Optimierung und Nutzung von Agrobacterium Transient-vermittelte Proteinproduktion in Nicotiana

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, effiziente und skalierbare Methode für die transiente rekombinante Proteinproduktion in einem pflanzlichen System unter Verwendung der Agro-Infiltrationstechnik zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wachstumsbedingungen der Pflanzen optimiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Agrobacterium mit Startvektoren zu transformieren, die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmiden kombinieren, gefolgt von der Kultivierung des transformierten Agrobacteriums für die Verwendung in den Agroexperimenten.

Bei der Infiltration von Agrobacterium werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und oberirdische Teile in eine Agrobacterium-Suspension getaucht. Dann wird ein Vakuum angelegt, das bewirkt, dass Luft aus den Interzellularräumen im Blattgewebe evakuiert wird. Durch St führt die schnelle Druckrückbeaufschlagung nach dem Ablassen des Vakuums zur Infusion der Agrobacterium-Suspension in die Blätter.

Letztendlich werden Immunblotting und Fluoreszenzassays verwendet, um die rekombinante Proteinproduktion in den infiltrierten Pflanzen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Infiltration besteht darin, dass die Vakuuminfiltrationsmethode für die industrielle Produktion von rekombinanten Proteinen, einschließlich Impfstoffen und therapeutischen Proteinen, skaliert werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Pflanzenbiotechnologie zu beantworten und die Nutzung von Pflanzen als alternative Plattform für die kommerzielle rekombinante Proteinproduktion weiter zu erleichtern.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir herausfanden, dass die Skalierung der Agrofiltration in Bodenpflanzen eine Herausforderung darstellt. Aus mehreren Gründen enthält der Boden Uchine wie Viren, Bakterien, Nematoden, und darüber hinaus variieren der Bodengehalt und das Bewässerungswasser von Charge zu Charge und von Saison zu Saison, und die Eier des Bodens werden im Laufe der Zeit gelagert. Darüber hinaus würde das Umdrehen von Pflanzen, die in Erde wachsen, dazu führen, dass während der Infiltration unerwünschter Boden in die Agrobakterienkultur tropft.

Dieses Verfahren wird von Rebecca Snow, einer leitenden wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus der Pflanzenbiologie und dem Ingenieurlabor, und Emma Gut Robin Lobe demonstriert. Sie, sie und Adam Trevor, die Forschungsassistenten aus meinem Labor sind. In dieser Studie werden hydroponisches Pflanzenwachstumsmedium und Nährlösung verwendet, um eine Gleichmäßigkeit des Pflanzenwachstums zu gewährleisten und die Komplexität zu beseitigen, die mit der Verwendung von Erde für den Pflanzenanbau verbunden ist.

Um diesen Vorgang zu starten, weichen Sie Steinwolleplatten fünf Minuten lang in einer Pflanzendüngerlösung ein und säen Sie die Samen manuell auf die nährstoffgetränkte Steinwolleoberfläche. Unter Verwendung der Zeder werden in dieser Studie drei Nico Oceana-Arten untersucht, zwei Wildtyp-Arten, Nico Oceana, Benham Ana und Nico Oceana Excelsior, und eine Hybride aus Benham, Ana und Excelsior namens Nico Oceana. Excela züchtet Pflanzen aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen und einer langen Fotoperiode in einem hydroponischen Kaskadensystem.

Nico Oceana, Bentham Miana und Nico Oceana Excela für vier bis fünf Wochen und Nico Oceana Excelsior für fünf bis sechs Wochen. Die in diesem Experiment verwendeten Agrobacterium-Tumorfasion-Stämme wurden mit den entsprechenden Startvektoren transformiert, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Für die Zwecke dieser Demonstration werden fünf transformierte Agrobacterium-Stämme verwendet.

GV 3 1 0 1, das ein grün fluoreszierendes Reporterprotein oder GFP-Gen GV 3 1 0 1 trägt, das das virale Gen des Silencing-Suppressors des Tomatenbusch-Stuntvirus P 19 und A vier GV 3 1 0 1 und ein T 10 trägt. Mit dem Gen eines Trägerproteins modifizierte Liase oder Leck KM wachsen Agrobacterium-Stämme über Nacht in LB-Medium, ergänzt mit 50 Milligramm pro Liter Dose Mycin bei 28 Grad Celsius und Schütteln bei 200 bis 250 U/min am nächsten Tag. Bereiten Sie Agrobacterium-Suspensionen für die gewünschten Experimente vor, um die Machbarkeit der Verwendung mehrerer Agrobacterium-Stämme für die transiente Proteinproduktion zu untersuchen, verdünnen Sie einen Laborstamm und zwei Wildtyp-Stämme, wobei der PBI-Vektor mit vier Lecken in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5

Um die Notwendigkeit der Induktion von Agrobacterium-Virulenz-Genen vor der Infiltration zu untersuchen, zentrifugieren Sie zunächst Agrobacterium-Kulturen, die den P bid 4G FP-Vektor tragen, der in LB-Medium bei 4.000-fachem G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius gezüchtet wurde. Dann in MMA-Induktionsmedium auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,5 resuspendieren und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur rühren, um zu testen, ob der Acetylkegel die transiente Proteinproduktion verbessert, Zentrifuge und Agrobacterium-Kultur. Mit dem PBI 4G FP-Vektor, der über Nacht in LB-Medium gezüchtet und in Infiltrationspuffer resuspendiert wird, der ein X ms Salz, 10 Millimolar, MES und 2% Glukose enthält.

Teilen Sie die Zellsuspension in vier Behälter auf. Geben Sie eine unterschiedliche Konzentration von Acetokegel zu jeder der Agrobacterium-Suspensionen und inkubieren Sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur. Es sollte die Wirkung der Co-Infiltration eines viralen Silencing-Suppressors auf den transienten GFP-Proteinproduktionsmix getestet werden.

Eine Milli Q wasserverdünnte Agrobacterium-Kultur, die das GFP-Gen trägt, und eine Kultur, die den viralen Silencing-Suppressor P 19 in einem Verhältnis von vier zu eins trägt, während der Vakuuminfiltration von Pflanzen, was demonstriert wird. Als nächstes ist es entscheidend, den Vakuumdruck und die Dauer der Infiltration zu kontrollieren, um Anlagen im Vakuum zu infiltrieren. Übertragen Sie zunächst die vorbereitete Agrobacterium-Suspension in einen Behälter in der Vakuumkammer.

Drehen Sie dann die Pflanze in dem verdünnten Agrobakterium auf den Kopf und wenden Sie ein Vakuum von 50 bis 400 Millibar für 30 oder 60 Sekunden an. Die optimale Infiltration wird routinemäßig bei 50 bis 100 Millibar für 60 Sekunden appliziert. Sobald das Vakuum unterbrochen ist, nehmen Sie die Pflanzen aus der Vakuumkammer, spülen Sie sie mit Wasser ab und züchten Sie sie fünf bis sieben Tage lang unter den gleichen Wachstumsbedingungen, die für das Wachstum vor der Filtration verwendet werden.

Um Proben für die westliche Analyse vorzubereiten, sammeln Sie zunächst zufällige Blattproben aus Nico Oceana-, Benham Miana-, Nico Oceana Excelsior- oder Nico Oceana Excela-Pflanzen vier bis sieben Tage nach der Infiltration oder pulverisieren Sie die Blattproben in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. Geben Sie drei Volumina eines XPBS-Puffers mit 0,5 % Triton X 100 zu jeder Probe und überführen Sie die Probe in ein Einor-Röhrchen. Schütteln oder drehen Sie die extrahierten Proben vorsichtig für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Schleudern Sie den Extrakt fünf Minuten lang und sammeln Sie das gesamte lösliche Protein in einem sauberen Einor-Röhrchen. Verdünnen Sie die Extrakte auf eine geeignete Verdünnung in einem XPBS-Extraktionspuffer und fügen Sie fünf x Probenpuffer zu einer endgültigen Konzentration von einem X hinzu. Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang, bevor Sie die Proteine anhand der SDS-Seite trennen.

Nachdem Proteine auf eine unbewegliche P-Transfermembran übertragen wurden, und GFP unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Anti-GFP-Antiserum in einer Verdünnung von eins bis 5.000 in Blocklösung nachweisen. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren, nachdem die Membranen dreimal mit einem X-P-B-S-T 20 gewaschen wurden. Inkubieren Sie mit dem Meerrettichperoxidase-konjugierten anti-tollwütigen Antikörper und fügen Sie eine Stunde lang eine Verdünnung von eins bis 5.000 hinzu, um den GFP-Nachweis zu erzielen.

Anschließend werden die Western Blots prozessiert und die den Proteinen entsprechenden Bandenintensitäten analysiert, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Die visuelle Detektion der GFP-Fluoreszenz in ganzen transient transformierten Pflanzen erfolgt mit einer tragbaren langwelligen UV-Lampe, einer Digitalkamera und einer Belichtungszeit von 15 Sekunden, um transient transformierte Pflanzen durch einen gelben Achter ES 52-Filter zu fotografieren. Erhalten Sie Bilder aus Western-Blot-Analysen mit der Gen-Snapped-Software auf einem Genom.

Quantifizieren Sie die Ergebnisse mit der Gen-Tool-Software mit einer Kalibrierungskurve, die auf einem gereinigten GFP-Standard basiert. Nick Oceana Bentham Miana wurde auf Rockwell-Platten angebaut, die in kommerziell erhältlichen Düngemitteln getränkt waren, um die optimalen Bedingungen für das Pflanzenwachstum und die Biomasseakkumulation zu bestimmen. Das Vorhandensein von Phosphor ist entscheidend für die Keimung und das Wachstum von NICO Oceana. Bentham-Samen, wie diese sechs Wochen alten Pflanzen zeigen, die entweder in einer Düngerlösung mit 4,8 % Phosphor oder einer Düngerlösung mit 0 % Phosphor wachsen.

Die Auswirkungen des Wachstums von Agrobakterien und Infiltrationsmedien auf die Pflanzengesundheit und die Proteinproduktion wurden durch einen Vergleich der GFP-Produktion in Nicotiana untersucht. Hamana-Pflanzen, die mit PBI 4G FP vakuuminfiltriert sind und Agrobakterienkulturen beherbergen, die in drei verschiedenen Medien gezüchtet werden. YEB-, AB- und LB-Kulturen, die über Nacht in YEB- oder LB-Medien gezüchtet wurden, wurden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und in MMA-Induktionsmedium resuspendiert oder über Nacht in YEB LB- oder AB-Medien gezüchtet und direkt ein bis fünf oder ein bis 10 mit Milli Q Wasser verdünnt, wie in diesem Western-Blot-Ergebnis dargestellt, Pflanzen, die mit Agrobacterium-Kulturen infiltriert wurden, die in YEB LB- oder AB-Medien gezüchtet und mit Milli Q Wasser verdünnt wurden, zeigten keinen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen GFP-Produktion aus Kulturen, die zentrifugiert und in MMA resuspendiert wurden.

Daher wird milli Q Wasser zum Verdünnen von Agrobacterium-Kulturen für die Pflanzeninfiltration empfohlen und wurde in nachfolgenden Experimenten routinemäßig verwendet, um eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 zu erreichen. Als nächstes wurden die Auswirkungen der Suspensionsdichte und des Zeitverlaufs der Agrobacterium-Zellen auf die Zielexpression untersucht. Vier verschiedene Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium, die PBI 4G FP tragen, wurden bewertet und Blattproben wurden vier, sieben und 10 Tage nach der Infiltration oder DPI für die Western-Blot-Analyse bei vier DPI entnommen, es gab bemerkenswerte Unterschiede in der GFP-Fluoreszenz bei Pflanzen, die mit unterschiedlichen Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium infiltriert wurden, keine GFP-Expression wurde bei einer 600 von 0,05 bei sieben D-P-I-G-F-P beobachtet.

Die Fluoreszenz war bei Pflanzen, die bei Zellsuspension infiltriert wurden, ähnlich. Dichten von a 601,0 0,5 und 0,1, aber niedrigere Implantate infiltrierten bei einem A 600 von 0,05 im Gegensatz zu 10 DPI. Es wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion zwischen Pflanzen beobachtet, die mit einer der vier Zellsuspensionsdichten infiltriert wurden, um die Vielfalt der für die transiente Proteinproduktion verfügbaren Agrobacterium-Stämme zu erhöhen.

Nicotiana Benham miana Pflanzen wurden vakuuminfiltriert mit sieben verschiedenen Stämmen von Agrobakterien, die den Vektor KBI vier Leckkilometer weit beherbergen. Die infiltrierten Blätter wurden bei sieben DPI gesammelt und das Niveau der Kinaseexpression mittels Western Blot geschätzt. Wie aus dieser Grafik hervorgeht, wurde das höchste Niveau der Liaseproduktion mit den Stämmen GV 3 1 10, 1 A four und LBA 4 4 0 4 mit geringfügigen Unterschieden erreicht.

Während das niedrigste Expressionsniveau bei C, fünf, acht, C eins lag, wurde mit den Stämmen T 77, A, T Null, Sechs und T 10 die Lyase-Enzymaktivität unter Verwendung eines XMO-Graham-Assays nachgewiesen. Das gereinigte bakterielle Lyaseprotein wurde als Positivkontrolle für die Enzymaktivität verwendet. Es ist interessant festzustellen, dass nicotiana Benham miana Pflanzen, die mit den Stämmen A vier und T sieben sieben Wildtyp Agrobacterium infiltriert wurden, pathologische Symptome wie Wachstumsverzögerung, Dehnung des Haustieres und Kräuseln sowie Blattkräuseln bei sieben DPI zeigten.

Die Symptome waren bei Nicotiana-Benham-Pflanzen, die mit dem Wildtyp des Stammes T 10 infiltriert waren, mild. Bei Nico Oceana Benham-Pflanzen, die mit dem Laborstamm GV 3 1 0 1 infiltriert wurden, wurden keine Symptome beobachtet. Ein Vergleich der pflanzlichen Biomasseproduktion bei den Wildtyp-Arten ergab, dass unter gleichen Wachstumsbedingungen die höchste Blattbiomasse, die aus Nico Oceana Excela erzeugt werden kann, etwa doppelt so hoch ist wie aus Nico Oceana.

Die Benham-Proteinproduktion wurde in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior und Nico Oceana Excela untersucht, die mit dem Agrobacterium-Stamm infiltriert waren. GV 3 1 0 1 mit PBI 4G F-P-G-F-P-Akkumulation wurde bei sieben DPI in ganzen infiltrierten Blättern bewertet. Die visuelle Untersuchung der GFP-Expression unter UV-Licht zeigte eine gleichmäßige Verteilung von GFP in Nico Oceana Hamana und Nico Oceana Excela und eine ungleichmäßige Verteilung in Nico Oceana Excelsior, da es schwierig war, einen ganzen Blattbereich von Nico Oceana Excelsior zu infiltrieren. Die Western-Blot-Analyse der GFP-Akkumulation in diesen infiltrierten Blättern bei sieben DPI zeigte, dass der GFP-Gehalt bei Nico Oceana Hamana höher war als bei Nico Oceana Excela und Nico Oceana Excelsior die geringe Proteinproduktion in Nico Oceana.

Excelsior ist auf eine ungleichmäßige Infiltration und ungleichmäßige Verteilung des akkumulierten GFP im gesammelten Blatt zurückzuführen. Um die Wirkung des Vakuumdrucks auf die Blätter zu testen, wurden Nico Oceana Benham-Pflanzen mit dem Agrobacterium-Stamm GV 3 1 0 1 infiltriert, der PBI 4G FP unter einem Vakuumdruck von 400, 200, 100 oder 50 Millibar bei einer Vakuumhaltezeit von 30 oder 60 Sekunden enthält. Es wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion und geringe bis keine nachteiligen Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit beobachtet, wenn Vakuumdrücke von 5, 100 und 200 Millibar für 30 oder 60 Sekunden angelegt wurden.

Der Einfluss der Dauer des Vakuums auf die Zielexpression wurde untersucht, indem stündlich eine Wohnung von Nico Oceana Benham-Pflanzen mit einem A 600 von 0,5 GV 3 1 0 1 infiltriert wurde, das PBI 4G FP für acht Stunden beherbergte. In der gleichen Agrobacterium-Kultur, wie sie in diesem repräsentativen Ergebnis gezeigt wird, war das Niveau der GFP-Produktion zu jeder Zeit ähnlich, d. h. bis zu acht Stunden, was darauf hindeutet, dass das Agrobacterium über diesen Zeitraum seine Fähigkeit beibehält, eine einzelsträngige DNA freizusetzen. Da berichtet wurde, dass viele Chemikalien und Monosaccharide die vorübergehende Proteinproduktion in verschiedenen Pflanzenarten verbessern.

In dieser Studie wurde auch die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Aceto, Crinon und Glukose untersucht. Bei der transienten GFP-Proteinproduktion in Nico Oceana Benham infiltrierte Ana mit dem Agrobakterienstamm GV 3 1 0 1 mit PBI 4G FP. Das Agrobakterium wurde über Nacht in YEB-Medien gezüchtet, zentrifugiert und auf einen a 600 von 0,5 resuspendiert, entweder in MMA mit 2 % Glukose mit Acetylseron in den angegebenen Konzentrationen oder in MMA mit 200 mikromolar Acetophenon mit Glukose in den angegebenen Konzentrationen. Wie hier gezeigt, induzierte keine der getesteten Konzentrationen dieser Verbindungen einen signifikanten Anstieg der GFP-Proteinproduktion im Vergleich zur Kontrolle, bei der Induktionsmedien kein Acetophenon oder Glukose enthielten.

Als nächstes die Wirkung der Co-Infiltration eines Silencing-Suppressors auf die transiente Expression von GFP- und HAC-1-Genen in Nico Oceana. Benham-Blätter wurden vor der Infiltration von Agrobacterium GV drei eins zehn eins Kulturen, die PBI 4G FP und den viralen Silencing-Suppressor P 19 des Tomatenbusch-Stuntvirus enthielten, jeweils in einem Verhältnis von eins zu eins, zwei zu eins, drei zu eins und vier zu eins gemischt. Wie aus den Ergebnissen der Western-Blot-Analyse bei sieben DPI hervorgeht, führte das Vorhandensein von P 19 zu keiner Erhöhung oder Verringerung der GFP-Produktion in Nicotiana Benham Miana in einem Verhältnis von zwei der Agrobacterium-Suspensionen.

Darüber hinaus wurde die Wirkung von zwei viralen Gen-Silencing-Suppressoren P 23 und P 19 auf die Prävention von posttranskriptionellem Gen-Silencing für HAC one untersucht. POS von Agrobacterium, das den Startvektor PBI trägt, vier HAC, eines und eines der beiden viralen Silencing-Suppressor-Plasmide wurden in einem Verhältnis von vier zu eins gemischt und co-infiltriert in Nicotiana Bentham Miana. Die infiltrierten Blattproben wurden mit drei bis acht DPI entnommen.

Dieses Diagramm zeigt die durchschnittlichen Konzentrationen von HAC one Expression aus drei Experimenten, die durch Western-Blot-Analyse bestimmt wurden. Die Co-Infiltration von Nico Oceana Benham mit P 23 oder P 19 führte zu einer Steigerung der HAC 1-Produktion im Vergleich zur Verwendung eines Schalldämpfers ohne Schalldämpfer bei 60 pi. Dies deutet darauf hin, dass P 23 und P 19 in diesem System effizient sind.

Es wurde auch beobachtet, dass sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Silencing-Suppressors das Niveau der HAC-1-Proteinproduktion bei sieben DPI abnahm. Dies deutet darauf hin, dass der Zeitpunkt des Rückgangs der transienten Proteinproduktion in Nico Oceana Benham Miana, das mit dem Startvektor infiltriert wurde, zielspezifisch ist. Schließlich wird die Stabilität der Agrobacterium-Zellbank jedes Jahr bewertet, indem Nicotiana benham-Pflanzen mit der gleichen Charge der Agrobacterium-Zellbank infiltriert werden, um die Proteinakkumulation zu bewerten.

Diese repräsentativen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Produktion von HA-Eins-Protein seit mehr als drei Jahren sehr stabil ist. Die durchschnittliche HAC-1-Produktion in Nicotiana-Benam-Anlagen beträgt 651 plus oder minus 49,4 Milligramm pro Kilogramm. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Agro-Infiltrationstechnik für die Produktion von rekombinanten Proteinen in großem Maßstab anwenden können, die für die Herstellung von Untereinheitenimpfstoffen, Theo-Protein-Antikörpern und diagnostischen Antigenen verwendet werden können.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Pflanze crosshydroponisch zu kontrollieren, lebensfähige Agrobakterien zu verwenden, den Vakuumdruck und die Vakuumation zu kontrollieren und das Vehikel der Proteinexpression zu überwachen. Sobald die Agrofiltrationstechnik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie unter kontrollierten Bedingungen ordnungsgemäß durchgeführt wird.