Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Lokalisationssignal der Plasmodesmen in Zielproteinen zu identifizieren. Die Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung der interzellulären Verbindungen von Pflanzen zu beantworten, indem sie kritisches Denken in Signalen identifiziert, die Proteine zu den Plasmodesmen leiten, was wiederum den Zell-zu-Zell-Transport großer Moleküle erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Verfahren zuverlässig ist und leicht für die Entdeckung von Signalsequenzen zur Lokalisierung von Plasmodesmen in den meisten Plasmodesmata-Zielproteinen angepasst werden kann.

Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Pflanzfiltration, die Vorbereitung für konfokale Beobachtungsschritte mit der typischen druckbasierten Veröffentlichung nur schwer zu erlernen ist. Pflanzen Sie die Samen von Nicotiana benthamiana in feuchtem Boden und mit hoher Dichte. Bewahren Sie sie während des Wachstums in einer kontrollierten Klimakammer bei 20 bis 25 Grad Celsius und unter 16 Stunden Licht pro Tag auf, die etwa 75 Mikromol Photonen pro Quadratmeter und Sekunde enthält.

Nachdem der Durchmesser des U. fil einen halben Zentimeter erreicht hat, setzen Sie die Sämlinge vorsichtig in größere Töpfe um und setzen Sie ihr Wachstum in derselben Kammer unter den gleichen Bedingungen fort. Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie innerhalb von vier Wochen das vier- bis achtblättrige Stadium erreicht haben.

Zu diesem Zeitpunkt sollten die größten Blätter einen Durchmesser von vier bis sechs Zentimetern haben. Zur einfachen Identifizierung und Analyse wählen Sie ein Expressionssystem und markieren Sie jedes exprimierte Protein fluoreszierend, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie ein pPZP-RCS2-basiertes Plasmid wie beschrieben vor und geben Sie ein Mikrogramm davon in eine 100-Mikroliter-Kultur mit kompetenten Zellen aus Agrobacterium tumefaciens.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis. Dann frieren Sie die Zellen eine Minute lang in flüssigem Stickstoff ein. Anschließend erwärmen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 28 Grad Celsius und geben dann einen Milliliter LB-Medium in die zuständige Zellmischung.

Nach der Zugabe des LB-Mediums stellen Sie die Zellen für zwei Stunden wieder bei 28 Grad Celsius ein. Als nächstes drehen Sie die Zellen eine Minute lang mit dem 3.000-fachen G herunter. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,2 Millilitern LB-Medium und plattieren Sie es auf antibiotikaselektive LB-Agarplatten.

Züchten Sie die Zellen auf den Platten bei 28 Grad Celsius für 48 Stunden, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Dann werden mehrere einzelne Kolonien entnommen und auf frische LB-Agarplatten aufgefüllt und die Zellen 48 Stunden lang bei 28 Grad Celsius gezüchtet. Nehmen Sie als Nächstes eine kleine Menge Bakterien aus jeder Platte zur Analyse und verwenden Sie die Kolonie-PCR, um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte von Interesse zu bestätigen.

Jede Agrobacterium-Kolonie mit dem interessierenden Konstrukt wird zu fünf Millilitern LB-Medium hinzugefügt, das mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt wird. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 28 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 3.000 G.Resuspendieren Sie das Pellet auf einen OD600 von 0,5 in Agroinfiltrationspuffer.

Inkubieren Sie die Suspension zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und füllen Sie dann das Inokulum in eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze. Halten Sie ein voll ausgereiftes N.Benthamiana-Blatt mit einem behandschuhten Finger auf die adaxiale Fläche und drücken Sie die Düse der Spritze gegen die untere Epidermis des Blattes. Führen Sie dann das Agrobakterium langsam in das Infiltrationsmedium ein, indem Sie das Medium injizieren.

Pflegen Sie die infiltrierte Pflanze, bis sie zu beobachten ist. Schneide jedes Blatt 24 bis 48 Stunden nach der Infiltration mit einer Klinge zwischen den Adern in Fragmente. Legen Sie die Blattscheiben mit der abaxialen Blattfläche nach oben auf die Objektschiene.

Geben Sie dann einen Tropfen Wasser auf die Blattscheibe und bedecken Sie sie mit dem Deckglas. Immobilisieren Sie das Deckglas mit kleinen Klebebandstücken auf jeder Seite. Übertragen Sie einen Objektträger unter ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop und verwenden Sie eine 10-fache subjektive Linse, um Zellen mit dem besten Signal zu identifizieren.

Verwenden Sie dann ein subjektives 63-fach-Objektiv, um Bilder für detailliertere Beobachtungen aufzunehmen. Verwenden Sie außerdem die entsprechenden Fluoreszenzen, um die exprimierten fluoreszierenden Proteine anzuregen. Behalten Sie alle Einstellungen bei, die für die Bildaufnahme verwendet werden, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu wahren.

Untersuchen Sie durchschnittlich 100 bis 120 Zellen für jede Versuchsbedingung. Diagnostizieren Sie die Lokalisation der getesteten Proteine anhand der konfokalen Mikroskopbilder. Diese Bilder veranschaulichen die charakteristischen peripheren punktförmigen Plasmodesmata-Lokalisationsmuster, die für das TMV-Bewegungsprotein in voller Länge beobachtet wurden, das mit dem Frachtmolekül CFP fusioniert ist, und für das identifizierte Plasmodesmata-Lokalisationssignal, das mit CFP fusioniert ist, sowie für das co-exprimierte Plasmodesmata-Lokalisationsprotein PDCB1, das an DsRed fusioniert ist.

Unter Kontrollbedingungen erscheint das Plasmodesmen-Targeting des TMV-Bewegungsproteins in voller Länge, das mit CFP fusioniert ist, und das Lokalisationssignal im TMV-Bewegungsprotein, das mit CFP fusioniert ist, wie hier gezeigt, mit subzellulärer Lokalisation von CFP und nukleozytoplasmatischer Lokalisation des Markers DsRed2. Wenn die vierte Aminosäure, Valin, zu Alanin mutiert ist, geht das Plasmodesmen-Targeting, das sowohl auf das TMV-Bewegungsprotein in voller Länge als auch auf das identifizierte Lokalisationssignal im TMV-Bewegungsprotein abzielt, verloren. Dies deutet darauf hin, dass dieser Rest für die Signalstruktur oder -funktion der Plasmodesmata wichtig ist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 50 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Pflanzen in einem sehr gesunden Zustand sind und sich die Pflanzen im richtigen Blattstadium befinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nicht nur ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Signal des Plasmodesmata-Lokalisierungsproteins identifiziert, sondern auch, wie man andere bestimmte Signale in Pflanzenproteinen identifiziert.