Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Quarz-Objektträgeroberfläche von höchster Qualität zu erhalten. Dies wird erreicht, indem gebohrte Quarzdias und Deckgläser zunächst mit Wasser und Aceton gereinigt werden. Dann wird der Objektträger mit Kaliumhydroxid und der Piranha-Lösung geätzt, um die Qualität der Oberfläche zu verbessern.

Als nächstes werden die Objektträger und Deckgläser mit Amingruppen funktionalisiert, gefolgt von zwei Runden der Oberflächenbehandlung unter Verwendung eines Polymers, um die Glasoberfläche inert zu machen. Der letzte Schritt besteht darin, die mikrofluidische Kammer aus dem Objektträger und dem Deckglas zusammenzubauen, wobei sich die mit Polyethylenglykol beschichteten oder pegylierten Oberflächen gegenüberstehen. Letztendlich verbessert eine neue Strategie, bei der die Oberfläche über zwei Runden mit Peg-Molekülen behandelt wird, die Qualität der Passivierung, wie sie bei der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wird, erheblich.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder der bestehenden Techniken wie der Polymerbeschichtung nach dem Kaliumoxidätzen besteht darin, dass diese Technik eine überlegene Qualität garantiert. Menschen, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da mehrere Servicebehandlungen durchgeführt werden müssen. Um mit dem Bohren zu beginnen, gleitet der Quarz, wie im Textprotokoll beschrieben.

Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie sie in ein Glasfärbeglas legen. In der Regel können fünf bis 15 Objektträger in einem einzigen Glas platziert werden. Spülen Sie dann die Objektträger nach dreimaligem Spülen mit UE-Wasser ab, beschallen Sie die Objektträger fünf Minuten lang mit UE-Wasser, um Schmutz zu entfernen, entsorgen Sie das Wasser und spülen Sie die Objektträger drei weitere Male mit UE-Wasser ab.

Ersetzen Sie anschließend das UE-Wasser durch Aceton und beschallen Sie die Objektträger 20 Minuten oder länger mit Aceton, entsorgen Sie das Aceton und spülen Sie die Objektträger mit Milli Q-Wasser ab, um alle Acetonrückstände zu entfernen. Ersetzen Sie anschließend das Wasser durch ein molares Kaliumhydroxid und beschallen Sie die Objektträger 20 Minuten oder länger lang. Übermäßiges Ätzen verbessert die Qualität der Oberfläche, führt jedoch zu Kratzern, die die Fluoreszenzbildgebung beeinträchtigen können.

Spülen Sie die Objektträger dreimal mit Milli Q Wasser ab, um Spuren von Kaliumhydroxid zu entfernen und Piranhas zu ätzen. Übertragen Sie die Objektträger auf einen Duran-Objektträgerhalter oder einen speziell angefertigten Teflonhalter und legen Sie sie in ein Ein-Liter-Becherglas, das sich in einer chemischen Haube befindet. Füllen Sie das Becherglas mit 450 Millilitern Schwefelsäure.

Fügen Sie dann 150 Milliliter Wasserstoffperoxid hinzu, um ein Verhältnis von drei zu eins zwischen Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid zu erhalten. Rühren Sie die Lösung um, um sie richtig zu mischen, und lassen Sie das Becherglas 20 Minuten lang ungestört. Nehmen Sie die Objektträger aus der Piranha-Lösung und legen Sie sie in einen Objektträgerhalter mit Millieu-Wasser.

In der Zwischenzeit die Piranha-Lösung in eine dafür vorgesehene Abfallflasche werfen. Sobald sie Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie die Objektträger nach der Reinigung des Deckglases dreimal mit UE-Wasser ab. Ersetzen Sie das UE-Wasser in den Färbeschalen durch Methanol. Bewahren Sie die Objektträger und die Deckgläser in Methanol auf.

In der Zwischenzeit bereiten Sie die Aminoinsellösung vor, indem Sie 100 Milliliter Methanol in den Kolben gießen. Fügen Sie dann fünf Milliliter Essigsäure und drei Milliliter drei Aminopropyl, Trimethyl hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Schütteln. Ersetzen Sie das Methanol in den Färbeschalen, die die Objektträger und die Deckgläser enthalten, durch das Aminosiloisierungsreaktionsgemisch.

20 bis 30 Minuten inkubieren, während der Inkubation einmal eine Minute lang beschallen. Ersetzen Sie als Nächstes die Aminoinselreaktion durch Methanol. Entsorgen Sie dann das Methanol und fügen Sie eine frische Methanollösung hinzu.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die erste Runde der Oberflächenbehandlung. Trocknen Sie die Objektträger und die Deckgläser zuerst mit Polymer mit Stickstoffgas. Legen Sie sie dann in saubere Pipettenboxen, die teilweise mit Milli Q Wasser gefüllt sind, so dass die Seite, die pegyliert werden muss, nach oben zeigt. Geben Sie anschließend 64 Mikroliter des frisch zubereiteten Reaktionspuffers in eine vorbereitete Peg-Lösung.

Pipettieren Sie die Mischung auf und ab, um sie vollständig aufzulösen. Dann eine Minute lang bei 16.100 g zentrifugieren. Um Luftblasen zu entfernen, geben Sie 70 Mikroliter der Pegylierungsmischung auf einen getrockneten Quarzobjektträger.

Legen Sie vorsichtig ein getrocknetes Deckglas über die Lösung, inkubieren Sie die Objektträger in einer dunklen und feuchten Umgebung zwei Stunden lang bis über Nacht, um die pegylierten Objektträger und Deckgläser aufzubewahren. Zerlegen Sie die Rutsche und den Deckglas vorsichtig, indem Sie die Deckfolie zur Seite schieben und mit UE-Wasser abspülen, bevor Sie sie mit Stickstoffgas trocknen. Legen Sie ein Paar Objektträger und Deckglas so in ein 50-Milliliter-Röhrchen, dass die pegylierten Oberflächen voneinander abgewandt sind.

Schließen Sie das Röhrchen teilweise und saugen Sie es ab, bevor Sie es mit Stickstoffgas füllen und den Deckel fest verschrauben. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Diese Schritte tragen dazu bei, die pegylierte Oberfläche über einen langen Zeitraum zu erhalten.

Führen Sie eine zweite Pegylierungsrunde durch, wie im Textprotokoll beschrieben, unmittelbar bevor Sie den Objektträger zum Zusammenbau einer mikrofluidischen Kammer verwenden. Legen Sie einen Quarzobjektträger mit der pegylierten Seite nach oben auf eine ebene Fläche. Mache diagonal einen Kanal auf der pegylierten Oberfläche, indem du doppelseitiges Klebeband über die Folie legst.

Stellen Sie sicher, dass sich die Löcher in der Mitte des Kanals befinden. Legen Sie dann vorsichtig einen pegylierten Deckslip darauf, um die Kammer zu vervollständigen. Mit der pegylierten Seite nach unten.

Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie den Deckzettel über die Bereiche drücken, an denen das doppelseitige Klebeband platziert ist. Tun Sie dies vorsichtig, aber gründlich, damit die Kammer wasserdicht wird. Zum Schluss verschließen Sie die Ränder der Kammer mit Epoxidkleber.

Fahren Sie fort, Streptavidin oder Neut-Travain zu immobilisieren und biotinylierte biologische Moleküle für die Einzelmolekülbildgebung hinzuzufügen, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn die Oberflächenbehandlung erfolgreich durchgeführt wurde, gibt es weniger als 10 unspezifisch absorbierte Proteine pro beobachtetem Bildgebungsbereich. Wenn ein bis 10 nanomolare fluoreszenzmarkierte Proteine in die Kammer gegeben werden, wenn einer der Reinigungs- oder Reaktionsschritte nicht ordnungsgemäß durchgeführt wurde, nimmt die Anzahl der unspezifisch absorbierten Proteine signifikant zu. Wenn zum Beispiel die Piranha-Ätzung übersprungen wird, wird eine 100-mal höhere unspezifische Absorption beobachtet.

Die überlegene Natur der Doppelpegylierung wird hier deutlich gezeigt. Es wurde beobachtet, dass die Hintergrundsignale von fluoreszierenden Molekülen und Lösungen viel schwächer waren, wenn die doppelte Pegylierung verwendet wurde, wie in der linken Abbildung gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Proteine durch die doppelt pegylierte Schicht effektiver abgestoßen werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit AYA äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie geeignete Handschuhe, Schutzbrillen und Schürze sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.