDie Herstellung von glycosylierten Proteinen, etc. 1, 2, 4, 6. Es gibt jedoch Situationen , in denen von Baculovirus - Expressions nicht anwendbar sein , 3, 7, und die Verwendung von nichtlysierende und transienten Insektenexpressionssystemen kann besser geeignet sein. Insbesondere transiente Insektenzellexpressions die Möglichkeit zur schnellen Synthese von rekombinantem Protein bieten, weniger Entwicklung und Wartung erfordert, nicht viralen auferlegte Zelllyse beteiligt, und stellt ein Mittel besseren zellularen Handel während Proteins zu studieren Synthese 7, 8, 9, 10. Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Erzeugung von Expressionsvektoren unter Verwendung von Zweistufen-Überlappungsverlängerungs-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmide sind doppelt transfizieren kommerziell erhältlichen gezüchteten Insektenzellen verwendet und repräsentative Proteine ​​zu produzieren. Das Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten subzellulären Markerproteinen und zeigt Kolokalisation mit zwei Aquaporin - Proteinen aus dem Insekten Bemisia tabaci. Das folgende Protokoll stellt die grundlegende Methodik für OE-PCR, Insektenzell Wartung und Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie für die zelluläre Lokalisation von Zielproteinen.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA-Polymerase</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase für die PCR-Amplifikation von PCR-Produkten mit Überlappungsverlängerung</td></tr><tr><td>ExTaq DNA-Polymerase</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>DNA-Polymerase für das A-Tailing von PCR-Produkten</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA-Polymerase Master Mix</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>DNA-Polymerase für die PCR</td></tr> <tr><td>von BakterienkolonienBiometra TProfessional Gradient Thermocycler</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montage DNA Gel Extraktionskit</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>Enthält Komponenten, die zum Klonieren von Überlappungsverlängerungs-PCR-Produkten benötigt werden, einschließlich linearisierter und Topoisomerase I-aktivierter pIB/V5-His-TOPO-Vektor, chemisch kompetenter One Shot TOP10-E. coli und Salzlösung.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Roboter-Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Reiniger Vertikale Reinbank</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni kultivierte Insektenzelllinie</td><td>Allel Biotech</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 kultivierte Insektenzelllinie</td><td>Allel Biotech</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>Serumfreies Insektenkulturmedium</td><td>Allel Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH Insektenkulturmedium</td><td>Allel Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 Insektenmedium</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Transfektionsreagenz</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm Einweg-Zellschaber</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>Zelle Schaber mit Klinge mit zwei Positionen</td></tr><tr><td>25 cm2 (T25) Gewebekulturflaschen mit Entlüftungsfilterkappen</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>steril, 50 mL Bioreaktionsröhrchen</td> Life <td>Science Products</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologisch Pipetten</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL PCR-Röhrchen mit flachem Deckel</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen Biohazard Autoklavenbeutel</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1,5 Glasbodenschalen</td><td>Matsunami Glas</td><td>D35-14-1,5-U</td><td>35 mm Schalendurchmesser, 14 mm Glasdurchmesser, 1,5 mm Glasstärke, unbeschichteter</td></tr><tr><td>Inkubator, Modell 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger mit 0,4 % Trypanblau-Reagenz</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 Plasmid-DNA</td><td>transOMIC Technologies</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagenz (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

vorübergehende expression und zelluläre lokalisation von rekombinanten proteinen in gezüchteten insektenzellen

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologe Proteinexpressionssysteme sind für die Herstellung rekombinanter Proteine ​​verwendet werden, die Interpretation von zellulärem Handel / Lokalisierung und die Bestimmung der biochemischen Funktion von Proteinen an der Unter organismal Ebene. Obwohl Baculovirus-Expressionssysteme werden zunehmend für die Proteinproduktion in zahlreichen biotechnologischen, pharmazeutischen und industriellen Anwendungen, nichtlysierende Systemen verwendet, die nicht virale Infektion haben klare Vorteile beinhalten sie sind aber oft übersehen und nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen nichtlysierende Expressionsvektoren und transiente Expression von rekombinantem Protein. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen und kann verwendet werden, um schnell den Proteintransport in der Zelle zu unterscheiden. Wir zeigen die Expression von vier rekombinanten Proteinen in einer handelsüblichen Insektenzelllinie, einschließlich zwei Aquaporin - Proteine aus dem Insekten Bemisia tabaci, sowieals subzellulären Markerproteine ​​spezifisch für die Zellplasmamembran und für die intrazelluläre Lysosomen. Alle rekombinanten Proteine ​​wurden als Chimären mit fluoreszierendem Protein-Marker an ihrer Carboxyltermini hergestellt, die für den direkten Nachweis der rekombinanten Proteine ​​ermöglicht. Die Doppel-Transfektion von Zellen mit Plasmiden Konstrukten für die Gene von Interesse und einem bekannten subzellulären Marker ermöglicht lebende Zellen und eine verbesserte Validierung von zellulären Proteinlokalisierung beherbergen.

OE-PCR OE-PCR ermöglicht die Synthese von chimären DNA-Produkten, die, einmal in einen Expressionsvektor eingefügt ist, ermöglichen die Herstellung von rekombinanten chimären Proteinen zu jedem Test Gen von Interesse und fluoreszierenden Markerprotein entsprechen. 1 stellt ein allgemeines Schema für die Herstellung von PIB - Expressionsvektoren , enthaltend B. tabaci Aquaporin - codierenden Sequenzen (Bt...

Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte Proteine des Interesses in kommerziell erhältlichen Insektenzellen zu exprimieren, um die Aufklärung der Proteinfunktion und/oder des zellulären Proteintransports zu verbessern. Diese Methode kann helfen, zentrale, auf Zellbiologie und Biochemie basierende Fragen bezüglich der Proteinfunktionalität, Proteininteraktionen und/oder der subzellulären Proteinlokalisierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Konstrukte rasch erzeugt werden können und exprimierte Proteine funktional in lebenden Zellen untersucht werden können, ohne dass schädliche Effekte im Zusammenhang mit der Baculovirus-Expression auftreten, wodurch die Durchsatzrate verbessert wird.Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von Insektenproteinen ermöglicht, kann sie auch auf jedes andere System angewendet werden, bei dem die Untersuchung der Proteinfunktion oder zellulären Lokalisation gewünscht ist. Die Demonstration des Verfahrens für die Kultur und Transfektion von Insektenzellen übernimmt Danni LeRoy, eine Technikerin aus meinem Labor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie die Vorratsgef

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.

Engineering zellpermeablen Protein

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält,...

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Erfahren Sie die Expression fluoreszenzmarkierter Proteine in Insektenzellen zur Untersuchung von Proteinfunktion und zellulärem Transport. Diese Methode ermöglicht schnelle Vektorherstellung und funktionelle Analyse in lebenden Zellen ohne Viren.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

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