Optimierung und Nutzung von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur vorübergehenden Herstellung rekombinanter Proteine in einem pflanzlichen System mithilfe der Agroinfiltrationstechnik zu entwickeln. Dies wird zunächst durch die Optimierung der Pflanzenwachstumsbedingungen erreicht. Der zweite Schritt umfasst die Transformation von Agrobakterien mit Startvektoren, die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmiden kombinieren, gefolgt von der Kultivierung der transformierten Agrobakterien für den Einsatz in den Agro-Experimenten.

Während der Agrobakterium-Infiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und die oberirdischen Teile in eine Agrobakterium-Suspension getaucht. Anschließend wird ein Vakuum angelegt, wodurch Luft aus den interzellulären Räumen des Blattgewebes entfernt wird. Durch die schnelle Wiederherstellung des Drucks nach dem Abbrechen des Vakuums wird die Agrobakterium-Suspension in die Blätter eingepresst.

Schließlich werden Immunschichtverfahren und Fluoreszenzanalysen verwendet, um die Produktion rekombinanter Proteine in den infiltrierten Pflanzen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Infiltration besteht darin, dass die Vakuuminfiltration für die industrielle Produktion rekombinanter Proteine – einschließlich Impfstoffe und therapeutischer Proteine – hochskaliert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Pflanzenbiotechnologie zu beantworten und die Verwendung von Pflanzen als alternative Plattform für die kommerzielle Produktion rekombinanter Proteine weiter zu erleichtern.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir feststellten, dass die Hochskalierung der Agroinfiltration bei auf Erde wachsenden Pflanzen schwierig ist. Aus mehreren Gründen enthält Erde Unreinheiten wie Viren, Bakterien und Nematoden; außerdem variieren der Gehalt der Erde und das Bewässerungswasser von Charge zu Charge sowie von Saison zu Saison, und die Erde altert im Laufe der Lagerung. Zudem würde das Umkippen von auf Erde wachsenden Pflanzen während der Infiltration zu unerwünschtem Herabtropfen von Erde in die Agrobakterien-Kultur führen.

Rebecca Snow, eine leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Labor für Pflanzenbiologie und Ingenieurwesen, sowie Emma Gut Robin Lobe werden dieses Verfahren demonstrieren. Sie und Adam Trevor, wissenschaftliche Mitarbeiter aus meinem Labor, führen die Durchführung durch. Diese Studie verwendet ein hydroponisches Pflanzenwachstumsmedium und Nährlösung, um eine gleichmäßige Pflanzenentwicklung sicherzustellen und die Komplexitäten zu vermeiden, die mit dem Einsatz von Erde für die Pflanzenkultivierung verbunden sind.

Um dieses Verfahren zu beginnen, werden Steinwollplatten fünf Minuten lang in eine Pflanzendüngerlösung getaucht und anschließend die Samen manuell auf der nährstoffgetränkten Oberfläche der Steinwolle ausgesät. In dieser Studie werden drei Nico Oceana-Sorten mithilfe des Cedar-Verfahrens bewertet: zwei Wildtyp-Sorten, nämlich Nico Oceana Benham Ana und Nico Oceana Excelsior, sowie ein Hybrid aus Benham, Ana und Excelsior, der als Nico Oceana Excela bezeichnet wird. Die Pflanzen werden aus den Samen unter kontrollierten Bedingungen und mit einer langen Lichtperiode in einem hydroponischen, wasserfallartigen Wachstumssystem kultiviert.

Nico Oceana, Bentham Miana und Nico Oceana Excela für vier bis fünf Wochen sowie Nico Oceana Excelsior für fünf bis sechs Wochen. Die in diesem Experiment verwendeten Agrobacterium-tumefaciens-Stämme wurden, wie in der begleitenden Publikation beschrieben, mit den entsprechenden Transformationsvektoren transformiert. Für die Zwecke dieser Demonstration werden fünf transformierte Agrobacterium-Stämme verwendet.

GV3101, tragend ein Reporter-Gen für grün fluoreszierendes Protein oder GFP, GV3101, tragend das virale Gen des Silencing-Suppressors des Tomaten-Buschy-Stunt-Virus P19, und A4 GV3101 sowie eine T1, tragend das Gen eines modifizierten Trägerproteins, einer Liasen oder Lick KM. Kultivieren Sie Agrobacterium-Stämme über Nacht in LB-Medium, ergänzt mit 50 Milligramm pro Liter Kanamycin bei 28 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 bis 250 U/min. Bereiten Sie am folgenden Tag Agrobacterium-Suspensionen für die gewünschten Experimente vor, um die Eignung der Verwendung mehrerer Agrobacterium-Stämme für die transiente Proteinproduktion zu untersuchen. Verdünnen Sie einen Lab-Stamm und zwei Wildtyp-Stämme, die den PBI4-Lick-KM-Vektor enthalten, in Milli-Q-Wasser auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5.

Um die Notwendigkeit der Induktion von Agrobacterium-Virulenzgenen vor der Infiltration zu untersuchen, zentrifugieren Sie zunächst Agrobacterium-Kulturen, die den P bid 4G FP-Vektor enthalten und in LB-Medium gezüchtet wurden, bei 4.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie sie in MMA-Induktionsmedium auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 und rühren zwei Stunden bei Raumtemperatur um zu testen, ob Acetyl-Keton die transiente Proteinsynthese verbessert. Zentrifugieren und resuspendieren Sie die Agrobacterium-Kultur, die den PBI 4G FP-Vektor über Nacht in LB-Medium enthielt, in Infiltrationspuffer, der 1× MS-Salz, 10 Millimolar MES und 2 % Glukose enthält.

Teilen Sie die Zellsuspension auf vier Behälter auf. Geben Sie eine unterschiedliche Konzentration von Acetokon zu jeder der Agrobacterium-Suspensionen hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bei Raumtemperatur. Um den Effekt einer Co-Infiltration eines viralen Silencing-Suppressors auf die transiente GFP-Proteinproduktion zu testen, mischen Sie.

Eine mit Milli-Q-Wasser verdünnte Agrobacterium-Kultur, die das GFP-Gen trägt, und eine Kultur, die den viralen Silencing-Suppressor P19 trägt, im Verhältnis vier zu eins, während der Vakuuminfiltration von Pflanzen, die demonstriert wird. Als Nächstes ist es entscheidend, den Vakuumdruck und die Dauer der Infiltration zur Vakuuminfiltration von Pflanzen zu kontrollieren. Überführen Sie zunächst die vorbereitete Agrobacterium-Suspension in einen Behälter innerhalb der Vakuumkammer.

Danach die Pflanze in der verdünnten Agrobakterienlösung umgedreht einlegen und ein Vakuum von 50 bis 400 Millibar für 30 oder 60 Sekunden anlegen. Die optimale Infiltration erfolgt üblicherweise bei 50 bis 100 Millibar für 60 Sekunden. Sobald das Vakuum abgebrochen wird, die Pflanzen aus der Vakuumkammer entfernen, mit Wasser abspülen und fünf bis sieben Tage unter denselben Wachstumsbedingungen wie vor der Filtration kultivieren.

Um Proben für die Western-Analyse vorzubereiten, sammeln Sie zunächst zufällige Blattproben von Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior oder Nico Oceana Excela-Pflanzen vier bis sieben Tage nach der Infiltration oder DPI. Zerkleinern Sie die Blattproben in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. Geben Sie drei Volumina eines 1x PBS-Puffers mit 0,5 % Triton X-100 zu jeder Probe hinzu und überführen Sie die Probe in ein Eppendorf-Röhrchen. Schütteln oder rotieren Sie die extrahierten Proben vorsichtig 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie das Extrakt fünf Minuten lang und sammeln Sie das gesamte lösliche Protein in einem sauberen Eppendorf-Gefäß. Verdünnen Sie die Extrakte in geeigneter Weise in 1× PBS-Extraktionspuffer und geben Sie 5× Probenpuffer bis zur endgültigen Konzentration von 1× hinzu. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang zum Kochen, bevor Sie die Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese trennen.

Nachdem die Proteine auf eine feste P-Transfermembran übertragen wurden, detektieren Sie GFP unter Verwendung eines kaninchenspezifischen polyklonalen Anti-GFP-Antiserums in einer Verdünnung von 1:5.000 in der Blockierungslösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln, nachdem die Membran dreimal mit 1× PBS-T20 gewaschen wurde. Inkubieren Sie anschließend mit dem mit HRP konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 für eine Stunde zur GFP-Detektion.

Anschließend werden die Western Blots aufgearbeitet und die Bandintensitäten, die den Proteinen entsprechen, wie in der begleitenden Publikation beschrieben analysiert. Die visuelle Detektion der GFP-Fluoreszenz in ganzen vorübergehend transformierten Pflanzen erfolgt mithilfe einer tragbaren UV-Lampe mit langen Wellenlängen; verwenden Sie eine Digitalkamera und eine Belichtungszeit von 15 Sekunden, um die vorübergehend transformierten Pflanzen durch einen gelben 8-ES-52-Filter zu fotografieren. Gewinnen Sie Bilder aus Western-Blot-Analysen mithilfe der Gene-Snapped-Software auf einem Genom.

Quantifizieren Sie die Ergebnisse mithilfe der Gen-Tool-Software mit einer Kalibrierungskurve, die auf einem gereinigten GFP-Standard basiert. Nick Oceana Bentham Miana wurde auf Rockwell-Platten gezüchtet, die in handelsüblichen Düngemitteln getränkt waren, um die optimalen Bedingungen für das Pflanzenwachstum und die Biomasseakkumulation zu bestimmen. Das Vorhandensein von Phosphor ist entscheidend, um die Keimung und das Wachstum von NICO Oceana Bentham zu erreichen, wie anhand dieser sechs Wochen alten Pflanzen gezeigt, die entweder in einer Nährlösung mit 4,8 % Phosphor oder in einer Nährlösung mit 0 % Phosphor wuchsen.

Die Auswirkungen des Wachstums von Agrobacterium und des Infiltrationsmediums auf die Pflanzengesundheit und die Proteingewinnung wurden durch den Vergleich der GFP-Produktion in Nicotiana untersucht. Hamana-Pflanzen wurden unter Vakuum mit PBI 4G FP infiltriert, das Agrobacterium-Kulturen enthielt, die in drei verschiedenen Medien gezüchtet worden waren. Kulturen in YEB, AB und LB, die über Nacht in YEB- oder LB-Medium angezogen wurden, wurden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und in MMA-Induktionsmedium resuspendiert, oder sie wurden über Nacht in YEB, LB oder AB angezogen und anschließend direkt im Verhältnis 1:5 oder 1:10 mit Milli-Q-Wasser verdünnt. Wie dieses Western-Blot-Ergebnis zeigt, wiesen Pflanzen, die mit Agrobacterium-Kulturen infiltriert wurden, die in YEB, LB oder AB angezogen und mit Milli-Q-Wasser verdünnt worden waren, keinen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen GFP-Produktion im Vergleich zu Kulturen auf, die zentrifugiert und in MMA resuspendiert worden waren.

Daher wird milliQ-Wasser zur Verdünnung von Agrobacterium-Kulturen für die Pflanzeninfiltration empfohlen und wurde routinemäßig in nachfolgenden Experimenten verwendet, um eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 zu erreichen. Anschließend wurden die Auswirkungen der Agrobacterium-Zellsuspensionsdichte und des Zeitverlaufs auf die Zielexpression untersucht. Vier verschiedene Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium, das PBI 4G FP trägt, wurden bewertet, und Blattproben wurden vier, sieben und zehn Tage nach der Infiltration (DPI) gesammelt, um bei vier DPI eine Western-Blot-Analyse durchzuführen. Bei vier DPI waren deutliche Unterschiede in der GFP-Fluoreszenz zwischen Pflanzen erkennbar, die mit unterschiedlichen Zellsuspensionsdichten von Agrobacterium infiltriert worden waren. Bei einer Dichte von 600 von 0,05 wurde keine GFP-Expression beobachtet. Bei sieben DPI war GFP nachweisbar.

Die Fluoreszenz war bei Pflanzen, die mit Zellsuspensionen mit Dichten von 601,0, 0,5 und 0,1 infiltriert wurden, ähnlich, war jedoch geringer bei Pflanzen, die mit einer A600 von 0,05 infiltriert wurden, im Vergleich zu 10 DPI. Es wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion zwischen Pflanzen beobachtet, die mit einer der vier Zellsuspensionsdichten infiltriert wurden, um die Vielfalt der für die transiente Proteinproduktion verfügbaren Agrobacterium-Stämme zu erhöhen.

Nicotiana-Benham-miana-Pflanzen wurden unter Vakuum mit sieben verschiedenen Stämmen von Agrobakterien infiltriert, die den Vektor KBI vier lick km enthalten. Die infiltrierten Blätter wurden nach sieben Tagen (DPI) gesammelt und die Expression der Kinase wurde mittels Western Blot bestimmt. Wie in dieser Grafik dargestellt, wurde die höchste Produktion an Liase mit den Stämmen GV 3 1 10, 1 A vier und LBA 4 4 0 4 erreicht, wobei geringe Unterschiede zwischen ihnen bestehen.

Während die geringste Expressionsstufe mit C fünf acht C eins erzielt wurde, wurde eine mittlere Lyaseproduktion mit den Stämmen a T 77, A T null sechs und a T 10 erreicht. Die lyasekatalytische Aktivität wurde mittels eines XMO-Graham-Assays nachgewiesen. Das gereinigte bakterielle Lyaseprotein diente als positiver Kontrollwert für die enzymatische Aktivität. Bemerkenswert ist, dass Nicotiana benthamiana-Pflanzen, die mit den wildtypischen Agrobacterium-Stämmen A vier und a T sieben sieben infiltriert wurden, pathologische Symptome wie Wachstumsverzögerung, Petiolelongation und -verkrümmung sowie Blattrollen am siebten Tag nach Infiltration (7 DPI) zeigten.

Die Symptome waren mild bei Nicotiana benham-Pflanzen, die mit dem Wildtyp-Stamm T 10 infiltriert wurden. Bei Nico Oceana Benham-Pflanzen, die mit dem Labortham GV 3 1 0 1 infiltriert wurden, wurden keine Symptome beobachtet. Ein Vergleich der Pflanzenbiomasseproduktion im Wildtyp zeigte, dass unter gleichen Wachstumsbedingungen die höchste Blattbiomasse, die aus Nico Oceana Excela gewonnen werden kann, etwa doppelt so hoch ist wie die aus Nico Oceana.

Die Benham-Proteinproduktion wurde in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior und Nico Oceana Excela untersucht, die mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der den PBI4GF-P-G-F-P-Akkumulationsvektor trägt, infiltrierte wurden. Die Akkumulation von GFP wurde sieben Tage nach der Infiltration (DPI) in gesamten infiltrierten Blättern bewertet. Die visuelle Untersuchung der GFP-Expression unter UV-Licht zeigte eine gleichmäßige Verteilung von GFP in Nico Oceana Hamana und Nico Oceana Excela, während in Nico Oceana Excelsior eine ungleichmäßige Verteilung aufgrund der Schwierigkeit, den gesamten Blattbereich von Nico Oceana Excelsior zu infiltrieren, beobachtet wurde. Die Western-Blot-Analyse der GFP-Akkumulation in diesen infiltrierten Blättern am siebten DPI zeigte, dass das GFP-Niveau in Nico Oceana Hamana höher war als in Nico Oceana Excela und Nico Oceana Excelsior, was auf ein niedriges Maß an Proteinproduktion in Nico Oceana hinweist.

Excelsior beruht auf einer ungleichmäßigen Infiltration und ungleichmäßigen Verteilung des angesammelten GFP im gesammelten Blatt. Um den Einfluss des Vakuumdrucks auf die Blätter zu testen, wurden Nico Oceana Benham-Pflanzen mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der PBI4GFP trägt, unter Vakuumdrücken von 400, 200, 100 oder 50 Millibar bei einer Vakuumhaltezeit von 30 oder 60 Sekunden infiltriert. Bei Anwendung von Vakuumdrücken von 5, 100 und 200 Millibar für 30 oder 60 Sekunden wurden keine Unterschiede in der GFP-Produktion sowie nur geringe bis keine nachteiligen Auswirkungen auf die Pflanzengesundheit beobachtet.

Der Einfluss der Dauer des Vakuums auf die Zielexpression wurde untersucht, indem jede Stunde eine Platte mit Nico Oceana Benham-Pflanzen mit einem A600 von 0,5 von GV3101, das PBI4GFP trägt, über einen Zeitraum von acht Stunden infiltriert wurde. In derselben Agrobacterium-Kultur wie in diesem repräsentativen Ergebnis gezeigt, war die Menge an produziertem GFP zu allen Zeitpunkten bis zu acht Stunden ähnlich, was darauf hindeutet, dass Agrobacterium über diesen Zeitraum hinweg seine Fähigkeit beibehält, ein einzelsträngiges DNA-Molekül zu übertragen. Da bereits berichtet wurde, dass viele Chemikalien und Monosaccharide die transiente Proteinsynthese in verschiedenen Pflanzenarten verbessern können.

Diese Studie bewertete auch die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Acetophenon, Crinon und Glukose auf die transiente GFP-Proteinproduktion in Nicotiana occidentalis Benham, Ana, die mit dem Agrobacterium-Stamm GV3101, der das PBI4GFP-Plasmid trägt, infiltriert wurden. Die Agrobakterien wurden über Nacht in YEB-Medium angezogen, zentrifugiert und anschließend in einem A600 von 0,5 entweder in MMA, das 2 % Glukose und Acetophenon in den angegebenen Konzentrationen enthielt, oder in MMA, das 200 µM Acetophenon und Glukose in den angegebenen Konzentrationen enthielt, resuspendiert. Wie hier gezeigt, führte keine der getesteten Konzentrationen dieser Verbindungen im Vergleich zur Kontrolle, bei der das Induktionsmedium kein Acetophenon oder Glukose enthielt, zu einer signifikanten Steigerung der GFP-Proteinproduktion.

Anschließend wurde der Effekt einer ko-infiltrierten Silencing-Suppressor auf die transiente Expression der GFP- und HAC1-Gene in Nicotiana occidentalis 'Benham'-Blättern untersucht. Agrobacterium-GV3101-Kulturen, die entweder PBI4GFP oder den viralen Silencing-Suppressor P19 des Tomato bushy stunt virus enthielten, wurden vor der Infiltration in den Verhältnissen 1:1, 2:1, 3:1 und 4:1 miteinander vermischt. Wie die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse am siebten Tag nach Infiltration (DPI) zeigen, führte das Vorhandensein von P19 in keinem der gemischten Verhältnisse zu einer Erhöhung oder Verringerung der GFP-Produktion in Nicotiana benthamiana.

Zusätzlich wurde der Einfluss zweier viraler Gen-Silencing-Suppressoren, P23 und P19, auf die Verhinderung der posttranskriptionellen Gen-Silencing für HAC1 untersucht. POS von Agrobacterium, das den Launch-Vektor PBI4-HAC1 und eines der beiden viralen Silencing-Suppressor-Plasmide trägt, wurden jeweils im Verhältnis 4:1 gemischt und gemeinsam in Nicotiana benthamiana infiltriert. Die infiltrierten Blattproben wurden 3 bis 8 Tage nach der Infiltration (DPI) gesammelt.

Dieses Diagramm zeigt die durchschnittlichen HAC1-Expressionsniveaus aus drei Experimenten, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die gleichzeitige Infiltration von Nicotiana occidentalis mit P23 oder P19 führte im Vergleich zur Verwendung ohne Silencing-Suppressor bei 60 pi zu einer Erhöhung der HAC1-Produktion. Dies deutet darauf hin, dass P23 und P19 in diesem System effizient sind.

Es wurde ebenfalls beobachtet, dass der Gehalt an HAC1-Protein sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Silencing-Suppressors ab sieben Tagen nach Infiltration (DPI) abzunehmen begann. Dies zeigt, dass der Zeitpunkt des Rückgangs der transienten Proteinproduktion in mit dem Launch-Vektor infiltrierten Nicotiana benthamiana-Pflanzen zielgerichtet ist. Abschließend wird die Stabilität der Agrobacterium-Zellbank jährlich überprüft, indem Nicotiana benthamiana-Pflanzen mit derselben Charge der Agrobacterium-Zellbank infiltriert werden, um die Proteinakkumulation zu bewerten.

Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Produktion des HA-eins-Proteins über mehr als drei Jahre hinweg sehr stabil war. Die durchschnittliche HAC-eins-Produktion in Nicotiana benam-Pflanzen beträgt 651 ± 49,4 Milligramm pro Kilogramm. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Agroinfiltrationstechnik zur großtechnischen Herstellung rekombinanter Proteine angewendet wird, die beispielsweise zur Herstellung von Untereinheitsimpfstoffen, therapeutischen Proteinantikörpern und diagnostischen Antigenen verwendet werden können.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Pflanzenkreuzung hydroponisch zu kontrollieren, lebensfähige Agrobakterien zu verwenden, den Vakuumdruck und die Dauer zu regulieren und das Expressionsvehikel des Proteins zu überwachen. Wenn man die Technik beherrscht, kann die Agrofiltrationstechnik innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, sofern sie unter kontrollierten Bedingungen korrekt angewendet wird.