Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Dieses Protokoll ermöglicht einen bequemen präparativen Zugang zu Triterpenverbindungen für die Verwendung in nachgelagerten Studien, wie z. B. der strukturellen Charakterisierung oder dem Ablauf medizinisch relevanter biologischer Aktivität. Das Protokoll ist schnell, skalierbar und ermöglicht die Verwendung von Kombinationen von Enzymen einfach durch die Co-Infiltration verschiedener Stämme von Agrobacterium, wodurch die Notwendigkeit entfällt, große Multi-Gen-Vektoren zu konstruieren. Beimpfen Sie zunächst eine selektive LB-Agarplatte mit Streifen der gewünschten Agrobacterium tumefaciens-Stämme aus Glycerin-Stammkulturen.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem stehenden Inkubator. Am nächsten Tag beimpfen Sie einzeln 50 Milliliter selektives LB-Medium mit einer Probe jedes Agrobacterium tumefaciens-Stammes. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min.

Die 50-Milliliter-Kulturen werden einzeln auf 1.000 Milliliter selektives LB-Medium umgefüllt und über Nacht bei 28 Grad Celsius im Schüttelinkubator bei 200 U/min inkubiert. Am nächsten Tag pelletieren Sie das Agrobacterium tumefaciens einzeln aus den Flüssigkulturen durch Zentrifugation bei 4.000 mal g. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Pellets einzeln in 50 Millilitern frisch zubereitetem MMA-Puffer

Inkubieren Sie die resuspendierten Pellets bei Raumtemperatur im Dunkeln für eine Stunde. Bestimmen Sie nun das geeignete Volumen jeder Agrobacterium tumefaciens MMA-Suspension, um eine endgültige OD 600 von mindestens 0,2 in einem Gesamtendvolumen von 10 Litern herzustellen. Kombinieren Sie die ermittelten Volumina der einzelnen Suspensionen.

Geben Sie nun zusätzlichen MMA-Puffer zu den kombinierten Suspensionen bis zu einem Endvolumen von einem Liter, um sofort für die Vakuuminfiltration verwendet zu werden. Übertragen Sie den einen Liter Versickerungssuspension und den einen Liter MMA-Puffer mit 10-facher Stärke in das Versickerungsbad, gefolgt von weiteren acht Litern Wasser. Entfernen Sie die abnehmbaren Flügel des maßgeschneiderten Pflanzenhalters.

Setzen Sie vier fünf Wochen alte Pflanzen ein, die wie im Textprotokoll beschrieben gezüchtet wurden, und befestigen Sie die Flügel wieder. Die Versickerungsabdeckung wird beeinträchtigt, wenn die Blätter nicht vollständig in die Versickerungssuspension eingetaucht sind. Dieses Problem wird minimiert, indem sichergestellt wird, dass die Höhe der Suspension vor der Vakuumbehandlung die Oberseite des Pflanzenhalters erreicht.

Drehen Sie den Halter um und stellen Sie ihn auf das Versickerungsbad, um die Blätter in die Versickerungssuspension zu tauchen. Bringen Sie das Versickerungsbad mit den untergetauchten Pflanzen in die Versickerungskammer und schließen Sie die Tür. Stellen Sie sicher, dass das Lufteinlassventil am Infiltrator geschlossen ist.

Öffnen Sie nach dem Einschalten der Vakuumpumpe das Vakuumeinlassventil an der Infiltrationskammer. Sobald der Druck in der Infiltrationskammer um 880 Millibar gesunken ist, schließen Sie das Vakuumeinlassventil und öffnen Sie das Lufteinlassventil. Wenn Sie wieder auf Atmosphärendruck zurückgekehrt sind, öffnen Sie die Tür und entfernen Sie das Versickerungsbad.

Heben Sie nun den Pflanzenhalter an, bis die Pflanzen nicht mehr in der Versickerungssuspension eingetaucht sind. Schütteln Sie dann vorsichtig den Halter, damit überschüssige Suspension von den Blättern zurück in das Versickerungsbad ablaufen kann. Zum Schluss bringst Du den Halter wieder in die aufrechte Position, entfernst die abnehmbaren Flügel und entfernst die Pflanzen.

Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius in 16 Stunden pro Tag Licht mit täglicher Bewässerung. Nach fünf Tagen Wachstum ernten Sie die Blätter und trocknen sie dann, wie im Textprotokoll beschrieben. Mahlen Sie die getrockneten Blätter auf bequeme Weise zu einem groben Pulver, z. B. mit einer Haushaltsküchenmaschine oder indem Sie die Blätter manuell zerkleinern, während sie sich in einem Beutel befinden.

Mischen Sie das Blattpulver mit Quarzsand in einem geeigneten Behälter. Dies wirkt als Dispergiermittel und verbessert die Effizienz des Extraktionsprozesses. Bereiten Sie nun vier Extraktionszellen für die Befüllung vor, indem Sie sie zunächst umdrehen.

Setzen Sie dann den Glasfaserfilter ein, gefolgt von der Metallfritte und dem Haltestopfen. Stellen Sie die Extraktionszellen wieder in die aufrechte Position und fügen Sie eine einen Zentimeter tiefe Schicht Quarzsand hinzu. Befüllen Sie die Extraktionszellen mit dem vorbereiteten Blattpulver bis zur Fülllinie.

Falls erforderlich, komprimieren Sie das Pulver während dieses Prozesses vorsichtig, um die Zugabe einer größeren Menge in jede Extraktionszelle zu erleichtern. Geben Sie nun eine kleine Schicht Quarzsand auf die Oberseite des verpackten Pulvers und setzen Sie den oberen Zellulosefilter ein. Setzen Sie die verpackten Extraktionszellen in das unter Druck stehende Lösungsmittelextraktionsgerät ein und führen Sie die gewünschte Methode aus.

Sobald die Methode abgeschlossen ist, wird die kombinierte Extraktionslauge durch Rotationsverdampfung unter Vakuum auf Trockenheit konzentriert, wie im Textprotokoll beschrieben. Prüfen Sie, ob die erwartete Leistung einer dunkelgrünen Aufschlämmung zu erwarten ist. Um die Chlorophylle zu entfernen, lösen Sie zunächst den Rohextrakt mit basischem Ionenaustauscherharz in einem minimalen Volumen Ethanol auf.

Fügen Sie der resultierenden Lösung 50 Milliliter basische Ionenaustauscherharzkügelchen hinzu. Dann 30 Minuten bei Raumtemperatur rühren. Fügen Sie alle 30 Minuten weitere 50 Milliliter basische Ionenaustauscherharzkügelchen hinzu, bis die Reaktion abgeschlossen ist.

Zuerst sind die basischen Ionenaustauscherharzkügelchen rosa und die flüssige Phase grün. Im Verlauf der Reaktion färben sich die Harzperlen je nach Skala grün und die flüssige Phase orange oder trübbraun. Filtrieren Sie das Reaktionsgemisch durch eine kurze Säule aus Kieselgur über eine Glas-Flash-Chromatographie-Säule und üben Sie mit einem Handbalg Druck aus.

Spülen Sie die gesammelten Harzkügelchen mit Ethanol, gefolgt von Eins-zu-Eins-Ethanol zu Hexan und schließlich mit Hexan. Verwende ein Spülvolumen, das ausreicht, um die Kügelchen auf der Kieselgursäule wieder zu suspendieren. Zum Schluss werden das Filtrat, die Spülungen und das Konzentrat durch Rotationsverdampfung unter Vakuum bis zur Trockenheit kombiniert.

Hier ist ein Bild der Blätter einer Pflanze zu sehen, die fünf Tage nach dem Wachstum nach der Infiltration mit einem Expressionskonstrukt für das fluoreszierende Protein GFP infiltriert wurden. Dies verdeutlicht das Ausmaß der Infiltrationsabdeckung, die zu erwarten ist. Die Blätter sind von links oben nach rechts unten im Bild in absteigender Reihenfolge angeordnet, bezogen auf ihre ursprüngliche Höhe auf der Pflanze.

Dieses Bild zeigt 0,8 Gramm Beta-Amyrin, das mit diesem Protokoll hergestellt wird, was einem Reinheitsgrad von mehr als 98 % entspricht. Das Experiment wurde im Maßstab von 459 Pflanzen durchgeführt und entspricht einem isolierten Ertrag von 3,3 Milligramm pro Gramm trockenem Blattmaterial. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass nur infiltrierte Blätter Ihre interessante Verbindung produzieren.

Es ist daher von Vorteil, diese Blätter nach Möglichkeit selektiv zu ernten, um eine Verdünnung Ihrer Probe mit unproduktivem Gewebe zu verhindern. Die Schritte nach der Ernte in diesem Protokoll dienen zur Veranschaulichung. Sie können durch andere Reinigungstechniken zur Extraktion von Naturstoffen ersetzt werden, abhängig von der Verfügbarkeit von Fachwissen und/oder Einrichtungen in Ihrer Einrichtung.

Wir fanden heraus, dass die grundlegende Ionenaustauscherharzbehandlung, die in diesem Protokoll vorgestellt wird, eine bequeme Alternative zur traditionelleren Verseifung ist, gefolgt von einer Flüssig-Flüssig-Teilung zur Entfernung von Chlorophyllen in größeren Maßstäben. Bevor Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Sie sich mit den Sicherheitsdaten aller verwendeten Stoffe vertraut machen und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen treffen. Die örtliche Gesetzgebung für die Arbeit mit transgenem Material sollte überprüft und eingehalten werden, einschließlich der Befolgung geeigneter Einschließungsverfahren.