Name: Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die transiente Expression in Nicotiana benthamiana Blättern für die präparative Produktion hochwertiger Triterpene. Diese Methode ermöglicht Forschern die schnelle Biosynthese wertvoller Naturstoffe.

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Diese Arbeit von einem Norwich Research Park Zugehörigkeit (JR) unterstützt wurde, gewähren die gemeinsame Entwicklung und Physical Sciences Research Council/biotechnologisch und biologische Wissenschaften Research Council BBSRC finanziert OpenPlant synthetische Biologie Forschungszentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., U.A.); ein John Innes Centre Wissensaustausch und Vermarktung gewähren (BB/KEC1740/1) (b.b.); und die BBSRC Institut Strategieprogramm Grant "Moleküle aus der Natur" (BB/P012523/1) und John Innes Foundation (U.A.). Wir möchten danken George Lomonossoff für die Bereitstellung der pEAQ-Vektoren und Andrew Davis für die Fotografie.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hoher Durchsatz Vakuum Infiltration kann dieses Protokoll regelmäßig in unserem Labor für die präparative Herstellung von Triterpene Verbindungen des Interesses für verschiedene downstream-Anwendungen verwendet werden. Die hier beschriebenen Vakuum Infiltration Apparat ist leicht repliziert. Zugabe von Vakuum-Speicher ist ratsam, verringern den Zeitaufwand für das notwendige Vakuum ziehen, aber es ist möglich, eine unveränderte Vakuumofen als die Infiltration Kammer einfach wiederverwenden. Zum Schutz der Vakuumpumpe durch Zusatz eines geeigneten Kondensators ist theoretisch sinnvoll, aber in unserem Labor haben wir gefunden, dass dies für unnötig.
Infiltration-Abdeckung ist gefährdet, wenn die Blätter nicht vollständig in der Infiltration Suspension eingetaucht sind. Dieses Problem wird minimiert, indem sichergestellt wird, dass die obere Fläche der pflanzenhalter erreicht das Niveau der Suspension, und dass der pflanzenhalter einen festen Sitz für die Infiltration Bad. Beachten Sie aus Abbildung 2 , dass die obere Fläche der pflanzenhalter in dem Infiltration Bad im Ort eingelassen ist. Dies wird Panels auf die mittleren Kanten des Inhabers bilden den Ankerpunkt am oberen Rand der Infiltration Bad. Die Infiltration Aussetzung erfordert regelmäßige Ergänzungen um die Suspendierung aufrechtzuerhalten. Dies geschieht am besten durch Zugabe von überschüssigen Infiltration Aussetzung, schrittweise Verringerung des OD600 im Laufe einer großen diskontinuierlichen eindringen zu verhindern. Jedoch in unseren Händen scheint Ersatz für Wasser nicht haben eine spürbare Wirkung auf die zu erwartenden Erträge im präparativen Maßstab, obwohl dies nicht quantitativ untersucht wurde. Wie viele Pflanzen aus einer Charge von Infiltration Aussetzung infiltriert werden können, ist noch offen. Wir routinemäßig zwischen 100 und 200 Pflanzen mit einem Batch von Infiltration Aussetzung zu infiltrieren. Darüber hinaus ist es normal, dass etwas Erde in die Infiltration Suspension im Laufe der infiltrationsprozess Leach. Dies wurde nicht gefunden, um eine spürbare Wirkung auf Infiltration Wirksamkeit zu haben.
Während der Ernte ist es ratsam (aber nicht kritisch), nur die Blätter zu ernten, die infiltriert wurden (einige Blätter wachsen nach dem Eindringen). Selektiver Lese verhindert Verdünnung mit unproduktiven Gewebe, die sonst das Verhältnis von endogenen Verunreinigungen im Verhältnis zu der Verbindung von Interesse erhöhen würde. Dies hat einen nominalen Einfluss auf die Leichtigkeit der nachgeschalteten Reinigung und erhöht das Ausmaß dieser Prozesse. Wenn Sie tHMGR verwenden, um Vorläufer Versorgung zu steigern, wird ein necrosed Phänotyp häufig beobachtet, über die Post-Infiltration Wachstumsphase zu entwickeln. Dies ist normal und eigentlich unterstützt selektive Lese und den nachgeschalteten Trocknungsprozess. Das getrocknete Blattpulver kann in der Regel in einem verschlossenen Behälter an einem kühlen, trockenen und dunklen Ort, sondern im Idealfall in einem Exsikkator unter Vakuum gespeichert werden. Dies hängt von der Stabilität der Verbindung von Interesse. Seien Sie vorsichtig, wenn die Wahl in einem-80 ° C Gefrierschrank zu speichern. Sicherstellen, dass die getrockneten Blätter werden in einem wasserdichten Behälter und auf Entfernung aus dem Speicher, ermöglichen diese Container auf Raumtemperatur vor Eröffnung. Nichtbeachtung führt Wiedervernässung der Blätter, Down-Stream-Verarbeitung zu behindern.
Die Schritte nach der Ernte in diesem Protokoll sind für illustrative Zwecke zur Verfügung gestellt und zur Unterstützung jener Forscher, die praktische Chemie begrenzt haben können erleben. Sie können für viele andere Naturprodukt Extraktion/Reinigung Techniken ersetzt werden. Wie in der Einleitung PSE hat viele Vorteile, aber die Kapitalkosten der im Handel erhältlichen PSE-Gerät möglicherweise unerschwinglich und es ist nicht wichtig. Grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung ist eine sehr bequeme Methode, traditionelle Verseifung gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung zu ersetzen. Es ist jedoch nicht geeignet für Produkte mit Carbonsäure oder funktionelle Gruppen, die unter Rahmenbedingungen, wie z. B. Ester hydrolysiert werden würde. Diese Produkte dürften auf die grundlegenden Ionenaustauschharz beibehalten werden. Allerdings gibt es potenziellen nutzen dies für eine Aufnahme und Verfahren (hier nicht dokumentiert). Wo traditionelle Verseifung angemessen wäre, dient grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung als eine bequeme Alternative. Die beschriebene in Schritt 9, Chromatographie-Methode worden für die Verbindungen, die in Abbildung 3beschriebenen verallgemeinerbare sein gefunden. Verbindungen der erhöhte Polarität können jedoch 100 % Ethylacetat Elution längere erforderlich. Mit Bezug auf Schritt 9.2 nachgeschaltete feine Reinigung ist völlig zusammengesetzte spezifisch und ist auch abhängig von Skala. Wiederholte Runden der kleineren Flash-Chromatographie mit optimierten Steigungen, ist in der Regel ausreichend, um eine Reinheit für NMR-Analyse zu erreichen. In größeren Maßstäben ist Kristallisation oft eine günstige Alternative. In schwierigen Fällen kann abhängig von der gewünschten Menge des isolierten Verbindung präparative oder semi-präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt werden. An anderer Stelle finden Sie einige Beispiele für nachgeschaltete Reinigungsverfahren für eine Reihe von repräsentativen Verbindungen8.
Das aktuelle Protokoll wie hier vorgestellt, wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, und Dienstprogramm bewährt hat. Allerdings gibt es noch genügend Spielraum für eine weitere Optimierung der Ausdruck Plattform. In unserem Labor zu untersuchen, wie weitere Weg-Technik wird derzeit gearbeitet und differenzierte Steuerung der Ausdruck proteingehalte könnten Triterpene Produktion weiter, während der Vermittlung Toxizität für Wirtszellen verbessern. Es gibt auch Potenzial zu untersuchen, die Manipulation der intrazellulären Transport Systeme20,21und die Richtung von Enzymen zu verschiedenen zellulären Kompartimenten22,23, Alleen, die verbessert werden könnte die Effizienz der mehrere Oxidation Ereignisse. Nutzenpotenziale für das Ändern der zugrunde liegenden Morphologie der wichtigsten Organellen könnte auch geprüft werden. Zum Beispiel wurde Überexpression des Geschäftsfeldes Membran von Arabidopsis Thaliana HMGR beobachtet, Hypertrophie der dem endoplasmatischen Retikulum in Pflanzen24induzieren; eine wichtige Seite für CYP450-Aktivität. Dieses Protokoll eignet sich ideal für die Herstellung von Milligramm, Gramm-Mengen Triterpene Produkte und kann inmitten der Forschung eingesetzt werden, um Verbindungen für nachgeschaltete Studie (z. B. der systematischen Erforschung von Struktur-Aktivitäts zugreifen Beziehungen und Voruntersuchungen in die pharmakodynamische und Pharmakokinetische Eigenschaften von Bleiverbindungen von klinischen Interesse). Aber die Plattform ist linear zuverlässig skalierbar einfach durch eine Erhöhung der Anzahl der verwendeten Pflanzen und die Praktikabilität der transienten Expression über Agroinfiltration nachgewiesen und im industriellen Maßstab für die Herstellung von Pharmaproteinen 14, so besteht für diese Plattform für kommerzielle Produktion von qualitativ hochwertigen TRITERPENE erweitert werden. Alternativ ist es auch möglich, die Herstellung von stabilen transformanten tragen die abgeschlossene Wunsch multigene biosynthetische Bahn, so dass die Masse Anbau vorstellen und weitere "farming" von transgenen N. Benthamiana Stämme Herstellung von verschiedenen Verbindungen von kommerziellen Wert.

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Trotz ihrer immensen Vielfalt sind alle Triterpene Naturprodukte vermutlich die gleichen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene, ein Produkt des Mevalonat-Signalwegs in Anlagen abgeleitet werden. Biosyntheseschritt von 2,3-Oxidosqualene initiiert und gesteuert durch eine Familie von Enzymen Oxidosqualene Cyclases (OSCs) bezeichnet. Dieser biosyntheseschritt Schritt der ersten Ebene der Diversifizierung, mit Hunderten von verschiedenen Triterpene Gerüste von Natur1berichtet worden. Diese Gerüste sind weiter diversifiziert und durch maßgeschneiderte Enzyme, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Cytochrom p450s (CYP450s)1,2. Solchen biosynthetischen Bahnen führen zu immensen Komplexität, was manchmal zu Endprodukten, die aus der übergeordneten Triterpene kaum erkennbar sind. Zum Beispiel ist die komplexe Struktur der potenten Insektizide und Antifeedant Limonoid Azadirachtin glaubte, ein Tetracyclic Triterpene Tirucallane Typ3abgeleitet.
Viele Triterpene abgeleitet Naturprodukte, auch solche mit relativ unveränderten Elternteil Gerüste, nachweislich medizinisch relevanten biologischen Aktivität4,5,6,7besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows.
Transiente Expression von Triterpene biosynthetischen Enzymen aus anderen Pflanzenarten in N. Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten (Abbildung 1) umleiten. Dieser Prozess lässt sich funktionell charakterisieren Kandidat Enzyme und die biosynthetischen Bahnen wichtig natürlich vorkommende Stoffwechselprodukte zu rekonstruieren. Ebenso kann es auch ausgenutzt werden kombinatorische biosynthetischen Ansätze, neuartige Triterpene Produkte, eine Strategie zu produzieren, die in den Bibliotheken von strukturell verwandten Analoga, so dass systematische Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen führen kann biologisch aktive Blei-Verbindungen8,9.
Agroinfiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana Blättern. Der Prozess umfasst die Infiltration der Blätter mit einer Suspension von A. Tumefaciens tragen die binären Ausdruck Construct(s) von Interesse. Dies geschieht über die Anwendung von Druck, die Flüssigkeit durch die Stomata, Luft in den interzellularraum verdrängt und ersetzt sie durch A. Tumefaciens Federung zwingt. Die Bakterien übertragen die jeweiligen T-DNA in das Innere der Pflanzenzellen, wodurch lokalisierte und transiente Protein-Expression in den infiltrierten Blattgewebe.
Während alle binären Vektor geeignet für Erzeugung transgene Pflanzen für transiente Expression eingesetzt werden kann, wir nutzen das Cowpea Mosaik Virus CPMV abgeleitet Hypertranslational (HT) Protein Ausdruck System10, 11. in diesem System wird das Gen des Interesses von unübersetzte Regionen (UTR) aus CPMV RNA-2 flankiert. Die 5' UTR enthält Änderungen, was zu sehr hohen Protein-Übersetzung mit keine Abhängigkeit von Virusreplikation12. Diese Technik wurde in der Easy-Quick (pEAQ) binäre Vector Serie entwickelt die ortsspezifische Rekombination Klonen Protokoll-kompatiblen Konstrukte (pEAQ -HT- DEST)10,11umfasst. Die meisten pEAQ Vektoren enthalten auch eine Tomate buschigen Stunt Virus abgeleitet P19 stummschaltungs-Suppressor gen13 innerhalb der T-DNA als Bestandteil der Expressionskassette, umgeht die Notwendigkeit, eine separate P19-tragenden Sorte coinfiltrate und bietet sehr High-Level Protein-Expression in den Host Pflanze Zelle10,11.
Verwendung von N. Benthamiana als ein Ausdruck Host besondere Vorteile hat bei der Arbeit mit Pflanzen biosynthetischen Bahnen. Die Zellarchitektur unterstützt intrinsisch entsprechenden mRNA und Protein-Verarbeitung und ordnungsgemäße Abschottung, neben der notwendigen Coenzyme, Reduktasen (für CYP450s) und metabolischen Grundstoffe. Die Kohlenstoffquelle ist Photosynthese; So können Pflanzen einfach in qualitativ hochwertigem Kompost, erfordern nur Wasser, CO2 (aus der Luft) und Sonnenlicht als Eingänge angebaut werden. Die Plattform ist auch sehr praktisch für Co Ausdruck von verschiedenen Kombinationen von Proteinen, wie dies durch das Co Eindringen verschiedener Stämme von A. Tumefaciens, negiert die Notwendigkeit, große multigene Ausdruck erstellen facilely erreicht werden kann Kassetten. Darüber hinaus kann der Prozess zuverlässig und linear skaliert werden einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment.
Bisherige Arbeit in unserem Labor hat die Nützlichkeit dieser Plattform für präparative Skala Experimente gezeigt. Dazu gehörten die Vorbereitung der neuartigen TRITERPENE für Bioaktivität Assays und Skala bis Gramm-Mengen isoliertes Produkt zu erreichen. Des weiteren Ansammlung von heterogenen Triterpene Produkte gesteigert werden kann mehrere Falten durch Co Ausdruck einer N-Terminal-abgeschnitten, Feedback-unempfindliche Form des 3-hydroxy-, 3-Methyglutary-Coenzym eine Reduktase (tHMGR), eine Bandbreitenbegrenzung vor- Enzym in der Mevalonate Bahn8.
Schlüssel für solche Experimente präparative-Skala ist die Möglichkeit, bequem bis-der Infiltrationsvorgang Skala. In einem typischen Experiment möglicherweise Dutzende bis Hunderte von Pflanzen müssen die Zielmenge isoliertes Produkt zu erreichen. Infiltrieren einzelne Blätter von hand ist (mit einer unnötigen Spritze), operativ anspruchsvoll und oft sehr zeitaufwendig, Rendern diese Methode nicht praktikabel für routinemäßige Scale-Up. Vakuum Infiltration bietet Vorteile gegenüber Hand Infiltration, wie es nicht abhängig von der Spielstärke des Betreibers ist und das Eindringen von einen größeren Bereich der Blattoberfläche ermöglicht. Dieses Verfahren ist für die großtechnische Produktion von Pharmaproteinen14kommerziell genutzt. Dieses Protokoll verwendet eine leicht replizierbar Vakuum Infiltration Vorrichtung, die aus handelsüblichen Teilen konstruiert werden kann. Dies ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu 4 Pflanzen, bieten schnelle und praktische diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit (Abbildung 2a -2 b). Das Vakuum Infiltration Apparatur besteht aus einem Vakuumofen bildet die Infiltration Kammer (Abb. 2f). Der Ofen ist mit einer Pumpe über ein Vakuum-Speicher verbunden. Dies reduziert den Zeitaufwand für das gewünschte Vakuum in der Infiltration Kammer zu erreichen. Pflanzen sind gesichert in einem maßgeschneiderten Halter und in einem 10 L Edelstahl Wasserbad gefüllt mit A. Tumefaciens Federung invertiert (Abbildung 2a -2 c). Vollständiges Eintauchen die oberirdischen Teile der Pflanzen ist wichtig für effiziente Infiltration. Das Wasserbad wird dann innerhalb der Infiltration Kammer platziert (Abb. 2d -2e), und das Vakuum angewendet, um die Luft aus den Zwischenräumen Blatt zu ziehen. Sobald der Druck wurde um 880 Mbar (ein Prozess, der dauert ca. 1 min) reduziert die Infiltration Kammer wird zurückgebracht schnell auf den atmosphärischen Druck über 20-30 s durch Öffnen des Einlassventils Ofen, worauf Infiltration abgeschlossen ist.
Fünf Tage nach Eindringen ist das Pflanzenmaterial bereit für die Ernte und die anschließende Extraktion und Isolierung der gewünschten Produkte. Ab diesem Zeitpunkt ist der Prozess einfach eines Naturprodukt Extraktion und Reinigung von Blattmaterial, einen Workflow, der jeder Naturprodukt Apotheke vertraut ist. Es gibt viele verschiedene Methoden für die erste Extraktion und anschliessende Reinigung15. Die am besten geeignete Wahl der Methoden und die genauen Bedingungen verwendet ist stark abhängig von der besonderen chemischen Eigenschaften der Verbindung von Interesse, neben der Verfügbarkeit von Fähigkeiten und/oder Ausrüstung. Es ist nicht möglich, in diesem Protokoll eine voll verallgemeinerbare, Schritt für Schritt Methode für die Weiterverarbeitung von geernteten Blatt Pflanzenmaterial, isoliertes Produkt enthalten, die für jedes Triterpene Produkt von Interesse Blind gefolgt werden könnte, noch wäre es sollten Sie versuchen, dies zu tun. Jedoch wird dieses Protokoll geben einen Überblick über die grundlegenden Workflow verwendet in unserem Labor und einige Methoden für die frühen Phasen des Prozesses, die nach unserer Erfahrung für die meisten sauerstoffreiches aglykon Triterpene Produkte verallgemeinerbare bewiesen haben. Dazu gehören zwei relativ seltene Techniken, nämlich unter Druck gesetzt Lösungsmittel Extraktion (SPE) und eine bequeme heterogenen Phase Methode für Chlorophyll Entfernung mit einem stark basischen Ionenaustausch-Harz.
PSE ist eine hocheffiziente Technik für die Gewinnung von kleine organische Moleküle aus festen Matrizen. Der Hauptvorteil ist die Fähigkeit, gemilderten Temperaturen zu verwenden, die das Kochen mehr als Punkt des Lösungsmittels Extraktion, Extraktionen sind unter Druck (ca. 100-200 Bar) durchgeführt. Dies reduziert erheblich die Zeit und die Menge des Lösungsmittels erforderlich, um eine vollständige Extraktion zu erreichen, im Vergleich zu anderen heiße Lösungsmittel Techniken wie einfache zurückfließt oder Soxhlet-Extraktion-16. Kommerzielle Benchtop-PSE Instrumente zur Verfügung, die austauschbar Extraktion Zellen und automatisierte Lösungsmittel Umgang mit Heizung und Überwachung nutzen. Dies macht diese Technik sehr bequem. Es ist auch wohl weniger gefährlich, besonders für Betreiber mit begrenzten praktischen Chemie Erfahrung.
Verseifung von groben Blatt-Extrakten unter Rückfluss gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung ist ein verbreitetes Verfahren für die Bulk-Entfernung von Chlorophylle vor nachfolgende Reinigung oder Analyse. Jedoch kann dies oft operativ in größeren Maßstäben anspruchsvoll sein. Darüber hinaus kann die Erkennung der Schnittstelle oder Produktverlust durch die Bildung von Emulsionen problematisch sein. Die Verwendung von stark basischen Ionenaustauscher heterogenen Phase Hydrolyse durchführen kann als eine bequeme Alternative dienen. Die pigmentierte Portion hydrolysiertes Chlorophyll bleibt das Harz eingehalten und kann einfach durch Filtration entfernt werden. Dieses Protokoll nutzt eine präparative Skala Anpassung einer bereits gemeldeten analytische Verfahren17 , die einem im Handel erhältlichen grundlegende Ionenaustauschharz beschäftigt.
Nachfolgend beschreiben wir eine detaillierte und schnelle Protokoll für die präparative Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform. Dieses Protokoll wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, um vorzubereiten Dutzende bis Hunderte von Milligramm isolierten Triterpene Produkt für Anwendungen eine strukturelle Charakterisierung von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und/oder weiter zu studieren in funktionalen Assays.

<table><tbody><tr><td>GC-MS-Gerät</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler geeignet für PCR-Reaktionen</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten mit einstellbarer Luftverdrängung (Größen : 1000 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 20 & Mikro; L, 10 & Mikro; L und 2 &micro; L )</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoffträger mit breitem Oberteil (Größe: 2 l)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge (Kapazität: 24 x 1,5/2 ml, max. Drehzahl: =/> 15000 U/min)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge (Kapazität: 20 x 50 ml, max. Drehzahl: =/> 4000 U/min)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Große bodenstehende Zentrifuge (Kapazität: 4 x 1 l, max. Drehzahl: =/> 4000 U/min)</td><td>beliebig</td> n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>Stehender Inkubator</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelbrutschrank (Flaschenklemmengrößen: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen (1 L)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vakuuminfiltrationsapparat</td><td>nach Maß</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm Pflanztöpfe</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrocknungsgerät (=/> 8 Liter Kondensatorkapazität)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Büchi SpeedExtractor 914 mit 120 mL Extraktionszellen (PSE-Instrument)</td><td>Büchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampferapparat</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Verdampferkolben (Größen: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran Flaschen (Größen: 1 L, 10 L)</td><td>beliebig</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Konuskolben (Größen 100 mL, 2 L)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatel (verschiedene Größen)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage (5 Ziffern)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Waage (2 Ziffern)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Messzylinder (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 Gefrierschrank</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera Gerät mit 250 mL Entnahmegestell und Flaschen (automatisiertes Flash-Chromatographie-Gerät</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Schutzbrille</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Laborkittel</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td><stark>Verbrauchsmaterialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (Größen : 1000 & micro; L, 200 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 20 & Mikro; L, 10 & Mikro; L und 2 &micro; L )</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (Größe: 2 mL)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (Größen: 15 mL, 50 mL)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten (Größe 2 mL)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (Größe: 100 mL)</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100 g Flash Kartuschen</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Fläschchen (1 mL), Fläschcheneinsätze und Verschlüsse</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Einweg lila Nitril Handschuhe</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Oberfilter für E-914, Zellulose</td><td>Büchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bodenfilter für E-916 / 914, Glasfaser</td><td>Büchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><stark> Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quarzsand, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Büchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (Kieselgur)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1,09385,5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-Dimethoxy-4'-acetophenon (Acetosyringon)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedizinisch</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE Gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2</td><td>O Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 hydroxid (basisches Ionenaustauscherharz)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasser</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Kompost</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>beliebig</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid-Reinigungskit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Kompetenter E. coli</td><td>Lieferant New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 Vektor</td><td>Lomonossoff Labor John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (ortsspezifisches Rekombinationsklonierungsprotokoll)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (ortsspezifisches Rekombinationsklonierungsprotokoll)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Erststrang-Synthesesystem</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana Benthamiana Seeds</td><td>Jeder seriöse Lieferant</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

transiente expression in nicotiana benthamiana blätter für triterpene produktion im präparativen maßstab

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Viele Triterpene Derivate haben gezeigt, dass medizinisch relevanten biologischen Aktivität besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows. Trotz ihrer immensen Vielfalt TRITERPENE alle stammen aus einer einzigen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene. Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken, die natürlich nicht von diesem Host hergestellt werden. Agro-Infiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana. Der Prozess umfasst Infiltration der Blätter der Pflanze mit einer Suspension von Agrobacterium Tumefaciens tragen den Ausdruck Construct(s) von Interesse. Co Infiltration von einer zusätzlichen A. Tumefaciens Belastung tragen, ergibt sich ein Ausdruck Konstrukt Codierung, die ein Enzym, das Vorläufer Versorgung deutlich steigert erhöht. Nach einer Frist von fünf Tagen kann zu extrahieren und zu isolieren, die sich daraus ergebenden Triterpene Produkte die eingedrungene Blattmaterial geerntet und verarbeitet werden. Dies ist ein Prozess, der zuverlässig und Linear skalierbar ist einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment. Hierin ist ein Protokoll für schnelle präparative-Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform beschrieben. Das Protokoll nutzt eine Vorrichtung leicht replizierbar Vakuum Infiltration, ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu vier Anlagen, diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit ermöglicht.

Typische isoliert Erträge sind abhängig von der Enzym/Enzym-Kombination unter Untersuchung, die chemische Stabilität der Ziel-Verbindung und wie anspruchsvoll der Reinigungsprozess war. Wir haben bereits berichtet, isolierten Ausbeute an β-Amyrin Derivate aus unserer kombinatorische Biosynthese-Experimente von 0,12 bis hin zu 3,87 mg pro Gramm trocken N. Benthamiana Blattpulver. Diese Verbindungen reichten weit in die Ebene der Oxidation und unnatürliche Kombinationen von Enzymen (Abbildung 3)8enthalten. Dieses Protokoll ist in unserem Labor routinemäßig, um Dutzende oder Hunderte von Milligramm gereinigten Produktes für strukturelle Charakterisierung zu produzieren durch NMR-Spektroskopie und nachgelagerten funktionelle Assays. Wir haben auch den präparativen nutzen diese Plattform gezeigt, durch die Herstellung von 0,8 g Triterpene Gerüst β-Amyrin in einer Reinheit von mehr als 98 %. Dieses Experiment 459 Pflanzen verwendet, und stellt eine isolierte Rendite von 3,3 mg pro Gramm des trocken N. Benthamiana Blatt Pulver8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung. Schematische Darstellung des Prozesses nutzen transiente Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana Blatt, endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene in Richtung der präparativen Herstellung von hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Abbildung 2: Vakuum Infiltrator Konstruktion und Prozess. ein) Maßgeschneiderte Anlage Inhaber eines Flügels abgetrennt. b) Bespoke Pflanze Halter Flügel befestigt. ( c) Inversion und Eintauchen der Pflanzen. d) Einfügung des Bades Infiltration. e) Infiltration Bad im Ort innerhalb der Kammer eindringen. f) Complete Vakuum Infiltrator: (1) Vakuumpumpe (2) Verbindung von Vakuumpumpe Vakuum-Speicher (3) Vakuum-Behälter-Absperrventil (4) Verbindung zwischen Vakuum-Speicher und die Infiltration Kammer (5) Manometer (6) Luft Einlassventil (7) Infiltration (8) Kammer Vakuum Reservoir. g) Vertreter verlässt nach fünf Tagen Post-Infiltration Wachstum von einer Pflanze mit einem Ausdruck Konstrukt für grün fluoreszierendes Protein (GFP) infiltriert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Abbildung 3: bereits berichtet repräsentative Ergebnisse für die präparative Herstellung von β-Amyrin-Derivaten, die mit diesem Protokoll8. Diese Tabelle ist durch isolierte Erträge bestellt. Spalten werden mit Ampelfarben relativen Wert bedingt formatiert. Rot = hoch, grün = niedrig (obwohl mittlere gelb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in Nicotiana Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Hierin ist ein detailliertes Protokoll für Rapid (5 Tage) präparative angelegte Produktion von TRITERPENE und Analoga, die unter Verwendung dieser leistungsstarken pflanzlichen Plattform beschrieben.

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Dieses Protokoll ermöglicht einen bequemen präparativen Zugang zu Triterpenverbindungen für die Verwendung in nachgelagerten Studien, wie z. B. der strukturellen Charakterisierung oder dem Ablauf medizinisch relevanter biologischer Aktivität. Das Protokoll ist schnell, skalierbar und ermöglicht die Verwendung von Kombinationen von Enzymen einfach durch die Co-Infiltration verschiedener Stämme von Agrobacterium, wodurch die Notwendigkeit entfällt, große Multi-Gen-Vektoren zu konstruieren. Beimpfen Sie zunächst eine selektive LB-Agarplatte mit Streifen der gewünschten Agrobacterium tumefaciens-Stämme aus Glycerin-Stammkulturen.Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem stehenden Inkubator. Am nächsten Tag beimpfen Sie einzeln 50 Milliliter selektives LB-Medium mit einer Probe jedes Agrobacterium tumefaciens-Stammes. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min.Die 50-Milliliter-Kulturen werden einzeln auf 1.000 Milliliter selektives LB-Medium umgefüllt und über Nacht bei 28 Grad Celsius im Schüttelinkubator bei 200 U/min inkubiert. Am nächsten Tag pelletieren Sie das Agrobacterium tumefaciens einzeln aus den Flüssigkulturen durch Zentrifugation bei 4.000 mal g. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Pellets einzeln in 50 Millilitern frisch zubereitetem MMA-Puffer.Inkubieren Sie die resuspendierten Pellets bei Raumtemperatur im Dunkeln für eine Stunde. Bestimmen Sie nun das geeignete Volumen jeder Agrobacterium tumefaciens MMA-Suspension, um eine endgültige OD 600 von mindestens 0,2 in einem Gesamtendvolumen von 10 Litern herzustellen. Kombinieren Sie die ermittelten Volumina der einzelnen Suspensionen.Geben Sie nun zusätzlichen MMA-Puffer zu den kombinierten Suspensionen bis zu einem Endvolumen von einem Liter, um sofort für die Vakuuminfiltration verwendet zu werden. Übertragen Sie den einen Liter Versickerungssuspension und den einen Liter MMA-Puffer mit 10-facher Stärke in das Versickerungsbad, gefolgt von weiteren acht Litern Wasser. Entfernen Sie die abnehmbaren Flügel des maßgeschneiderten Pflanzenhalters.Setzen Sie vier fünf Wochen alte Pflanzen ein, die wie im Textprotokoll beschrieben gezüchtet wurden, und befestigen Sie die Flügel wieder. Die Versickerungsabdeckung wird beeinträchtigt, wenn die Blätter nicht vollständig in die Versickerungssuspension eingetaucht sind. Dieses Problem wird minimiert, indem sichergestellt wird, dass die Höhe der Suspension vor der Vakuumbehandlung die Oberseite des Pflanzenhalters erreicht.Drehen Sie den Halter um und stellen Sie ihn auf das Versickerungsbad, um die Blätter in die Versickerungssuspension zu tauchen. Bringen Sie das Versickerungsbad mit den untergetauchten Pflanzen in die Versickerungskammer und schließen Sie die Tür. Stellen Sie sicher, dass das Lufteinlassventil am Infiltrator geschlossen ist.Öffnen Sie nach dem Einschalten der Vakuumpumpe das Vakuumeinlassventil an der Infiltrationskammer. Sobald der Druck in der Infiltrationskammer um 880 Millibar gesunken ist, schließen Sie das Vakuumeinlassventil und öffnen Sie das Lufteinlassventil. Wenn Sie wieder auf Atmosphärendruck zurückgekehrt sind, öffnen Sie die Tür und entfernen Sie das Versickerungsbad.Heben Sie nun den Pflanzenhalter an, bis die Pflanzen nicht mehr in der Versickerungssuspension eingetaucht sind. Schütteln Sie dann vorsichtig den Halter, damit überschüssige Suspension von den Blättern zurück in das Versickerungsbad ablaufen kann. Zum Schluss bringst Du den Halter wieder in die aufrechte Position, entfernst die abnehmbaren Flügel und entfernst die Pflanzen.Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius in 16 Stunden pro Tag Licht mit täglicher Bewässerung. Nach fünf Tagen Wachstum ernten Sie die Blätter und trocknen sie dann, wie im Textprotokoll beschrieben. Mahlen Sie die getrockneten Blätter auf bequeme Weise zu einem groben Pulver, z. B. mit einer Haushaltsküchenmaschine oder indem Sie die Blätter manuell zerkleinern, während sie sich in einem Beutel befinden.Mischen Sie das Blattpulver mit Quarzsand in einem geeigneten Behälter. Dies wirkt als Dispergiermittel und verbessert die Effizienz des Extraktionsprozesses. Bereiten Sie nun vier Extraktionszellen für die Befüllung vor, indem Sie sie zunächst umdrehen.Setzen Sie dann den Glasfaserfilter ein, gefolgt von der Metallfritte und dem Haltestopfen. Stellen Sie die Extraktionszellen wieder in die aufrechte Position und fügen Sie eine einen Zentimeter tiefe Schicht Quarzsand hinzu. Befüllen Sie die Extraktionszellen mit dem vorbereiteten Blattpulver bis zur Fülllinie.Falls erforderlich, komprimieren Sie das Pulver während dieses Prozesses vorsichtig, um die Zugabe einer größeren Menge in jede Extraktionszelle zu erleichtern. Geben Sie nun eine kleine Schicht Quarzsand auf die Oberseite des verpackten Pulvers und setzen Sie den oberen Zellulosefilter ein. Setzen Sie die verpackten Extraktionszellen in das unter Druck stehende Lösungsmittelextraktionsgerät ein und führen Sie die gewünschte Methode aus.Sobald die Methode abgeschlossen ist, wird die kombinierte Extraktionslauge durch Rotationsverdampfung unter Vakuum auf Trockenheit konzentriert, wie im Textprotokoll beschrieben. Prüfen Sie, ob die erwartete Leistung einer dunkelgrünen Aufschlämmung zu erwarten ist. Um die Chlorophylle zu entfernen, lösen Sie zunächst den Rohextrakt mit basischem Ionenaustauscherharz in einem minimalen Volumen Ethanol auf.Fügen Sie der resultierenden Lösung 50 Milliliter basische Ionenaustauscherharzkügelchen hinzu. Dann 30 Minuten bei Raumtemperatur rühren. Fügen Sie alle 30 Minuten weitere 50 Milliliter basische Ionenaustauscherharzkügelchen hinzu, bis die Reaktion abgeschlossen ist.Zuerst sind die basischen Ionenaustauscherharzkügelchen rosa und die flüssige Phase grün. Im Verlauf der Reaktion färben sich die Harzperlen je nach Skala grün und die flüssige Phase orange oder trübbraun. Filtrieren Sie das Reaktionsgemisch durch eine kurze Säule aus Kieselgur über eine Glas-Flash-Chromatographie-Säule und üben Sie mit einem Handbalg Druck aus.Spülen Sie die gesammelten Harzkügelchen mit Ethanol, gefolgt von Eins-zu-Eins-Ethanol zu Hexan und schließlich mit Hexan. Verwende ein Spülvolumen, das ausreicht, um die Kügelchen auf der Kieselgursäule wieder zu suspendieren. Zum Schluss werden das Filtrat, die Spülungen und das Konzentrat durch Rotationsverdampfung unter Vakuum bis zur Trockenheit kombiniert.Hier ist ein Bild der Blätter einer Pflanze zu sehen, die fünf Tage nach dem Wachstum nach der Infiltration mit einem Expressionskonstrukt für das fluoreszierende Protein GFP infiltriert wurden. Dies verdeutlicht das Ausmaß der Infiltrationsabdeckung, die zu erwarten ist. Die Blätter sind von links oben nach rechts unten im Bild in absteigender Reihenfolge angeordnet, bezogen auf ihre ursprüngliche Höhe auf der Pflanze.Dieses Bild zeigt 0,8 Gramm Beta-Amyrin, das mit diesem Protokoll hergestellt wird, was einem Reinheitsgrad von mehr als 98 % entspricht. Das Experiment wurde im Maßstab von 459 Pflanzen durchgeführt und entspricht einem isolierten Ertrag von 3,3 Milligramm pro Gramm trockenem Blattmaterial. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass nur infiltrierte Blätter Ihre interessante Verbindung produzieren.Es ist daher von Vorteil, diese Blätter nach Möglichkeit selektiv zu ernten, um eine Verdünnung Ihrer Probe mit unproduktivem Gewebe zu verhindern. Die Schritte nach der Ernte in diesem Protokoll dienen zur Veranschaulichung. Sie können durch andere Reinigungstechniken zur Extraktion von Naturstoffen ersetzt werden, abhängig von der Verfügbarkeit von Fachwissen und/oder Einrichtungen in Ihrer Einrichtung.Wir fanden heraus, dass die grundlegende Ionenaustauscherharzbehandlung, die in diesem Protokoll vorgestellt wird, eine bequeme Alternative zur traditionelleren Verseifung ist, gefolgt von einer Flüssig-Flüssig-Teilung zur Entfernung von Chlorophyllen in größeren Maßstäben. Bevor Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Sie sich mit den Sicherheitsdaten aller verwendeten Stoffe vertraut machen und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen treffen. Die örtliche Gesetzgebung für die Arbeit mit transgenem Material sollte überprüft und eingehalten werden, einschließlich der Befolgung geeigneter Einschließungsverfahren.

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Research

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Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

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