Name: Optimierung und Nutzung von Agrobacterium Transient-vermittelte Proteinproduktion in Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Vakuum-Infiltrationsmethode zur transienten Proteinproduktion in Nicotiana-Pflanzen mit Agrobacterium. Diese optimierte Technik ermöglicht die skalierbare Herstellung von Impfstoffantigenen und therapeutischen Proteinen.

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Diese Arbeit wurde von Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. und der Defense Advanced Research Projects Agency (Zuschuss # HDTRA1-07-C-0054) unterstützt. Die Autoren erkennen die großzügige Geschenke von Drs.. Stanton Gelvin von Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens-Stämme) und Wayne Fitzmaurice von Large Scale Biology Corporation (N. excelsiana Samen) sowie Jennifer Nicholson US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior Samen ). Die Autoren danken Margaret Shillingford und Christopher Hull zur Versorgung von Pflanzen und ausgezeichnete technische Hilfe. Die Autoren bedanken sich auch DRS. Stephen Streatfield und Natasha Kushnir für die redaktionelle Unterstützung.

1. Plant Growing Für die Folgeagroinfiltration werteten wir zwei Wildtyp Nicotiana-Arten (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid (N. excelsiana) hydroponically auf Steinwolle in Indoor-Anlagen gewachsen. <ol><li> Genießen Steinwolle-Platten in einer Anlage Düngerlösung. </li><li> Aussaat der Samen von Wildtyp N. benthamiana, N. Holzwolle und N. excelsiana (Hybrid von N. benthamiana × N. excelsior) auf die Nährstoffe getränkten Steinwolle Oberfläche. </li><li> Wachsen Pflanzen aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen (24 ° C und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit) und eine langfris Tag Photoperiode (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit, mit Beleuchtung von 130-150 uE m -2 s -1) für 4-5 Wochen für N. benthamiana und N. excelsiana und 5-6 Wochen für N. Excelsior. </li></ol> 2. Konstruktion von Vektoren für AgroinfiltratIon <ol><li> Setzen Sie einen synthetischen Reporter-Gen (green fluorescent protein [GFP]), in voller Länge Hämagglutinin (HA) aus dem A/California/04/2009 Stamm von Influenza-Virus (HAC1) und re-engineered Lichenase Enzym (LicKM) 18 getrennt in die Einführung Vektor pBID4 18 (TMV-basierten Vektor) zu pBID4-GFP, pBID4-HAC1 und pBID4-LicKM bzw. 18,32,41,47 erhalten. </li><li> Führen 10-50 ng pBID4 Durchführung GFP oder HAC1 in elektro Zellen von A. GV3101 und LicKM in elektro Zellen von A. tumefaciens-Stämme GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, AT77 und A4 mit dem Gen MicroPulser Elektroporator. </li><li> Verwenden Sie die transformierte Agrobakterien zur Infiltration Experimente sofern nicht anders angegeben. </li></ol> 3. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium in Nicotiana Pflanzen <ol><li> Wachsen A. tumefaciens-Stämme über Nacht (O / N) in LB-Medium, YEB med.ium-oder AB-Medium mit 50 mg / l Kanamycin bei 28 ° C mit 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute zittern. </li><li> Verdünnen Agrobakterien in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 nm (A 600) von 0,5 oder Zentrifuge Agrobacterium-Zellen in LB oder YEB oder AB bei 4.000 × gezüchtet g für 10 min bei 4 ° C, Resuspendieren in Induktionsmedium (1 x MS-Salz, 10 mM MES, 200 &amp;mgr; M Acetosyringon, 2% Saccharose [MMA]), um eine 600 von 0,5, gegeben und bei Raumtemperatur für 1-3 h, sofern nicht anders angegeben. </li><li> Infiltrieren Pflanzen in einer Vakuumkammer durch Eintauchen Pflanze Nicotiana Luft Gewebe in Agrobacterium-Suspension und Auftragen einer 50-400 mbar Vakuum für 30 oder 60 Sekunden. Die optimale Infiltration wird routinemäßig bei 50-100 mbar für 60 Sekunden aufgebracht. </li><li> Sobald das Vakuum gebrochen ist, entfernen Sie Pflanzen aus der Vakuumkammer, in Wasser abspülen, und wachsen für 5-7 Tage unter den für Pre-Infiltration Wachstum verwendet gleichen Wachstumsbedingungen. </li><li> Um die Wirksamkeit zu testenChemikalien induzieren Agrobacterium vir-Gen, verschiedene Konzentrationen von Acetosyringon (0, 100, 200 oder 400 &amp;mgr; M) zu der Agroinfiltration in Puffer (1x MS, 10 mM MES, 2% Glucose) zugegeben. Um den Effekt der Induktion von Monosaccharid zu vir-Gen verschiedenen Prozentsätzen von Glucose (0, 1, 2 oder 4%) wurden in Agrobakterien zugesetzt N. in der Infiltrationspuffer (1x MS, 10 mM MES, 200 &amp;mgr; M Acetosyringon) suspendiert. benthamiana Pflanzen wurden infiltriert, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4) erwähnt. </li><li> Agrobacterium-Stämme GV3101 Labor, C58C1 und LBA4404 und Wildtyp-Stämme A4, AT06, AT10 und AT77 beherbergen die pBID4 LicKM-Vektor wurden in Milli-Q-Wasser auf A 600 von 0,5. N. verdünnt benthamiana Pflanzen wurden mit jedem einzelnen Stamm, wie oben in den Schritten 3.3 und 3.4 genannten infiltriert. </li></ol> 4. Co-Agroinfiltration Verfahren für die Viral Silencing Suppressor <ol><li> Mix die Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen trägt das GFP-Gen und den viralen Silencing-Suppressor p19 Tomaten buschigen Stunt-Virus (TBSV) 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1-Verhältnisse. Infiltrieren N. benthamiana-Pflanzen, wie oben beschrieben. </li><li> Infiltrieren N. benthamiana Pflanzen mit einer Mischung von zwei Milli-Q-Wasser verdünnt Agrobacterium GV3101 Kulturen: Die erste Durchführung der pBID4 HAC1-Plasmid und die zweite Durchführung einer der Silencing-Unterdrücker - p19 oder p23 der TBSV von Citrus-Tristeza-Virus, in der pCassp Plasmid ( pCassp19) und PGR binäre Plasmid unter der 35S-Promotor (PGR-P23) verbunden sind, im Verhältnis 4:1 ist. </li></ol> 5. Western-Blot-Analyse <ol><li> Sammeln Zufallsblattproben von N. benthamiana, N. Holzwolle oder N. excelsiana Pflanzen bei 4-7 dpi pulverisieren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. </li><li> In drei Bänden 1x PBS-Puffer, 0,5% TritonX-100 zu jeder Probe. </li><li> Schütteln Sie die extrahierten Proben für 15 min bei 4 ° C </li><li> Drehen Sie das Extrakt für 5 min und sammeln gesamten löslichen Proteins in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Verdünnen Sie die Extrakte einer geeigneten Verdünnung (1:50 1:100) in 1x PBS Extraktionspuffer, und mit 5 × Probenpuffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% Bromphenolblau, 50% Glycerin v / v, und 500 mM DTT) bis zu einer endgültigen Konzentration 1 ×. </li><li> Kochen Sie die Proben für 5 min. </li><li> Separate Proteine ​​durch 10% SDS-PAGE, Transfer auf Immobilon-P Transfermembran und der Block mit 0,5% I-Block. </li><li> Erkennen GFP unter Verwendung von Kaninchen polyklonalen Anti-GFP-Antiserum bei 1:5.000 und HAC1 mit Maus-Anti-Poly-Histidin monoklonalen Antikörper bei 1:1000 in Blockierungslösung für 1 Stunde. </li><li> Nach der primären Antikörpermarkierung, waschen Sie die Membranen dreimal für 10 min mit jeweils 1 × PBST-20 und Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörper bei 1:5000 oder eine HRP-Konjugatd-Anti-Maus-Antikörper bei 1:10.000 1 h, für GFP und HAC1 Erfassungs sind. </li><li> Prozess Western-Blots mit dem Supersignal West-Pico Chemilumineszenz Substrat. </li><li> Verwenden Sie die Genetools Software der Bandenintensität des Proteins zu analysieren und zu erhalten, die Band kalibriert Menge. </li></ol> Proteinproduktion: (kalibrierte Menge x Verdünnung der Probe) / Probenmenge geladen) x 4 = mg / kg. Gleichung: Protein-Produktion (P), kalibrierte Menge (C), Verdünnung der Probe (D) und die Menge der Probe geladen (S). 6. Zymogramm Assay <ol><li> Sammeln pBID4-LicKM-infiltriert N. benthamiana Zufallsgewebeproben. </li><li> Extrahieren von Proteinen unter Verwendung der gleichen oben für Western Blot-Analyse beschriebenen Verfahren und dann durch 10% SDS-PAGE-Analyse mit 0,1% Lichenan in den Gelen enthalten. </li><li> Nach der Elektrophorese, waschen Sie die Gele zweimal für jeweils 10 Minuten in Waschpuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] und 0,1% Triton X-100) Und dann inkubiert in Waschpuffer bei 65 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation der Waschpuffer verworfen und färben die Gele mit 0,5% Kongorot für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dreimal Spülen der Gele in Milli-Q-Wasser für jeweils 10 min, und fügen Sie 1 M NaCl auf Lichenase Aktivität visualisieren. Die gereinigte bakterielle Lichenase Protein wurde als positive Kontrolle für die Enzymaktivität verwendet. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Führen visuellen Nachweis von GFP-Fluoreszenz ganz transient transformierten Pflanzen mit einer Handlangwelligen UV-Lampe. </li><li> Foto transient transformierten Pflanzen mit einer Digitalkamera über einen Yellow 8, ES 52 Filter (Belichtungszeit 15 s). </li><li> Erhalten Sie Bilder von Western-Blot-Analysen unter Verwendung der Software auf einem GeneSnap GeneGnome und zu quantifizieren, die Ergebnisse mit Hilfe der Genetools-Software, mit einer Eichkurve auf Basis gereinigt GFP-Standard. </li><li> Quantifizierung HAC1-Protein unter Verwendung einer Eichkurve basierend auf Abreinigunged HAC Proteinstandard aus der A/Indonesia/05/05 Stamm von Influenza-Virus. </li><li> Berechnen Mittelwerte 3-4 Wiederholungen für alle Experimente. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für Agroinfiltration Routine transiente Proteinproduktion in ausgewählten Nicotiana-Arten mit Hilfe von Agrobacterium-Stämme, die die Markteinführung Vektor entwickelt. Darüber hinaus haben wir die optimalen Bedingungen ermittelt, die höchste Produktion rekombinanter Proteine ​​Ebene in unserem vorübergehenden Pflanzenexpressionssystem zu erreichen. Vakuum-Infiltration der verdünnten A. tumefaciens Stamm GV3101 beherbergen die Startvektor pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana und N. excelsior in höheren Ebenen der Zielproteinproduktion innerhalb 7 dpi im Vergleich zu anderen Pflanzenarten, wie Pisum sativum mit GV3101 beherbergen, Alfalfa-Mosaik-Virus infiltriert - oder Cucumber-Mosaik-Virus-basierte Vektoren, die das GFP-Reporter-Gen unter der 35S-Promotors 41, oder Lactuca sativa, Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana mit dem C58C1 Stamm von A. infiltriert tumefaciens mit dem beta-Glucuronidase-Reportergens 57. N. benthamiana und N. excelsiana waren einfach zu infiltrieren Vakuum bei 50 mbar für 30-60 sec, mit 90-95% Infiltration Effizienz. Die verbleibenden 5-10% der Blattfläche nicht wegen irgend Floating der Blätter auf der Oberfläche des Agrobacterium-Suspension während des Aufbringens des Vakuums infiltriert. Seit der Einführung Vektor hat die Fähigkeit für Zell-zu-Zell-Bewegung 18, tritt transiente Proteinakkumulation in ganze Blätter sowie Blattstiele bei 7 dpi. Bei 10 dpi, war die geschätzte GFP Produktion etwas niedriger, weil die pBID4 Expressionsvektor ist in der Lage, von Zelle zu Zelle bewegen, aber nicht systemisch 18 zu bewegen; daher neu gewachsene Blätter enthalten den Vektor nicht und nicht um die Produktion von Ziel beitragen. Zusätzlich Abbau des rekombinanten Proteins mit der Zeit may reduziert Proteinebene beitragen bei 10 dpi. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Infiltration des A. tumefaciens Stamm GV3101 vermittelte hohe transiente Proteinproduktion in N. benthamiana. Ferner können Zielprotein als N-terminale, C-terminale oder interne Fusionen Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-Glucanase, welche ein thermostabiles Enzym aus Clostridium thermocellum ist und Thermostabilität verleiht vielen Ziel konstruiert werden, Protein-Fusion 18. Die Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens-Wildtyp-Stämme (AT6, AT10 und AT77) beherbergt das Gen von Interesse hervorgerufen milde oder schwere Symptome: Blatteisstockschießen, Blattstiel Dehnung und Eisstockschießen. Keine pathologischen Symptome wurden in N. beobachtet benthamiana infiltriert mit dem Laborstamm GV3101 beherbergen leer pBID4 Vektor, während einige Gene in pBID4 eingeführt und in Labor-Stämme GV3101, C58C1 oder LBA4404 ausgelöst milden nekrotischen Antworten und BlattChlorose / Vergilbung Symptome bei infiltriert Regionen der Blätter. Necrotic Symptome, die durch Wildtyp-Stämmen Agrobacterium oder unscharf in Nachtschattengewächse verursacht haben bisher 56,57 berichtet. Die nekrotische Reaktion konnte von Virulenzfaktoren des Sekretionssystem vom Typ III, bakteriellen Proteinen in die Pflanzenzelle durch die Typ IV-Sekretionssystem übertragen und / oder Empfindlichkeit für Flagellin 58-60 führen. Wir haben festgestellt, dass transiente Produktion von heterologen Proteine ​​können auch entlocken Pathogenität und eine hypersensible Reaktion in infiltriert Anlage verlässt. Viele Forscher berichtet, dass die Agroinfiltration von verschiedenen Pflanzenarten mit Pflanzen binären Vektoren bis zu 5-20 mal höhere transiente Proteinproduktion im Vergleich zu stabil transformierten Pflanzen 28,57 hergestellt. Unsere Daten zeigen, dass N. benthamiana infiltriert mit GV3101 beherbergen pBID4-GFP transient exprimierten hohe Niveaus von GFP, die ähnlich der GFP Ausbeute für gemeldeteN. benthamiana mit Agrobakterien Durchführung der Pich-GFPSYS viralen Vektor (bis zu 80% des gesamten löslichen Proteins) 44 infiltriert. Agroinfiltration mit unserem Start-Vektor führte zu hohen Produktion von thermostabilen Protein LicKM, 50-fach höher als die Verwendung eines binären Standard-Plasmid-18 beobachtet. Um die Infektiosität von A. Test tumefaciens und die Stabilität der Markteinführung Vektor, ein Flach von N. infiltriert wir benthamiana jede Stunde für bis zu 8 Stunden mit dem gleichen Milli-Q-Wasser verdünnten Kultur der GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unsere Daten zeigten, dass der Stamm GV3101 effizient für mindestens 8 h und pBID4 (die Einführung Vektor) infektiös ist während der 8 Stunden lang Infiltration sehr stabil. Glycerin Lager von GV3101 Stamm, der den Start-Vektor pBID4 HAC1 (Zellbank) bei -80 ° C gelagert wurde gezeigt, dass für drei Jahre als sehr stabil, ohne die Änderungen in transienten protein der Produktion in Pflanzen infiltriert. N. benthamiana Pflanzen unter optimalen Bedingungen und zwischen 35 und 42 Tage nach der Aussaat gewachsen waren optimal für Vakuuminfiltrations-vermittelte transiente Genexpression 40. Jungpflanzen (3-4 Wochen alt) nicht vollständig, weil der schwimmenden Blätter auf der Zellsuspensionsoberfläche und Gewebeschäden von der mechanischen Wirkung des Anlegens eines Vakuums infiltriert werden. In Anlagen, die älter als 45 Tage, N. benthamiana Verschrauben der Bühne, unter den verwendeten optimalen Lichtverhältnissen, ist das Niveau der transiente Expression gering. Niedermolekulare phenolische Verbindungen (Acetosyringon) und monosaccharaides (Glukose) sind dafür bekannt, vir-Gene in A. tumefaciens 55,61 induzieren. Außerdem Infiltration von N. benthamiana mit dem binären Vektor pCAMBIA (GFP) in Anwesenheit von Acetosyringon bei Konzentrationen von 50-600 &amp;mgr; M gezeigt, geringfügig vorübergehende ZunahmeGenexpression 40. Wir untersuchten die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon und Glucose in unserem System durch Zugabe dieser Verbindungen zu GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP in MMA für 3 h, und fand keinen Unterschied in der GFP-Expression. Interessanterweise GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP und in Milli-Q-Wasser auf eine A 600 von 0,5 verdünnt und infiltriert ohne die vir-Gen Induktion exprimiert die gleichen Mengen an GFP als diejenigen mit induzierten Kulturen infiltriert. Die A. tumefaciens vir-Gen (n) könnte möglicherweise durch Pflanzen phenolische Verbindungen (Acetosyringon und Sinapinsäure) und Pflanzen monosaccharaides (Glucose und Fructose) in Blattgewebe vorhanden induziert werden. Daher spekulieren wir, dass ähnliche Niveaus der GFP-Expression in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Induktoren vir-Gen kann ein Ergebnis der Wirkung der zytoplasmatischen vir-Gen Induktoren während der Replikation der GFP-exprimierenden Vektor Einführung in Pflanzenzellen vorliegen. N. benthamiana als Modell-Host für transiente Proteinproduktion 49 verwendet worden. Jedoch relativ niedrigen Biomasseertrag N. benthamiana &#39;s behindert seine Anwendung für die Großproduktion von rekombinanten Proteinen. Die optimale Host sollte eine hohe transiente Expression, einfach Wachstum im Gewächshaus zu kombinieren und anfällig sein Agrobacterium Infiltration 2. Um eine alternative Host auswählen, infiltriert wir zwei verschiedene Arten Wildtyp von Nicotiana (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) mit der A. GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unter diesen drei Arten, die Höhe der GFP-Expression in N. geringfügig höheren benthamiana. N. excelsior Pflanzen zeigten Schwierigkeiten im Vakuum Agroinfiltration aufgrund ihrer ledrigen Blättern, und N. excelsianaproduziert etwa zwei-mal Biomasse unter den gleichen Wachstumsbedingungen. Die transiente Produktion von GFP bei 7 dpi in N. relativ ähnlich ist benthamiana und N. excelsiana. Daher N. excelsiana kann ein geeigneter Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine ​​sein. Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion durch PTGS 26, die durch Co-Expression von Gen-Silencing-Suppressoren des Pflanzenvirus Ursprungs 62 überwunden werden kann, begrenzt. Transiente Proteinproduktion wurde zuvor gezeigt, um das 50-fache in Gegenwart der p19-Protein von TBSV, die PTGS in infiltrierten Geweben hemmt 34 verbessert werden. In unserer Studie untersuchten wir die Wirkung von zwei viralen Silencing Unterdrücker (p19 und p23) mit der Einführung pBID4 Vektor-HAC1 separat Zusammenarbeit infiltriert. Der Co-Infiltration dieser Silencing-Suppressoren schien wenig Einfluss auf transiente Expression HAC1 haben, mit nur einer leichten Erhöhung der HAC1Protein-Akkumulation (15-25%) in Gegenwart von Co-infiltrierten p23 oder p19. Um positiv auf die Proteinproduktion, muss zum Schweigen Drücker gezielt ausgewählt, um effektiv für die gezielten Pflanzenarten und viralen Vektor 63 sein werden. TMV Helikase hat einen Suppressor der RNA-Silencing-Aktivität 64,65. Unsere Daten bestätigen diese Beobachtung als Co-Infiltration von p23 oder p19 mit pBID4-HAC1 führte zu keiner Erhöhung der GFP oder einem leichten Anstieg in der Übergangs HAC1 Proteinproduktion. Zusammenfassend haben wir geändert und optimiert Anlagen und Agrobacterium Wachstumsbedingungen und verbessert die Effizienz der Vakuum-Infiltration. Diese Technologie ermöglicht es uns, in ein paar Stunden zu wachsen und zu infiltrieren Hunderte von Kilogramm Pflanzenmaterial. Wir die Anlage transiente Expression Technik für die Hochdurchsatz-Impfstoff-Produktion im industriellen Maßstab unter current Good Manufacturing Practices (cGMP) Bedingungen erfolgreich automatisiert. Für weitere Informationen about Automatisierung und Auslastung der Anlage transiente Protein-Produktionsanlage für die Produktion von rekombinanten Proteinen, einschließlich Subunit-Impfstoff-Kandidaten, unter cGMP-Bedingungen werden die Leser auf die Website verwiesen <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Die Pflanzen werden nun als eine sichere, zuverlässige, skalierbare und kostengünstige Plattform für die Herstellung von heterologen rekombinanten Biopharmazeutika und industrielle Proteine ​​3.1 erkannt und haben wichtige Vorteile gegenüber mikrobiellen und tierischen Zellexpressionssysteme 4. Pflanzen sind in der Lage, korrekt gefalteten Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen, einschließlich montiert multimeren Antikörper 5-7 auszudrücken. Mehrere Pflanzen gewonnene rekombinante pharmazeutische Proteine ​​werden in der klinischen Evaluation 8. Dazu gehören Patienten-spezifischen rekombinanten Impfstoffe Idiotyp (scFv) für die Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphom 9, Hämagglutinin-Basis-Pandemie und die saisonale Grippe-Impfstoff-Kandidaten 10,11 (Cummings et al., Um Impfstoff eingereicht), Anti-Streptococcus-Oberflächenantigen I / II-Antikörpers zur Behandlung von Zahnkaries 12 und Human-Insulin zur Behandlung von Diabetes 13. Außerdem menschlichen recombinant Glukozerebrosidase für die Enzymersatztherapie bei Patienten mit Gaucher-Krankheit hat in Israel und in den USA zugelassen und wird unter dem Expanded-Access-Programm außerhalb der USA 14,15 vorgesehen. Heterologe Proteine ​​können in stabil transformierten (transgene oder transplastomischer) oder transient transformierte Pflanzen produziert werden. Transient Proteinherstellung bietet mehrere Vorteile gegenüber der Produktion in transgenen Pflanzen, einschließlich kurzer Zeit, um die Expression und Akkumulation 16 zu erreichen, und kann durch die Einführung von bakteriellen binären Vektoren oder rekombinanten Pflanzenvirusvektoren in Pflanzengewebe 4 erreicht werden. Das am weitesten fortgeschrittene transienten Expressionssystem beruht auf der Verwendung von &quot;Start-Vektoren&quot;, die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmide kombinieren und durch Agroinfiltration 17,18 geliefert basiert. Agroinfiltration von einem Startvektor auf Basis von Tabakmosaikvirus (TMV) wurde erfolgreich am Labor angewendetskalieren, um Impfstoffantigene gegen Krankheitserreger wie Human Papilloma Virus 19, Yersinia pestis 20 produzieren, Viren Influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 und Pocken-Virus 24 in N. benthamiana Blättern. Agrobacterium-vermittelte transiente Expression ist auch ein vielversprechendes Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von mehreren Proteinen 2,25-27. Zum Beispiel haben Pflanzen vorübergehende Expressionssysteme verwendet worden, um Tumor-spezifische rekombinante Antikörper 28,29, ein glycosyliertes rekombinantes Antikörpers gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 30 und einen monoklonalen Antikörper, der für Anthrax-Schutzantigen 31,32 erzeugen. Co-Infiltration von Nicotiana benthamiana Pflanzen mit einer Ziel-Gen und Suppressor der Gen-Silencing führt zu einer erhöhten Expression des Zielproteins 33,34. Agroinfiltration ist eine gängige Methode zur gleichmäßigen introduCING Bakterien beherbergen, ein Gen von Interesse in pflanzlichen Geweben 35-37. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium für transiente Genexpression in intakten Pflanzenblättern ist eine schnelle, skalierbare und nützliche Methode für die Produktion von Fremdproteinen, ohne dass transgene Pflanzen 38-41 generieren. Während Vakuum Agroinfiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und oberirdischen Teile in Agrobacterium-Suspension getaucht. Dann Vakuum angelegt, wodurch Gase aus Blattinterzellulären Räumen durch Spaltöffnungen zu evakuieren. Schnelle Wieder Druckbeaufschlagung nach Freigabe des Vakuums führt die Infusion von Agrobacterium-Suspension in das Blatt. Nach Vakuuminfiltration von Agrobakterien werden die Pflanzen weiter kultiviert und Zielausdruck wird überwacht. Die höchsten Zielausdruck werden in der Regel 2-3 Tage nach beobachtet Infiltration (dpi) mit einer binären Vektor und 4-7 dpi bei einer Einführung Vektor, nach der das Expressionsniveau in der Regel abnehses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens ist der am häufigsten verwendete Träger für die Abgabe eines Gens von Interesse in eine Anlage zur Herstellung von Proteinen. Agroinfiltration funktioniert außerordentlich gut in N. benthamiana aber relativ schlecht in den meisten anderen Pflanzen, darunter 46 Arabidopsis thaliana. In dieser Studie wurde ein einfaches, effizientes und wirtschaftliches Verfahren für die transiente Proteinproduktion in 5-6 Wochen alten N. entwickelten wir benthamiana mit A. tumefaciens Infiltration. Der Hauptnachteil von Industrie Skalierung der Agroinfiltration Technik ist die Zentrifugation der geernteten Bakterien und Resuspension des Bakterienpellets in einem Medium, 4&#39;-Hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) Monosaccharide, und 2 - (N-Morpholino) -ethansulfonsäure (MES)-Puffer für die Induktion der vir-Gene. Wir waren in der Lage, diese Probleme durch die Optimierung der Agrobacterium überwinden </em&gt; Wachstum in AB-Medium (Minimalmedium), gefolgt von Verdünnung direkt in Milli-Q-Wasser und durch Steuern der Infiltrationszeit und Bedingungen. Wir haben auch Zielprotein-Produktion im Vergleich zu dem Wildtyp-Tabakwirtsarten N. benthamiana und N. Holzwolle, als auch in Hybrid N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Vacuum Skid</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>Maßgeschneiderte</td><td>Pflanzeninfiltration</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Kanada</td><td>AO 50/40</td><td>Hydrokulturmedien für den Anbau von Pflanzen</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog-Salz (MS-Salz)</td><td>Phyto Technology Lab</td><td>M524</td><td>Gewebekulturmedien</td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Agrobacterium-Induktion</td></tr><tr><td>Immobilon-P-Transfermembran</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western-Blotting</td></tr><tr><td>I-Block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western-Blotting</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonales Anti-GFP-Antiserum&nbsp;</td><td>Washington Biotechnology, Baltimore, MD</td><td></td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Maus Anti&ndash; monoklonaler Poly-Histidin-Antikörper</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-Maus-Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; West Pico chemilumineszierendes Substrat</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irland</td><td>P-LICHN</td><td>Lichenase Aktivität</td></tr><tr><td>Kongo Rot&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Gelfärbung</td></tr><tr><td>Digitalkamera&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>Chemilumineszenz-Bildgebung</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Chemilumineszenz-Bildgebung&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-Norm&nbsp;</td><td>Hergestellt in der hauseigenen</td><td></td><td>Chemilumineszenz-Bildgebung</td></tr><tr><td>Pflanzendüngerlösung</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Pflanzenanbau</td></tr><tr><td>Lichenase Standard</td><td>Gereinigt im Haus</td><td></td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporator</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Agrobacterium Transformation&nbsp;</td></tr></tbody></table>

optimierung und nutzung von<em&gt; agrobacterium</em&gt; transient-vermittelte proteinproduktion in<em&gt; nicotiana</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion in Pflanzen ist ein vielversprechender Ansatz zur Impfstoffantigene und therapeutische Proteine ​​in kurzer Zeit zu produzieren. Allerdings ist diese Technologie erst am Anfang, um die Großproduktion, wie viele technologische Hindernisse, Scale-up aufgetragen werden nun überwunden werden. Hier zeigen wir eine einfache und reproduzierbare Methode für die industrielle transiente Protein-Produktion auf Basis von Vakuum-Infiltration von Nicotiana Pflanzen mit Agrobakterien Bucheinführung Vektoren. Optimierung von Agrobacterium Anbau in AB-Medium ermöglicht die direkte Verdünnung der Bakterienkultur in Milli-Q-Wasser, die Vereinfachung der Infiltrationsprozess. Unter drei getesteten Arten von Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) wurde als der vielversprechendste Host aufgrund der Einfachheit der Infiltration ausgewählt, die hohe Reporterprotein Produktion, und etwa zwei-falt höhere Biomasseproduktion unter kontrollierten Umweltbedingungen. Induktion von Agrobacterium pBID4-GFP (Tabak-Mosaik-Virus-Basis) unter Verwendung von Chemikalien wie Acetosyringons Monosaccharid und hatte keine Auswirkungen auf die Produktionsebene Protein. Eindringen Pflanze unter 50 bis 100 mbar für 30 oder 60 Sekunden zu einer etwa 95% Infiltration von Pflanzenblattgewebe. Infiltration mit Agrobacterium Laborstamm GV3101 zeigten im Vergleich zu Agrobakterien LBA4404 Laborstämme und C58C1 und Wildtyp-Agrobakterien-Stämme AT6, AT10, AT77 und A4 die höchste Proteinproduktion. Co-Expression einer viralen RNA-Silencing-Suppressor, p23 oder p19, in N. benthamiana führte in früheren Akkumulation und erhöhte Produktion (15-25%) des Zielproteins (Influenza Virus Hämagglutinin).

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur vorübergehenden Herstellung rekombinanter Proteine in einem pflanzlichen System mithilfe der Agroinfiltrationstechnik zu entwickeln. Dies wird zunächst durch die Optimierung der Pflanzenwachstumsbedingungen erreicht. Der zweite Schritt umfasst die Transformation von Agrobakterien mit Startvektoren, die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmiden kombinieren, gefolgt von der Kultivierung der transformierten Agrobakterien für den Einsatz in den Agro-Experimenten. Während der Agrobakterium-Infiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und die oberirdischen Teile in eine Agrobakterium-Suspension getaucht. Anschließend wird ein Vakuum angelegt, wodurch Luft aus den interzellulären Räumen des Blattgewebes entfernt wird. Durch die schnelle Wiederherstellung des Drucks nach dem Abbrechen des Vakuums wird die Agrobakterium-Suspension in die Blätter eingepresst.Schließlich werden Immunschichtverfahren und Fluoreszenzanalysen verwendet, um die Produktion rekombinanter Proteine in den infiltrierten Pflanzen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Infiltration besteht darin, dass die Vakuuminfiltration für die industrielle Produktion rekombinanter Proteine – einschließlich Impfstoffe und therapeutischer Proteine – hochskaliert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Pflanzenbiotechnologie zu beantworten und die Verwendung von Pflanzen als alternative Plattform für die kommerzielle Produktion rekombinanter Proteine weiter zu erleichtern.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir feststellten, dass die Hochskalierung der Agroinfiltration bei auf Erde wachsenden Pflanzen schwierig ist. Aus mehreren Gründen enthält Erde Unreinheiten wie Viren, Bakterien und Nematoden; außerdem variieren der Gehalt der Erde und das Bewässerungswasser von Charge zu Charge sowie von Saison zu Saison, und die Erde altert im Laufe der Lagerung. Zudem würde das Umkippen von auf Erde wachsenden Pflanzen während der Infiltration zu unerwünschtem Herabtropfen von Erde in die Agrobakterien-Kultur führen.Rebecca Snow, eine leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Labor für Pflanzenbiologie und Ingenieurwesen, sowie Emma Gut Robin Lobe werden dieses Verfahren demonstrieren. Sie und Adam Trevor, wissenschaftliche Mitarbeiter aus meinem Labor, führen die Durchführung durch. Diese Studie verwendet ein hydroponisches Pflanzenwachstumsmedium und Nährlösung, um eine gleichmäßige Pflanzenentwicklung sicherzustellen und die Komplexitäten zu vermeiden, die mit dem Einsatz von Erde für die Pflanzenkultivierung verbunden sind.Um dieses Verfahren zu beginnen, werden Steinwollplatten fünf Minuten lang in eine Pflanzendüngerlösung getaucht und anschließend die Samen manuell auf der nährstoffgetränkten Oberfläche der Steinwolle ausgesät. In dieser Studie werden drei Nico Oceana-Sorten mithilfe des Cedar-Verfahrens bewertet: zwei Wildtyp-Sorten, nämlich Nico Oceana Benham Ana und Nico Oceana Excelsior, sowie ein Hybrid aus Benham, Ana und Excelsior, der als Nico Oceana Excela bezeichnet wird. Die Pflanzen werden aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen und mit einer langen Lichtperiode in einem hydroponischen, wasserfallartigen Wachstumssystem kultiviert.Nico Oceana, Bentham Miana und Nico Oceana Excela für vier bis fünf Wochen sowie Nico Oceana Excelsior für fünf bis sechs Wochen. Die in diesem Experiment verwendeten Agrobacterium-tumefaciens-Stämme wurden, wie in der begleitenden Publikation beschrieben, mit den entsprechenden Transformationsvektoren transformiert. Für die Zwecke dieser Demonstration werden fünf transformierte Agrobacterium-Stämme verwendet.GV3101, tragend ein Reporter-Gen für grün fluoreszierendes Protein oder GFP, GV3101, tragend das virale Gen des Silencing-Suppressors des Tomaten-Buschy-Stunt-Virus P19, und A4 GV3101 sowie eine T1, tragend das Gen eines modifizierten Trägerproteins, einer Liasen oder Lick KM. Kultivieren Sie Agrobacterium-Stämme über Nacht in LB-Medium, ergänzt mit 50 Milligramm pro Liter Kanamycin bei 28 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 bis 250 U/min. Bereiten Sie am folgenden Tag Agrobacterium-Suspensionen für die gewünschten Experimente vor, um die Eignung der Verwendung mehrerer Agrobacterium-Stämme für die transiente Proteinproduktion zu untersuchen. Verdünnen Sie einen Lab-Stamm und zwei Wildtyp-Stämme, die den PBI4-Lick-KM-Vektor enthalten, in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5.Um die Notwendigkeit der Induktion von Agrobacterium-Virulenzgenen vor der Infiltration zu untersuchen, zentrifugieren Sie zunächst Agrobacterium-Kulturen, die den P bid 4G FP-Vektor enthalten und in LB-Medium gezüchtet wurden, bei 4.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie sie in MMA-Induktionsmedium auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 und rühren zwei Stunden bei Raumtemperatur um zu testen, ob Acetyl-Keton die transiente Proteinsynthese verbessert. Zentrifugieren und resuspendieren Sie die Agrobacterium-Kultur, die den PBI 4G FP-Vektor über Nacht in LB-Medium enthielt, in Infiltrationspuffer, der 1× MS-Salz, 10 Millimolar MES und 2 % Glukose enthält.Teilen Sie die Zellsuspension auf vier Behälter auf. Geben Sie eine unterschiedliche Konzentration von Acetokon zu jeder der Agrobacterium-Suspensionen hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bei Raumtemperatur. Um den Effekt einer Co-Infiltration eines viralen Silencing-Suppressors auf die transiente GFP-Proteinproduktion zu testen, mischen Sie.Eine mit Milli-Q-Wasser verdünnte Agrobacterium-Kultur, die das GFP-Gen trägt, und eine Kultur, die den viralen Silencing-Suppressor P19 trägt, im Verhältnis vier zu eins, während der Vakuuminfiltration von Pflanzen, die demonstriert wird. Als Nächstes ist es entscheidend, den Vakuumdruck und die Dauer der Infiltration zur Vakuuminfiltration von Pflanzen zu kontrollieren. Überführen Sie zunächst die vorbereitete Agrobacterium-Suspension in einen Behälter innerhalb der Vakuumkammer.Danach die Pflanze in der verdünnten Agrobakterienlösung umgedreht einlegen und ein Vakuum von 50 bis 400 Millibar für 30 oder 60 Sekunden anlegen. Die optimale Infiltration erfolgt üblicherweise bei 50 bis 100 Millibar für 60 Sekunden. Sobald das Vakuum abgebrochen wird, die Pflanzen aus der Vakuumkammer entfernen, mit Wasser abspülen und fünf bis sieben Tage unter denselben Wachstumsbedingungen wie vor der Filtration kultivieren.Um Proben für die Western-Analyse vorzubereiten, sammeln Sie zunächst zufällige Blattproben von Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior oder Nico Oceana Excela-Pflanzen vier bis sieben Tage nach der Infiltration oder DPI. Zerkleinern Sie die Blattproben in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. Geben Sie drei Volumina eines 1x PBS-Puffers mit 0,5 % Triton X-100 zu jeder Probe hinzu und überführen Sie die Probe in ein Eppendorf-Röhrchen. Schütteln oder rotieren Sie die extrahierten Proben vorsichtig 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Extrakt fünf Minuten lang und sammeln Sie das gesamte lösliche Protein in einem sauberen Eppendorf-Gefäß. Verdünnen Sie die Extrakte in geeigneter Weise in 1× PBS-Extraktionspuffer und geben Sie 5× Probenpuffer bis zur endgültigen Konzentration von 1× hinzu. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang zum Kochen, bevor Sie die Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese trennen.Nachdem die Proteine auf eine feste P-Transfermembran übertragen wurden, detektieren Sie GFP unter Verwendung eines kaninchenspezifischen polyklonalen Anti-GFP-Antiserums in einer Verdünnung von 1:5.000 in der Blockierungslösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln, nachdem die Membran dreimal mit 1× PBS-T20 gewaschen wurde. Inkubieren Sie anschließend mit dem mit HRP konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 für eine Stunde zur GFP-Detektion.Anschließend werden die Western Blots aufgearbeitet und die Bandintensitäten, die den Proteinen entsprechen, wie in der begleitenden Publikation beschrieben analysiert. Die visuelle Detektion der GFP-Fluoreszenz in ganzen vorübergehend transformierten Pflanzen erfolgt mithilfe einer tragbaren UV-Lampe mit langen Wellenlängen; verwenden Sie eine Digitalkamera und eine Belichtungszeit von 15 Sekunden, um die vorübergehend transformierten Pflanzen durch einen gelben 8-ES-52-Filter zu fotografieren. Gewinnen Sie Bilder aus Western-Blot-Analysen mithilfe der Gene-Snapped-Software auf einem Genom.Quantifizieren Sie die Ergebnisse mithilfe der Gen-Tool-Software mit einer Kalibrierungskurve, die auf einem gereinigten GFP-Standard basiert. Nick Oceana Bentham Miana wurde auf Rockwell-Platten gezüchtet, die in handelsüblichen Düngemitteln getränkt waren, um die optimalen Bedingungen für das Pflanzenwachstum und die Biomasseakkumulation zu bestimmen. Das Vorhandensein von Phosphor ist entscheidend, um die Keimung und das Wachstum von NICO Oceana Bentham zu erreichen, wie anhand dieser sechs Wochen alten Pflanzen gezeigt, die entweder in einer Nährlösung mit 4,8 % Phosphor oder in einer Nährlösung mit 0 % Phosphor wuchsen.Die Auswirkungen des Wachstums von Agrobacterium und des Infiltrationsmediums auf die Pflanzengesundheit und die Proteingewinnung wurden durch den Vergleich der GFP-Produktion in Nicotiana untersucht. Hamana-Pflanzen wurden unter Vakuum mit PBI 4G FP infiltriert, das Agrobacterium-Kulturen enthielt, die in drei verschiedenen Medien gezüchtet worden waren. Kulturen in YEB, AB und LB, die über Nacht in YEB- oder LB-Medium angezogen wurden, wurden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und in MMA-Induktionsmedium resuspendiert, oder sie wurden über Nacht in YEB, LB oder AB angezogen und anschließend direkt im Verhältnis 1:5 oder 1:10 mit Milli-Q-Wasser verdünnt. Wie dieses Western-Blot-Ergebnis zeigt, wiesen Pflanzen, die mit Agrobacterium-Kulturen infiltriert wurden, die in YEB, LB oder AB angezogen und mit Milli-Q-Wasser verdünnt worden waren, keinen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen GFP-Produktion im Vergleich zu Kulturen auf, die zentrifugiert und in MMA resuspendiert worden waren.Daher wird milliQ-Wasser zur Verdünnung von Agrobacterium-Kulturen für die Pflanzeninfiltration empfohlen und wurde routinemäßig in nachfolgenden Experimenten verwendet, um eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 zu erreichen. Anschließend wurden die Auswirkungen der Agrobacterium-Zellsuspensionsdichte und des Zeitverlaufs auf die Zielexpression untersucht. Vier verschiedene Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium, das PBI 4G FP trägt, wurden bewertet, und Blattproben wurden vier, sieben und zehn Tage nach der Infiltration (DPI) gesammelt, um bei vier DPI eine Western-Blot-Analyse durchzuführen. Bei vier DPI waren deutliche Unterschiede in der GFP-Fluoreszenz zwischen Pflanzen erkennbar, die mit unterschiedlichen Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium infiltriert worden waren. Bei einer Dichte von 600 von 0,05 wurde keine GFP-Expression beobachtet. Bei sieben DPI war GFP nachweisbar.Die Fluoreszenz war bei Pflanzen, die mit Zellsuspensionen mit Dichten von 601,0, 0,5 und 0,1 infiltriert wurden, ähnlich, war jedoch geringer bei Pflanzen, die mit einer A600 von 0,05 infiltriert wurden, im Vergleich zu 10 DPI. Es wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion zwischen Pflanzen beobachtet, die mit einer der vier Zellsuspensionsdichten infiltriert wurden, um die Vielfalt der für die transiente Proteinproduktion verfügbaren Agrobacterium-Stämme zu erhöhen.Nicotiana-Benham-miana-Pflanzen wurden unter Vakuum mit sieben verschiedenen Stämmen von Agrobakterien infiltriert, die den Vektor KBI vier lick km enthalten. Die infiltrierten Blätter wurden nach sieben Tagen (DPI) gesammelt und die Expression der Kinase wurde mittels Western Blot bestimmt. Wie in dieser Grafik dargestellt, wurde die höchste Produktion an Liase mit den Stämmen GV 3 1 10, 1 A vier und LBA 4 4 0 4 erreicht, wobei geringe Unterschiede zwischen ihnen bestehen.Während die geringste Expressionsstufe mit C fünf acht C eins erzielt wurde, wurde eine mittlere Lyaseproduktion mit den Stämmen a T 77, A T null sechs und a T 10 erreicht. Die lyasekatalytische Aktivität wurde mittels eines XMO-Graham-Assays nachgewiesen. Das gereinigte bakterielle Lyaseprotein diente als positiver Kontrollwert für die enzymatische Aktivität. Bemerkenswert ist, dass Nicotiana benthamiana-Pflanzen, die mit den wildtypischen Agrobacterium-Stämmen A vier und a T sieben sieben infiltriert wurden, pathologische Symptome wie Wachstumsverzögerung, Petiolelongation und -verkrümmung sowie Blattrollen am siebten Tag nach Infiltration (7 DPI) zeigten.Die Symptome waren mild bei Nicotiana benham-Pflanzen, die mit dem Wildtyp-Stamm T 10 infiltriert wurden. Bei Nico Oceana Benham-Pflanzen, die mit dem Labortham GV 3 1 0 1 infiltriert wurden, wurden keine Symptome beobachtet. Ein Vergleich der Pflanzenbiomasseproduktion im Wildtyp zeigte, dass unter gleichen Wachstumsbedingungen die höchste Blattbiomasse, die aus Nico Oceana Excela gewonnen werden kann, etwa doppelt so hoch ist wie die aus Nico Oceana.Die Benham-Proteinproduktion wurde in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior und Nico Oceana Excela untersucht, die mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der den PBI4GF-P-G-F-P-Akkumulationsvektor trägt, infiltrierte wurden. Die Akkumulation von GFP wurde sieben Tage nach der Infiltration (DPI) in gesamten infiltrierten Blättern bewertet. Die visuelle Untersuchung der GFP-Expression unter UV-Licht zeigte eine gleichmäßige Verteilung von GFP in Nico Oceana Hamana und Nico Oceana Excela, während in Nico Oceana Excelsior eine ungleichmäßige Verteilung aufgrund der Schwierigkeit, den gesamten Blattbereich von Nico Oceana Excelsior zu infiltrieren, beobachtet wurde. Die Western-Blot-Analyse der GFP-Akkumulation in diesen infiltrierten Blättern am siebten DPI zeigte, dass das GFP-Niveau in Nico Oceana Hamana höher war als in Nico Oceana Excela und Nico Oceana Excelsior, was auf ein niedriges Maß an Proteinproduktion in Nico Oceana hinweist.Excelsior beruht auf einer ungleichmäßigen Infiltration und ungleichmäßigen Verteilung des angesammelten GFP im gesammelten Blatt. Um den Einfluss des Vakuumdrucks auf die Blätter zu testen, wurden Nico Oceana Benham-Pflanzen mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der PBI4GFP trägt, unter Vakuumdrücken von 400, 200, 100 oder 50 Millibar bei einer Vakuumhaltezeit von 30 oder 60 Sekunden infiltriert. Bei Anwendung von Vakuumdrücken von 5, 100 und 200 Millibar für 30 oder 60 Sekunden wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion sowie nur geringe bis keine nachteiligen Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit beobachtet.Der Einfluss der Dauer des Vakuums auf die Zielexpression wurde untersucht, indem jede Stunde eine Platte mit Nico Oceana Benham-Pflanzen mit einem A600 von 0,5 von GV3101, das PBI4GFP trägt, über einen Zeitraum von acht Stunden infiltriert wurde. In derselben Agrobacterium-Kultur wie in diesem repräsentativen Ergebnis gezeigt, war die Menge an produziertem GFP zu allen Zeitpunkten bis zu acht Stunden ähnlich, was darauf hindeutet, dass Agrobacterium über diesen Zeitraum hinweg seine Fähigkeit beibehält, ein einzelsträngiges DNA-Molekül zu übertragen. Da bereits berichtet wurde, dass viele Chemikalien und Monosaccharide die transiente Proteinsynthese in verschiedenen Pflanzenarten verbessern können.Diese Studie bewertete auch die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Acetophenon, Crinon und Glukose auf die transiente GFP-Proteinproduktion in Nicotiana occidentalis Benham, Ana, die mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der das PBI4GFP-Plasmid trägt, infiltriert wurden. Die Agrobakterien wurden über Nacht in YEB-Medium angezogen, zentrifugiert und anschließend in einem A600 von 0,5 entweder in MMA, das 2 % Glukose und Acetophenon in den angegebenen Konzentrationen enthielt, oder in MMA, das 200 µM Acetophenon und Glukose in den angegebenen Konzentrationen enthielt, resuspendiert. Wie hier gezeigt, führte keine der getesteten Konzentrationen dieser Verbindungen im Vergleich zur Kontrolle, bei der das Induktionsmedium kein Acetophenon oder Glukose enthielt, zu einer signifikanten Steigerung der GFP-Proteinproduktion.Anschließend wurde der Effekt einer ko-infiltrierten Silencing-Suppressor auf die transiente Expression der GFP- und HAC1-Gene in Nicotiana occidentalis 'Benham'-Blättern untersucht. Agrobacterium-GV3101-Kulturen, die entweder PBI4GFP oder den viralen Silencing-Suppressor P19 des Tomato bushy stunt virus enthielten, wurden vor der Infiltration in den Verhältnissen 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1 miteinander vermischt. Wie die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse am siebten Tag nach Infiltration (DPI) zeigen, führte das Vorhandensein von P19 in keinem der gemischten Verhältnisse zu einer Erhöhung oder Verringerung der GFP-Produktion in Nicotiana benthamiana.Zusätzlich wurde der Einfluss zweier viraler Gen-Silencing-Suppressoren, P23 und P19, auf die Verhinderung der posttranskriptionellen Gen-Silencing für HAC1 untersucht. POS von Agrobacterium, das den Launch-Vektor PBI4-HAC1 und eines der beiden viralen Silencing-Suppressor-Plasmide trägt, wurden jeweils im Verhältnis 4:1 gemischt und gemeinsam in Nicotiana benthamiana infiltriert. Die infiltrierten Blattproben wurden 3 bis 8 Tage nach der Infiltration (DPI) gesammelt.Dieses Diagramm zeigt die durchschnittlichen HAC1-Expressionsniveaus aus drei Experimenten, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die gleichzeitige Infiltration von Nicotiana occidentalis mit P23 oder P19 führte im Vergleich zur Verwendung ohne Silencing-Suppressor bei 60 pi zu einer Erhöhung der HAC1-Produktion. Dies deutet darauf hin, dass P23 und P19 in diesem System effizient sind.Es wurde ebenfalls beobachtet, dass der Gehalt an HAC1-Protein sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Silencing-Suppressors ab sieben Tagen nach Infiltration (DPI) abzunehmen begann. Dies zeigt, dass der Zeitpunkt des Rückgangs der transienten Proteinproduktion in mit dem Launch-Vektor infiltrierten Nicotiana benthamiana-Pflanzen zielgerichtet ist. Abschließend wird die Stabilität der Agrobacterium-Zellbank jährlich überprüft, indem Nicotiana benthamiana-Pflanzen mit derselben Charge der Agrobacterium-Zellbank infiltriert werden, um die Proteinakkumulation zu bewerten.Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Produktion des HA-eins-Proteins über mehr als drei Jahre hinweg sehr stabil war. Die durchschnittliche HAC-eins-Produktion in Nicotiana benam-Pflanzen beträgt 651 ± 49,4 Milligramm pro Kilogramm. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Agroinfiltrationstechnik zur großtechnischen Herstellung rekombinanter Proteine angewendet wird, die beispielsweise zur Herstellung von Untereinheitsimpfstoffen, therapeutischen Proteinantikörpern und diagnostischen Antigenen verwendet werden können.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Pflanzenkreuzung hydroponisch zu kontrollieren, lebensfähige Agrobakterien zu verwenden, den Vakuumdruck und die Dauer zu regulieren und das Expressionsvehikel des Proteins zu überwachen. Wenn man die Technik beherrscht, kann die Agrofiltrationstechnik innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, sofern sie unter kontrollierten Bedingungen korrekt angewendet wird.

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