Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta
15. August 2017
Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Plasmodesmen-Lokalisationssignal in Zielproteinen zu identifizieren. Die Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Untersuchung der interzellulären Verbindungen von Pflanzen zu beantworten, indem sie entscheidende Signale aufdeckt, die Proteine gezielt zu den Plasmodesmen lenken und dadurch den Transport großer Moleküle von Zelle zu Zelle erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Verfahren zuverlässig ist und sich leicht auf die Entdeckung von Plasmodesmen-Lokalisationssignalsequenzen in den meisten auf Plasmodesmen ausgerichteten Proteinen anpassen lässt.
Die Video-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Pflanzen, Filtrieren und Vorbereiten für die konfokale Beobachtung schwer anhand herkömmlicher Druckpublikationen zu erlernen sind. Pflanzen Sie Nicotiana benthamiana-Samen in feuchte Erde und mit hoher Dichte. Während des Wachstums halten Sie sie in einer kontrollierten Umweltkammer bei 20 bis 25 Grad Celsius und unter 16 Stunden Licht pro Tag, was etwa 75 µmol Photonen pro m² pro Sekunde entspricht.
Nachdem der Durchmesser des U. fil. einen halben Zentimeter erreicht hat, überführen Sie die Keimlinge vorsichtig in größere Töpfe und setzen das Wachstum in derselben Kammer unter den gleichen Bedingungen fort. Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie innerhalb von vier Wochen das Vier- bis Acht-Blatt-Stadium erreichen.
Zu diesem Zeitpunkt sollten die größten Blätter einen Durchmesser von vier bis sechs Zentimetern haben. Wählen Sie zur einfachen Identifizierung und Analyse ein Expressionssystem und markieren Sie jedes exprimierte Protein fluoreszenzfarben, wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben. Bereiten Sie ein auf pPZP-RCS2 basierendes Plasmid wie beschrieben vor und geben Sie ein Mikrogramm davon in eine 100-Mikroliter-Kultur kompetenter Zellen von Agrobacterium tumefaciens.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis. Anschließend gefrieren Sie die Zellen für eine Minute in flüssigem Stickstoff ein. Danach erwärmen Sie die Zellen 15 Minuten lang auf 28 Grad Celsius und geben dann einen Milliliter LB-Medium zu der Mischung aus kompetenten Zellen hinzu.
Nach Zugabe des LB-Mediums die Zellen für zwei Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Zellen bei 3.000 ×g für eine Minute zentrifugieren. Den Zellenpellet in 0,2 Milliliter LB-Medium resuspendieren und auf antibiotikaselektiven LB-Agarplatten ausplattieren.
Züchten Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 28 Grad Celsius auf den Platten, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Danach entnehmen Sie mehrere einzelne Kolonien und übertragen sie auf frische LB-Agar-Platten, und züchten die Zellen erneut 48 Stunden bei 28 Grad Celsius. Anschließend entnehmen Sie eine kleine Menge Bakterien von jeder Platte zur Analyse und verwenden die Kolonie-PCR, um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte von Interesse zu bestätigen.
Fügen Sie jede Agrobacterium-Kolonie mit dem gewünschten Konstrukt fünf Milliliter LB-Medium hinzu, das mit den geeigneten Antibiotika ergänzt wurde. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 28 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen mit 3.000 × g. Resuspendieren Sie das Pellet in Agroinfiltrationspuffer auf einen OD600 von 0,5.
Inkubieren Sie die Suspension zwei Stunden bei Raumtemperatur und geben Sie anschließend das Inokulum in eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze. Halten Sie ein vollständig ausgereiftes N. benthamiana-Blatt mit einem behandschuhten Finger an der adaxialen Seite fest und drücken Sie die Spitze der Spritze gegen die untere Epidermis des Blattes. Führen Sie dann langsam das Agrobacterium im Infiltrationsmedium ein, indem Sie das Medium injizieren.
Halten Sie die infiltrierte Pflanze so lange am Leben, bis sie beobachtet werden soll. Schneiden Sie jedes Blatt 24 bis 48 Stunden nach der Infiltration mit einer Klinge zwischen den Blattadern in Fragmente. Legen Sie die Blattschnitte mit der abaxialen Blattoberfläche nach oben auf den Objektträger.
Danach einen Tropfen Wasser auf den Blattschnitt geben und mit dem Deckglas abdecken. Das Deckglas mit kleinen Klebestücken an jeder Seite fixieren. Eine Objektträgerplatte unter ein laser-scanning-konfokales Mikroskop bringen und ein 10X-Objektiv verwenden, um Zellen mit dem besten Signal zu identifizieren.
Verwenden Sie anschließend ein 63X-Objektiv, um Bilder für detailliertere Beobachtungen aufzuzeichnen. Nutzen Sie außerdem die geeigneten Fluoreszenzen, um die exprimierten fluoreszierenden Proteine anzuregen. Behalten Sie alle Einstellungen bei, die für die Bildaufnahme verwendet werden, um die Konsistenz zwischen den Experimenten sicherzustellen.
Untersuchen Sie durchschnittlich 100 bis 120 Zellen pro Versuchsbedingung. Diagnostizieren Sie die Lokalisation der getesteten Proteine anhand der konfokalen Mikroskopiebilder. Diese Bilder zeigen die charakteristischen peripheren, punktförmigen Plasmodesmen-Lokalisierungsmuster, die für das vollständige TMV-Bewegungsprotein, das mit dem Cargomolekül CFP fusioniert ist, sowie für das identifizierte Plasmodesmen-Lokalisierungssignal, das mit CFP fusioniert ist, und für das koexprimierte Plasmodesmen-Lokalisierungsprotein PDCB1, das mit DsRed fusioniert ist, beobachtet wurden.
Unter Kontrollbedingungen erfolgt die Plasmodesmen-Ansprechen des vollständigen, mit CFP fusionierten TMV-Bewegungsproteins sowie des in dem TMV-Bewegungsprotein mit CFP fusionierten Lokalisationssignals, wie hier mit der subzellulären Lokalisation von CFP und der nucleozytoplasmatischen Lokalisation des Markers DsRed2 gezeigt. Wenn das vierte Aminosäure-Rest, Valin, in Alanin mutiert wird, geht die Plasmodesmen-Ansprechen sowohl des vollständigen TMV-Bewegungsproteins als auch des identifizierten Lokalisationssignals im TMV-Bewegungsprotein verloren. Dies weist darauf hin, dass dieser Rest für die Struktur oder Funktion des Plasmodesmen-Lokalisationssignals wichtig ist.
Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 50 Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Pflanzen in einem sehr gesunden Zustand sein müssen und sich im richtigen Blattstadium befinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nicht nur gut verstehen, wie man das Signal für das Lokalisierungsprotein der Plasmodesmen identifiziert, sondern auch wissen, wie man andere bestimmte Signale in pflanzlichen Proteinen erkennt.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Identifizierung von Plasmodesmen-Lokalisationssignalen in Zielproteinen, die entscheidend für das Verständnis pflanzlicher interzellulärer Verbindungen sind. Die beschriebene Methode ist zuverlässig und anpassbar, um solche Signale in verschiedenen auf Plasmodesmen ausgerichteten Proteinen zu entdecken.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenphysiologie
- Zellbiologie
- Pflanze-Virus-Interaktionen
Hintergrund
- Plasmodesmen (Pd) sind für den Zell-zu-Zelle-Transport in Pflanzen unerlässlich.
- Sortiersignale lenken Proteine zu den Pd und erleichtern so den Transport.
- Die derzeitigen Erkenntnisse über diese Sequenzen sind begrenzt.
- Das Verständnis dieser Signale kann unser Wissen über die Pflanzenphysiologie erweitern.
Zweck der Studie
- Identifizierung von Plasmodesmata-Lokalisationssignalen in Zielproteinen.
- Verbesserung des Verständnisses interzellulärer Verbindungen in Pflanzen.
- Erleichterung der Untersuchung von Proteintransportmechanismen.
Verwendete Methoden
- Einpflanzen von Nicotiana benthamiana-Samen unter kontrollierten Bedingungen.
- Gewährleistung optimaler Wachstumsbedingungen (20–25 °C, 16 Stunden Licht).
- Anwendung von Konfokalbeobachtungstechniken zur Analyse.
- Bereitstellung einer Videodemonstration für komplexe Schritte.
Hauptergebnisse
- Die Methode identifiziert effektiv Lokalisierungssignale in Proteinen.
- Sie ist anpassungsfähig für verschiedene an Plasmodesmen gezielte Proteine.
- Videoressourcen verbessern das Verständnis des Verfahrens.
- Zuverlässige Ergebnisse tragen zum Bereich der Pflanzenbiologie bei.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert eine wertvolle Methode zur Identifizierung von Pd-Lokalisierungssignalen.
- Das Verständnis dieser Signale kann zu Fortschritten in der Pflanzenphysiologie-Forschung führen.
- Die Zuverlässigkeit der Methode macht sie zu einem nützlichen Werkzeug für Forscher.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Identifizierung von Plasmodesmien-Lokalisierungssignalen ermöglicht eine mechanistische Risikominderung pflanzlicher Expressionssysteme, die bei der Herstellung rekombinanter Proteine eingesetzt werden. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er die für die Herstellung biologischer Arzneimittel in pflanzlichen Wirtssystemen entscheidenden subzellulären Transportwege aufklärt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Proteinlokalisierung und liefert damit Entscheidungsgrundlagen für die Weiterentwicklung oder Einstellung pflanzlich hergestellter therapeutischer Kandidaten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht Proteinsortierungsmechanismen, um funktionelle Targeting-Signale zu validieren, die für den Transport über Plasmodesmen erforderlich sind.
- Operativer Wert: Bietet eine zuverlässige und anpassungsfähige Strategie, um notwendige und ausreichende Lokalisierungssignale direkt in lebenden Pflanzenzellen zu identifizieren.
- Predictiver Wert: Ermöglicht die funktionelle Bestätigung von Targeting-Motiven durch Mutagenese, beispielsweise durch die Substitution von Valin zu Alanin, die die Lokalisation stört.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Verwendet fluoreszente Markierung und konfokale Mikroskopie, um quantitative und reproduzierbare Lokalisierungsergebnisse zu erzeugen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht das Screening mehrerer Proteinvarianten mittels Agrobacterium-vermittelter transienter Expression in Nicotiana benthamiana.
- Plattformweiterverwendung: Der Arbeitsablauf kann auf verschiedene, an Plasmodesmen lokalisierte Proteine angewandt werden, die über virale Bewegungsproteine hinausgehen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckung von Lokalisierungssignalen mit der anschließenden Bewertung der Proteinstabilität und der Effizienz des interzellulären Transports.
- Krankheitsrelevante Systematik: Nutzt ein etabliertes Pflanzenmodellsystem, das mit transienter Expression zur schnellen Validierung von Signalen kompatibel ist.
- Mechanistische Risikominimierung: Verringert die Unsicherheit beim Proteintransport, indem cis-wirkende Elemente identifiziert werden, die für die Zielung an Plasmodesmen erforderlich sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, in denen die subzelluläre Lokalisation die Protein-Engineering- und Konstruktgestaltung für pflanzenbasierte Expressionssysteme beeinflusst.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Targeting-Sequenzen durch direkte Visualisierung der Proteinlokalisation in planta.
- Screening: Ermöglicht die Beurteilung der Signal-Funktionalität durch Kollokalisierung mit Plasmodesmen-Markern wie PDCB1-DsRed.
- Analytik: Erzeugt bildbasierte quantitative Daten zu subzellulären Verteilungsmustern unter kontrollierten Expressionsbedingungen.
- Translationale Forschung: Liefert mechanistische Erkenntnisse zum interzellulären Transport, die für die Optimierung der Proteinproduktion und -mobilität in der pflanzlichen Bioproduktion relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine standardisierte Pipeline zur Entdeckung von Lokalisierungssignalen, die auf mehrere Proteinziele anwendbar ist.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Zielgenauigkeit, indem die minimalen funktionellen Sequenzen für die Lokalisierung an Plasmodesmen definiert werden.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares, videounterstütztes Protokoll, das die Variabilität in Lokalisierungsassays verringert.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Optimierung von Konstrukten zur Verbesserung des intrazellulären Transports in pflanzlichen Expressionssystemen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Protein-Kandidaten basierend auf validierter subzellulärer Zielrichtung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der transienten Expression in Pflanzen, der konfokalen Mikroskopie und der Markierung mit fluoreszierenden Proteinen.
- Benötigt eine Infrastruktur für Agrobacterium-Infiltration sowie kontrollierte Pflanzenwachstumskammern.
- Setzt eine Standardisierung der Bildaufnahmeeinstellungen und Analysekriterien unter verschiedenen Versuchsbedingungen voraus.
- Die Anpassung an verschiedene Pflanzenarten kann eine Optimierung der Infiltrations- und Wachstumsparameter erfordern.
- Die Anwendung ist auf Proteine beschränkt, die stabil exprimiert und in planta fluoreszenzmarkiert werden können, ohne die native Funktion zu stören.
