Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszenzmarkierte Proteine von Interesse in kommerziell erhältlichen Insektenzellen zu exprimieren, um die Proteinfunktion und/oder den zellulären Transport von Proteinen besser aufzuklären. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige zellbiologische und biochemische Fragen zur Proteinfunktionalität, Proteininteraktionen und/oder subzellulären Proteinlokalisierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Konstrukte schnell erzeugt und exprimierte Proteine in lebenden Zellen funktionell bewertet werden können, ohne dass es zu schädlichen Effekten im Zusammenhang mit der Baculovirus-Expression kommt, wodurch der Durchsatz verbessert wird.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von Insektenproteinen geben kann, kann sie auch auf jedes System angewendet werden, für das die Untersuchung der Proteinfunktion oder der zellulären Lokalisierung gewünscht wird. Das Verfahren für die Insektenzellkultur und Transfektion wird von Danni LeRoy, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert. Um diesen Vorgang zu starten, nehmen Sie Vorratsfläschchen mit gefrorenen SF9- und Tni-Zellen aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und lassen Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auftauen.

Dekontaminieren Sie die Fläschchen nach dem Auftauen mit 70%igem Ethanol und legen Sie sie auf Eis. Alle Zellmanipulationen, die das Öffnen von Fläschchen und Gewebekulturkolben erfordern, müssen innerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. Geben Sie vier Milliliter serumfreies Insektenmedium in einen neuen T25-Kolben und vier Milliliter TNM-FH-Medium in einen anderen T25-Kolben.

Ein Milliliter aufgetauter Tni-Zellen wird in den Kolben mit serumfreiem Insektenmedium und ein Milliliter aufgetaute SF9-Zellen in den Kolben mit TNM-FH-Medium überführt. Stellen Sie die Kolben in einen 28 Grad Celsius heißen, nicht befeuchteten Inkubator und lassen Sie die Zellen 30 bis 45 Minuten lang anlagern. Ersetzen Sie das Sämedium durch fünf Milliliter des entsprechenden Mediums.

Und geben Sie die Kolben wieder in den 28 Grad Celsius heißen, nicht befeuchteten Inkubator. Überwachen Sie die Zellkonfluenz täglich. Passieren Sie die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 90 % erreichen, wie diese repräsentativen Bilder zeigen.

Der Kolben mit den konfluenten Zellen wird so gekippt, dass das Medium in eine Ecke von der Zellmonoschicht weg fließt, und das Medium mit einer sterilen serologischen Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig entfernt, ohne die Zellen zu stören. Verwenden Sie für Tni-Zellen eine neue sterile serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um vorsichtig vier Milliliter serumfreies Insektenmedium auf die konfluente Monoschicht zu geben. Bewegen Sie die Pipettenspitze über den Kolben und spülen Sie langsam, um Zellen zu entfernen, die lose am Kolbenboden haften.

Um zu überprüfen, ob sich die Zellen ausreichend ablösen, entfernen Sie alle Medien, drehen Sie den Kolben um und achten Sie darauf, dass der Boden des Kolbens klar ist. Für SF9-Zellen, die fester haften, fügen Sie vier Milliliter frisches TNM-FH-Medium hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die anhaftenden Zellen zu entfernen. Verwenden Sie eine serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellverklumpung sanft zu mischen und zu reduzieren.

Nach dem Ablösen der Zellen werden ca. 0,1 Milliliter jeder Zell-Medium-Mischung in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen überführt. In ein separates 0,5-Milliliter-Mikrofurchenröhrchen werden 10 Mikroliter jeder Zell- und Mediummischung zu 10 Mikrolitern Trypanblau gegeben. Nehmen Sie den Objektträger der Zellzählerkammer aus der Verpackung und geben Sie 10 Mikroliter der Mischung aus dem Zellmedium Trypanblau auf jede Seite des Zählobjektträgers.

Setzen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein und bestimmen Sie die Zelldichte und Viabilität. Etwa eins bis 1,5 mal 10 bis zu den 6. Zellen in T25-Kolben mit frischem Medium überführen. Beschriften Sie die Kolben mit der Zelllinie, dem Datum, dem verwendeten Medium, der Anzahl der hinzugefügten Zellen und der Durchgangsnummer.

Stellen Sie die Kolben für bis zu 72 Stunden in einen 28 Grad Celsius heißen Inkubator. Das Verfahren zur Transfektion von Insektenzellen muss ebenfalls innerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Einen T25-Kolben mit bis zu einer mal 10 bis 6. Tni- oder SF9-Zellen in ein geeignetes Insektenzellmedium aussäen.

In dieser Demonstration werden Tni-Zellen verwendet. Lassen Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 18 Grad Celsius konfluenz. Entfernen und entsorgen Sie 72 Stunden später das alte Medium und entfernen Sie die Tni-Zellen mit vier Millilitern frischem serumfreiem Insektenmedium, wie zuvor gezeigt.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die entsprechende Dichte der Zellen zu erreichen, die während der Transfektion an den Glasbodenschalen befestigt sind. Zu jeder Schale sollten nicht mehr als sieben mal 10 bis zur 5. Zelle hinzugefügt werden. Nach der Verwendung eines automatisierten Zellzählers zur Schätzung der Zelldichte mischen Sie die Zellsuspension gründlich, aber schonend, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und fügen Sie etwa siebenmal 10 zu den 5. Zellen in einzelne 35-Millimeter-Glasbodenschalen hinzu.

Lassen Sie die Zellen 20 bis 25 Minuten bei 28 Grad Celsius anheften. Für jede Transfektion werden zwei Mikrogramm Plasmid-DNA zu 0,1 Millilitern serumfreiem Insektenmedium ohne FBS in einem sterilen 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen gegeben. Mischen Sie in einem separaten Röhrchen acht Mikroliter Transfektionsreagenz mit 0,1 Millilitern serumfreiem Insektenmedium.

Übertragen Sie dann die Lösung in das Röhrchen mit der gewünschten Plasmid-DNA. Leicht vortexen und 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes verdünnen Sie das Plasmidtransfektionsgemisch mit 0,8 Millilitern serumfreiem Insektenmedium, wodurch das Gesamtvolumen auf einen Milliliter ansteigt.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus der Glasschale mit den anhaftenden Zellen. Überlagern Sie die anhaftenden Zellen mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsmedium. Inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 28 Grad Celsius.

Entfernen und entsorgen Sie nach fünf Stunden das Transfektionsmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter serumfreiem Insektenmedium, wobei Sie darauf achten müssen, die Zellen nicht zu verdrängen. Fügen Sie zwei Milliliter frisches, serumfreies Insektenzellmedium hinzu und inkubieren Sie es 48 bis 72 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion der Insektenzellen die Zellen einmal mit einem Milliliter IPL-41 Insektenmedium waschen und dann zur Bildgebung mit zwei Millilitern IPL-41 bedecken.

Geben Sie vier Tropfen Hoechst Lebendzellfärbereagenz in das Medium und inkubieren Sie es 20 bis 25 Minuten lang bei 28 Grad Celsius. Setzen Sie die 35-Millimeter-Schüssel in das in sich geschlossene konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Obwohl viele Glasschalen im Handel erhältlich sind, ist es wichtig, dass sie auf den Mikroskoptisch passen, und es kann notwendig sein, empirisch zu bestimmen, welche Glaswaren am besten mit der Zellanhaftung kompatibel sind.

Stellen Sie das Mikroskop auf Hoechst-, EGFP- und mCherry-Beobachtungsbedingungen ein. 359 Nanometer und 461 Nanometer für Hoechst-Anregung und -Emission. 489 Nanometer und 510 Nanometer für EGFP-Anregung und -Emission.

Und 580 Nanometer und 610 Nanometer für mCherry-Anregung und -Emission. Führen Sie mit einem 10-fachen Objektiv einen ersten Scan durch, um die Fluoreszenzexpression zu bestätigen. Wechseln Sie danach mit einem Wasserimmersionsobjektiv mit 60-fachem Phasenkontrast in den Scan-Modus.

Passen Sie die Laserleistung, die Empfindlichkeit des Detektors, die Scangeschwindigkeit, die Tiefe der Z-Achse und den Digitalzoom an, um den Bildkontrast und die Auflösung zu optimieren. Bilden Sie die Zellen mit 1,5-fachem Digitalzoom ab, um eine insgesamt 90-fache Verstärkung zu erhalten. Speichern und exportieren Sie die Rohdaten als TIFF-Bilddateien für eine spätere Analyse.

Tni-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert und die Expression rekombinanter Proteine mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die erfolgreiche Transfektion und Expression von rekombinantem BtDrip1-EGFP wird durch das Vorhandensein von grüner Fluoreszenz auf der Zelloberfläche deutlich. Zellen, die mit BtDrip2 Version eins EGFP transfiziert wurden, zeigen eine grüne Fluoreszenz im Inneren, die auf die intrazelluläre Expression von BtDrip2 Version eins hinweist.

Ebenso zeigen Zellen, die mit PIB DmSPR-mCherry oder PIB PLA2G15-mCherry transfiziert wurden, eine rote Fluoreszenz, die auf die Expression der jeweiligen Chimären hinweist. In den zusammengefügten Bildern zeigen die orangefarbenen oder gelben Bereiche die Expression von EGFP und mCherry an, was darauf hindeutet, dass die Proteine innerhalb derselben subzellulären Strukturen kolokalisiert sind. Eine Überlagerung von Zellen, die doppelt transfiziert mit PIB BtDrip1-EGFP und PIB DmSPR-mCherry sind, deutet auf eine Co-Lokalisierung von BtDrip1-EGFP und DmSPR-mCherry auf der Zelloberfläche hin.

Zellen, die mit BtDrip2 Version eins, EGFP und PIB DmSPR-mCherry doppelt transfiziert wurden, zeigen eine geringe Kolokalisation von grünen und roten Fluoreszenzsignalen, was die intrazelluläre Expression von BtDrip2 Version eins bestätigt. Im Gegensatz dazu führte die Co-Expression von PIB BtDrip2 Version eins EGFP und dem PIB PLA2G15-mCherry lysosomalen Marker zu einer signifikanten Überlappung der zytoplasmatischen grünen und roten Fluoreszenzsignale. Dies deutet stark darauf hin, dass BtDrip2 der Verkehr zu interzellulären Lysosomen ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie fluoreszierende Proteinchimären in kultivierten Insektenzellen exprimiert werden. Dieses System ermöglicht eine schnelle Vektorkonstruktion bei der Proteinsynthese, vermeidet Herausforderungen virusbasierter Expressionssysteme und bietet ein robustes Mittel zur Beobachtung von zellulären Proteinen.