Name: Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Oberflächenpassivierung von Glas mit zweistufiger PEG-Beschichtung für Einzelmolekül-Studien. Dieses Protokoll reduziert unspezifische Bindungen und verbessert die Fluoreszenzmikroskopie.

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DEZA, ACH, und CJ wurden durch Starting Grants (ERC StG--2012-309509) durch den European Research Council unterstützt. J.-MN wurde von der National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) Korea unterstützt; und der Pioneer Research Center Programm (2012-009586) durch die NRF Koreas durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (MSIP) finanziert. Diese Arbeit wurde auch von Zentrum für Gesundheit BioNano-Guard von MSIP Korea als Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) gefördert unterstützt. YKL und J.-HH wurden von der Seoul Wissenschaft Fellowship Program der Stadt Seoul, Korea unterstützt. Das markierte Rep-Protein war ein großzügiges Geschenk von Dr. Sua Myong.

1. Schieben Vorbereitung und Reinigung Mikrofluidkammer aus einem Quarz-Objektträger und einem Deckglas besteht. Prismenartigen inneren Totalreflexion (TIRF)-Mikroskopie, wird die Oberfläche des Objektträgers abgebildet. Daher ist es wichtig, eine Quarz-Objektträger gründlich mit H 2 O, Aceton, KOH und Piranha-Lösung gereinigt werden. Th mehrstufige Reinigung beseitigt fluoreszierenden organischen Molekülen auf einer Oberfläche, die mit Einzelmolekülfluoreszenzmessungen beeinträchtigen. Darüber hinaus macht der Piranha Ätzen der Quarzoberfläche hydrophil durch Erzeugung Hydroxylgruppen. Die freien Hydroxylgruppen sind für die Amino-Silanisierung Reaktion in Schritt 3. <ol><li> Bohren Quarz Rutschen. Bohren Sie ein Paar Löcher in eine Quarz-Objektträger mit einer 3/4 mm Diamantbohrer (Abbildung 2a). Wenn mehrere Kanäle gewünscht werden, bohren mehr pairs von Löchern (Abbildung 2b). Diese Löcher sind zum Einspritzen von Lösungen in einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7 verwendet. <ol><li> Halten Sie den Bohrer nass in H 2 O während des Bohrens. H 2 O führt als Schmiermittel, wodurch die Lebensdauer des Bohrers erhöht. </li><li> Gelegentliche Wischen Sie die Spitze des Bohrers hilft Bohren von Löchern. </li><li> Nach dem Bohren, Markieren einer Seite der Folie zur einfachen Identifizierung während der PEGylierung Prozess. Die Marker können als Referenz verwendet werden, um spätere Verwirrung zu vermeiden. Zur Kennzeichnung kann ein Diamant-Bohrer verwendet werden. Verwenden Sie keine Kugelschreiber da die Tinte könnte auf der Oberfläche zu erhalten. </li></ol></li><li> Reinigung mit H 2 O. Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O. Spülen Sie die Folien Wiederholen Sie es 3 Mal und beschallen die Folien mit MilliQ H 2 O für 5 Minuten, um Schmutz zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und spülen Sie die Folien wieder 3 mal mitMilliQ H 2 O. Hinweis, dass 130 W ist die Beschallungsleistung für dieses Protokoll verwendet. Höhere Beschallungsleistung könnte die Lebensdauer der Quarz-Objektträger zu verringern. </li><li> Reinigung mit Aceton. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O mit Aceton. Beschallen Sie die Folien mit Aceton für 20 Minuten oder länger. </li><li> Spülen mit H 2 O. Entsorgen Sie die Aceton und spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O. Wiederholung für 3-mal, um jegliche Rückstände zu entfernen Aceton. </li><li> Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Übermäßige Ätzen (z. B. über Nacht KOH-Behandlung) wird die Qualität der Oberfläche zu verbessern, wird aber Kratzer, die mit Fluoreszenz-Bildgebung stören könnten einzuführen. </li><li> Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O 3-mal, um Spuren von KOH zu entfernen. </li><li> Piranha Ätzen. <ol><li> Die Objektträger in eine Duran Trägerhalter oder einem maßgeschneiderten Teflon Halter und place sie in einen Becher (1 L), die in einer chemischen Haube befindet. </li><li> Das Becherglas wird mit 450 ml H 2 SO 4. </li><li> Mit 150 ml H 2 O 2 für 3:1-Verhältnis zwischen H 2 SO 4 und H 2 O 2. Sobald die Lösung beginnt zu sieden spontan erhöht über 90 ° C die Temperatur Sicherstellen, dass die H 2 O 2-Lösung bei Raumtemperatur vor dem Starten der Reaktion. Ansonsten kann die Temperatur der siedenden Lösung niedriger als 90 ° C sein </li><li> Rühren Sie die Lösung für die richtige Mischung und lassen Sie das Becherglas ungestört für 20 min. </li><li> Nehmen Sie die Folien aus dem Piranha-Lösung zusammen mit dem Trägerhalter, und steckte sie in einen Objektträgerhalter enthält MilliQ H 2 O. Unterdessen werfen Sie die Piranha-Lösung in einem bestimmten Abfallflasche, wenn es Zimmertemperatur erreicht. </li><li> Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Folien 3 mal Besondere Sorgfalt sollte in weiteren ste genommen werdenps, um jede mögliche Verunreinigung der Folien zu vermeiden. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. Es wird empfohlen, sofort mit den folgenden Schritten fortfahren. * Achtung: Das Piranha-Lösung ist äußerst reaktiv. Beim Umgang mit dieser Lösung sollte besondere Vorsicht eingenommen werden. Darüber hinaus, wenn aus Versehen mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton vermischt, kann es zu einer Explosion führen. </li></ol></li></ol> 2. Coverslip Reinigung Ein mikrofluidischen Kammer besteht aus einem Quarz-Objektträger und eine Abdeckung s Lippe zusammen. Wenn ein TIRF-Mikroskop Prismentyp verwendet wird, wird die Oberfläche eines Deckglases nicht abgebildet. Daher ist es ausreichend, ein Deckglas nur mit H 2 O und KOH reinigen. Im Falle muss ein Deckglas abgebildet werden (zB über das Ziel-Typ-TIRF-Mikroskopie), empfiehlt es sich, die Deckgläser mit Piranha-Lösung (Schritt 1.7) zu behandeln. Beachten Sie, dass, wenn PEGylation der Deckfläche ist nicht von hoher Qualität, könnte es als Senke für Proteine ​​wirken eind zu Schwankungen in der Proteinkonzentration zu ergeben. <ol><li> Spülen mit H 2 O. Platz Deckgläsern (24 x 30, 24 x 40 oder 24 x 50 mm 2) in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 Deckgläser in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Deckgläser 3 mal </li><li> Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Deckgläser für 20 Minuten oder länger. </li><li> Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Deckgläschen 3 mal mit MilliQ H 2 O, um Spuren von KOH zu entfernen. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Amino-Silanisierung von Folien und Deckgläser Funktionalisieren der Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser mit Amingruppe über die Amino-Silanisierung Chemie. Methanol wird als Lösungsmittel und Essigsäure als Katalysator für die Amino-Silanisierung Reaktion verwendet. <ol><li> Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O in der Färbung Gerichte (ab STEPs 1 und 2) mit Methanol. Halten Sie die Folien und die Deckgläser in Methanol bis Schritt 3.3. Da Verunreinigungen in Methanol die Folien und die Deckgläser in Methanol für eine unnötig lange Zeit (zB mehrere Stunden) lagern an die Oberfläche zu adsorbieren. </li><li> Vorbereiten Amino-Silanisierung Lösung. <ol><li> Ein Pyrex-Kolben mehrmals mit Methanol spülen. Beschallen der Kolben mit Methanol für 5 min oder länger. Es wird empfohlen, einen dedizierten Kolben, die sauber gehalten wird, zu haben. </li><li> Werden 100 ml Methanol in den Kolben. </li><li> 5 ml Essigsäure. </li><li> 3 ml APTES (3-Aminopropyltrimethoxysilan) und vorsichtig durch Schütteln. </li></ol></li><li> Amino-Silanisierung. Ersetzen Sie das Methanol in den Gerichten, die Färbung der Objektträger und Deckgläser mit dem Aminosilanisierung Reaktionsgemisch enthalten. <ol><li> Inkubation für 20-30 min. Während der Inkubation beschallen einmal für 1 min. </li></ol></li><li> Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die eineminosilanization Reaktion mit Methanol. Entsorgen Sie die Methanol und fügen Sie eine neue Methanollösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li></ol> 4. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (Die erste Runde) Passivieren der Amin-beschichtete Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser durch Konjugation von NHS-Ester Polyethylenglykol (PEG). Diese Reaktion wird mit der Sättigungskonzentration der PEG-Lösung bei pH 8,5 über Nacht durchgeführt. <ol><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Trocknen der Objektträger und Deckgläser unter Verwendung von N 2-Gas und sie in saubere Pipettenkästen in einer Weise, dass die Seite, die zu sein PEGylierten nach oben weist. Die Pipette Feld ist teilweise mit MilliQ H 2 O gefüllt Dies verhindert, dass feuchte Umgebung PEGylation Lösung vor dem Austrocknen während der Inkubation über Nacht. </li><li> Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5) durch Auflösen von 84 mg Natriumbicarbonat in 10 mlMilliQ H 2 O. Es besteht keine Notwendigkeit der Einstellung des pH. Diese Lösung kann für den nächsten Einsatz (zB Step 6.1) eingefroren gelagert werden. </li><li> Vorbereiten PEGylation Lösung. <ol><li> Vorbereitung einer Mischung von PEG 0,2 mg biotinylierte PEG-NHS-Ester (5.000 Da) und 8 13 mg NHS-Ester von mPEG (5.000 Da) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Bei der Herstellung einer Anzahl N von Folien herzustellen N-fache Menge der PEG-Mischung in einem einzigen Rohr. </li><li> Add 64 ul (oder N mal 64 &amp;mgr; l für eine Anzahl N von Folien) des frisch hergestellten Puffer (Schritt 4.2). Pipettieren Sie es auf und ab, um sie vollständig zu lösen. </li><li> Zentrifugieren mit 16.100 × g für 1 min, um Luftblasen zu entfernen. Danach pipettieren. Andernfalls wird Luftblasen bilden, die mit PEGylation stören bei Schritt 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Tropfen 70 ul der PEGylierung Mischung auf eine getrocknete Folie aus Quarz Schritt 4.1. Verwenden Sie 90 ul bei 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Sanft statt eines getrockneten Deckglas aus Schritt 4.1 über die Lösung. </li><li> Um eine einheitliche und hohe Qualität der PEGylation haben, kümmern sich nicht um Luftblasen einzuführen. Aufgrund der Oberflächenspannung, die meisten der Luftbläschen spontan verlassen das Reaktionsvolumen innerhalb von fünf Minuten aufgrund der Oberflächenspannung. </li><li> Die Folien Inkubation in einem dunklen und feuchten Umgebung. Die Halbwertszeit von NHS-Ester PEG, die wir verwenden bei pH 8 ist etwa eine Stunde. Zumindest inkubieren für 2 Stunden. Inkubation über Nacht führt zu höherer Qualität der PEGylierung (Daten nicht gezeigt). </li></ol></li></ol> 5. Langzeitlagerung Speichern der PEGyliertem Rutschen und Deckgläser in N 2 bei -20 º C. <ol><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Die Rutsche und das Deckglas vorsichtig zerlegen, indem das Deckglas zu einer Seite, spülen sie mit MilliQ H 2 O, und trocknen Sie sie mit N 2. </li><li> Speichern von Dias und Deckgläser. For den sofortigen Einsatz, folgen Sie den Vorgang für die zweite Runde der PEGylation (Schritt 6). Um für einen längeren Zeitraum zu speichern, befolgen Sie die nächsten Schritte. <ol><li> Legen ein Paar von dem Schieber und dem Deckglas in einem 50 ml-Röhrchen, so dass die PEGylierte Flächen abgewandten zueinander. </li><li> Teilweise schließen die Röhre, Vakuum der Röhre, und füllen Sie es mit N 2. Diese Schritte helfen Erhaltung der PEGylierten Fläche für einen langen Zeitraum. Schrauben Sie den Schlauch fest und bewahren Sie sie bei -20 ° C Die Qualität der Folien bleibt gut für bis zu 3 Monate (Abbildung 3, rechts). </li></ol></li></ol> 6. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (der zweiten Runde) Weitere Runde der PEGylation die PEG-Schicht dichter zu machen und auch, um alle verbleibenden Aminogruppen auf der Oberfläche zu stillen. Der Einsatz von Kurz NHS-Ester PEG-Moleküle (333 Da) wirksam bei der Durchdringung in eine bestehende PEG-Schicht sein. Es ist recfohlen, diese zweite Runde der PEGylation rechts, bevor Sie eine Diashow zu tun. <ol><li> Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5). Die gefrorene Lösung aus Schritt 4.2 können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Vorbereiten PEGylation Lösung. Auflösen 7 ul 250 mM MS4-PEG in 63 ul des Natriumbicarbonat-Puffer. </li><li> PEGylation. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 4.4. Inkubation für 30 Minuten bis zu über Nacht. </li><li> Trocknen Rutschen und Deckgläser. Demontieren Sie das Paar der Folie und das Deckglas, spülen sie mit MilliQ H 2 O, trocknen Sie sie mit N 2, und bewahren Sie sie an einem sauberen Pipette-Box. Gehen Sie zur Montage einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7. </li></ol> 7. Montage eines Mikrofluidik-Kammer Montage einer mikrofluidischen Kammer mit einem Paar aus einer PEG Quarz-Objektträger und Deckglas auflegen. Doppelseitiges Klebeband wird als Abstandshalter verwendet. Die Kammer ist mit Epoxy Klebstoff abgedichtet und soLösungen werden durch die Löcher in dem Quarz-Objektträger eingebracht. <ol><li> Legen Sie eine Quarz-Objektträger auf einer ebenen Fläche mit pegylierten Seite nach oben. </li><li> Einen Kanal (Breite 5 bis 7 mm) schräg auf die Oberfläche PEGylierten indem doppelseitige Klebebänder über den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Löcher in der Mitte des Kanals positioniert ist. Achten Sie darauf, das pegylierte Oberfläche während des Prozesses der Herstellung eine Kammer zu verwöhnen. Es ist möglich, eine Multi-Channel-Rutsche und das Festhalten, indem die doppelseitigen Klebebänder unterschiedlich (siehe Abbildung 2) zu machen. </li><li> Sanft statt eine PEG Deckglas auf, um die Kammer zu vervollständigen. Das mit PEG Seite sollte nach unten. </li><li> Verschließen Sie die Kammer, indem Sie die Deckglas über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Tun Sie es sanft, aber gründlich, so dass die Kammer wird wasserdicht versiegelt. </li><li> Schließen die Kanten der Kammer mit Epoxy Klebstoff. </li><li> Immobilisieren Streptavidin oder Neutravidin auf diebiotinylierten PEG-Schicht durch Zugabe von 50 ul 0,1 mg / ml Streptavidin oder Neutravidin Lösung in T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl-Puffer) unter Verwendung einer Pipette p200. Nach 1 min Inkubation bündig mit 100 ul Puffer T50. </li><li> In biotinylierten biologischen Molekülen für Einzelmolekül-Imaging. </li></ol> 8. Schieben Recycling Recycling Quarz Rutschen. Gebrauchte Folien werden durch Abnehmen der Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder recycelt. <ol><li> Nach Gebrauch speichern die Kammern in Leitungswasser. Langzeit-Inkubation in Wasser erleichtert die Demontage der Kammern. </li><li> Kochen Sie die Kammern in Leitungswasser mit Hilfe einer Mikrowelle. Verwenden Sie ein Pyrex-Becher. Kochen Sie für 10 Minuten oder länger. </li><li> Nehmen Sie die Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder mit einer Rasierklinge. Sie drücken eine Quarz-Objektträger nicht senkrecht zu ihrer Ebene. Andernfalls bricht es. Halten Sie die Rasierklinge aus dem Kanal. Otchts, sonst führt sie Kratzer auf dem Kanal. </li><li> Spülen Sie die Folien mit einem Haushaltsreinigungsmittel durch Reiben mit den Fingern. </li><li> Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. In 10% Haushaltsreiniger und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Mit einer großen Menge Wasser abspülen Registerkarte Folien. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.2. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls Es ist wichtig, die Oberfläche hydrophil vor dem Amino-Silanisierungsreaktion machen. Dies wurde durch die Piranhas Radierung, die die freien Hydroxylgruppen an einem Glas / Quarz-Oberfläche erzeugt erreicht. Es wird empfohlen, den Piranha geätzte Oberfläche auf H 2 O oder Luft für eine lange Zeit, da die Hydrophilie der Oberfläche ausgesetzt zu halten und nach unten geht. Der NHS-Ester-PEG-Molekülen reaktiv sind. Es wird empfohlen, Teilmengen zu machen und in -20 ° C lagern sie unter Stickstoff Die Haltbarkeit der chemischen APTES bei Raumtemperatur gering ist. Es wird empfohlen, ihn durch einen neuen zu ersetzen jeden Monat. Modifikationen dieses Protokolls Wenn Sie nicht mit dem Piranha-Ätzen für jede praktische Vernunft, können Sie Ätzen mit KOH für einen längeren Zeitraum (z. B. overnight), die auch machen wird Hydroxylgruppen ausgesetzt. Die Falle dieses alternativen Ansatzes ist, dass der Schieber wird nach ein paar Rückführungen aufgrund der schweren Kratzer unbrauchbar. Es wird oft praktiziert, um ein Glas / Quarz-Oberfläche brennen Propan Fackel, die wirksam bei der Beseitigung fluoreszierenden organischen Materialien 7 ist. Dieses Verfahren wurde in diesem Protokoll enthalten, weil sie redundant Piranha Ätzen ist. Beachten Sie, dass diese Prozedur möglicherweise eine Oxidation der Hydroxylgruppen führen. Daher sollte dieses Verfahren nicht durchgeführt werden, wenn eine Oberfläche wurde unter Verwendung von KOH oder Piranha-Lösung geätzt. Wenn ein Puffer mit pH-Wert unter 7 zur Einzelmolekül-Imaging verwendet, die Konformation ändert sich von PEG &quot;Pilz&quot; auf &quot;Bürste&quot;, der den Grad der Passivierung. Deshalb, wenn pH-Wert unter 7,0 verwendet wird, empfiehlt es sich, die Oberfläche mit Disuccinimidylester Tartarat &lt;weiter zu passivierensup&gt; 7. Perspektiven Diese Arbeit hat ein robustes Protokoll für die Erreichung hoher Qualität Oberflächenpassivierung Verfügung gestellt. Dieses Protokoll wird nützlich für Einzelmolekül-Fluoreszenz-Studien, die mit Proteinen 14 sowie Protein-Komplexe im Zellextrakten immunpräzipitiert beteiligt sind und 15 sein. Es wird häufig für andere Einzelmolekültechniken wie Kraft-und Drehmoment-Spektroskopie Spektroskopie 16 verwendet werden. Es wird auch zur Verhinderung von Adsorption von Zellen an eine Oberfläche 17 sein. Die in dieser Arbeit vorgesehenen Protokoll verlangt für seine Multi-Schritt-Verfahren. Oberflächenpassivierung mit Lipid-PEG 8 und Poly-Lysin-PEG-9 als Alternative zur Verfügung. Da sie keine chemischen Reaktionen ist es einfach zu implementieren erfordern. , Ist der Grad der Passivierung jedoch nicht so hoch wie die durch chemische modif erreichtication einer Oberfläche.

Bei der Durchführung einer Einzel-Molekül-Protein-Studie ist es wichtig, eine hohe Qualität der Passivierung zu erreichen, so dass das Experiment ist frei von jeder Oberfläche-induzierten Proteinfehlfunktion oder Denaturierung 1,2. Während eine Glasoberfläche mit Tensiden, wie Rinderserumalbumin, wird allgemein für Einzelmolekül Nukleinsäure Studien 3 verwendet wird, ist der Grad der Passivierung nicht hoch genug für Proteinstudien. Eine Glasoberfläche mit Polymer (Polyethylenglykol, PEG) beschichtet ist, ist in der Passivierung Leistung 4-6 überlegen. Dabei hat es sich für Einzel-Molekül-Protein-Studien allgemein verwendete, seit es zu einem Einzelmolekül-Fluoreszenz-Studie 10.7 eingeführt wurde. Die Polymerbeschichtung Verfahren mehrere Oberflächenbehandlungen 7,11,12. Daher ist es schwierig, die ganze Prozedur ohne detaillierte Anweisungen zu befolgen. Oft ist der Grad der Oberflächenpassivierung variiert je nachdem, welches Protokoll is gefolgt. Hier präsentieren wir eine robuste Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen, die eine der wichtigsten Engpässe von Einzelmolekül-Proteinstudien entfernen wird. Siehe Abbildung 1 für Übersicht.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Objektträgervorbereitung und -reinigung</stark></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 &nbsp;( No.1&frac12;, Rechteckig)</td></tr><tr><td>Diamantbohrer</td><td>MTN-Giethoorn, Niederlande</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duran Diahalter</td><td>LGS, Niederlande</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>Glasfärbeschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Ausleger</td><td>6233905</td><td>1 L, Wasserstoffperoxid 30 % Geöffnete Flaschen sollten bei 4 °C gelagert werden.</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Ausleger</td><td>80900627.9010</td><td>Schwefelsäure 95-98%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Kaliumhydroxid</td></tr><tr><td>Methanol Sigma</td><td></td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson</td><td></td><td>Tisch-Ultraschallreiniger, 3510</td></tr><tr><td>Quarz-Objektträger</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1" x 3", 1 mm dick</td></tr><tr><td colspan="4">2. Deckglasreinigung</td></tr><tr><td>Duran Objektträgerhalter</td><td>LGS, Niederlande</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Kaliumhydroxid</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson</td><td></td><td>Tischultraschallreiniger, 3510<</td></tr><tr>td colspan="4">3. Aminosilanisierung von Objektträgern und Deckgläsern</stark></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>Essigsäure, eiszeitlich</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-Aminopropyltrimethoxysilan. Bei Raumtemperatur unter N2 lagern. Einmal im Monat austauschen.</td></tr><tr><td>Kolben (200 ml)</td><td>VWR</td><td>Kolben (200 ml)</td><td>Pyrex-Kolben. Ein Kolben ist für die Aminosilanisierung vorgesehen.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson</td><td></td><td>Tisch-Ultraschallreiniger, 3510<</td></tr><tr>td colspan="4">4. Oberflächenpassivierung mit Polymer (die erste Runde)</stark></td></tr><tr><td>Biotin-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5.000&nbsp;Da. Aliquots von 1-2 mg (ausreichend für 10 Objektträger) bei -20 &/de; C unter N2.</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-Succinimidylvalerat (SVA), MW 5.000 Da. Aliquots von 80 mg (ausreichend für 10 Objektträger) bei -20 &de; C unter N2.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Oberflächenpassivierung (die zweite Runde)</stark></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Dimethylsulfoxid BioReagenz, für die Molekularbiologie, &ge; 99,9%</td></tr><tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>Disuccinimidyltartarat</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. 100 mg MS4-PEG in 1,1 ml DMSO auflösen. Store 20 & Mikro; l aliquotiert bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Montage einer mikrofluidischen Kammer</td></tr><tr><td>Doppelklebeband</td><td>Scotch</td><td></td><td>10 mm breit</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 Minuten Epoxy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding Protein. Vorrat in 5 mg/ml in H2O bei 4 &°C.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>Bestand 5 mg/ml in H2O oder T50 bei 4 μC.</td></tr><tr><td>Trizma Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

oberflächenpassivierung für einzelmolekül-protein studies

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Spektroskopie hat sich maßgeblich an Verständnis einer Vielzahl von biologischen Phänomene auf der Nanoskala zu sein. Wichtige Beispiele für das, was diese Technik zu biologischen Wissenschaften ergeben sind die mechanistische Erkenntnisse über Protein-Protein-und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Wenn Interaktionen von Proteinen auf Einzelmolekülebene untersucht werden die Proteine ​​oder ihre Substrate oft auf einer Glasoberfläche, die für eine Langzeitbeobachtung ermöglicht immobilisiert. Diese Immobilisierung Schema kann unerwünschte Oberflächenartefakten führen. Daher ist es wichtig, die Glasoberfläche zu passivieren, es inert zu machen. Oberflächenbeschichtung Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) zeichnet sich durch seine hohe Leistung bei der Verhinderung von Proteinen aus nicht-spezifisch mit einer Glasoberfläche interagieren. Jedoch ist das Polymer-Beschichtungsverfahren schwierig, aufgrund der Komplikation, die sich aus einer Reihe von Oberflächenbehandlungen und die strenge Anforderung, dass eine Oberfläche musswird am Ende des Verfahrens frei von fluoreszierenden Molekülen. Hier bieten wir eine robuste Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Es umfasst Oberflächenreinigung einschließlich Piranha Radierung, Funktionalisierung von Oberflächen mit Amingruppen und schließlich PEG Beschichtung. Um eine hohe Dichte eines PEG-Schicht zu erhalten, führen wir eine neue Strategie zur Behandlung der Oberfläche mit PEG-Molekülen mit zwei Umläufen, die merklich die Qualität der Passivierung verbessert. Wir stellen repräsentative Ergebnisse sowie praktische Tipps für jeden kritischen Schritt, so dass jeder die hohe Qualität Oberflächenpassivierung erreichen können.

Nach der mikrofluidischen Kammeranordnung (Schritt 7,1 bis 7,6) und vor der Durchführung von Schritt 7.7, ist es ratsam, für die Durchführung der Qualitätskontrolle der PEG Oberfläche. Wenn die Oberflächenpassivierung erfolgreich durchgeführt wurde, gibt es weniger als 10 nicht-spezifisch adsorbierte Proteine ​​pro Abbildungsfläche (25 mm x 25 mm) beobachtet, wenn 1-10 nM fluoreszenzmarkierten Proteins (Abbildung 3, links) in die Kammer gegeben. Wenn eine der Reinigungs-oder Reaktionsschritte nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, adsorbiert die Anzahl der nicht-spezifisch Proteine ​​erhöht, und der CCD-Schirm kann durch Fluoreszenzsignale gesättigt. Zum Beispiel, wenn der Piranha Ätzen übersprungen wird, gibt es 100 Mal eine größere Menge der beobachteten unspezifischen Adsorption (Fig. 3a, mit der mittleren linken vergleichen). Wenn die zweite PEGylation Schritt wird übersprungen, es war ungefähr 3 maleinen größeren Menge an nicht-spezifischer Adsorption beobachtet werden (Abbildung 3b). Ein niedriger Grad der PEGylierung beobachtet, wenn abgelaufen Chemikalien (zB APTES bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert) werden (Daten nicht gezeigt). Die Qualität der Oberfläche fällt auch ab, wenn eine erhebliche Menge an Zeit vergangen, seit es war PEGyliertem geben (Abbildung 3a, vgl. links mit rechts). Unseres Wissens ist es das erste Mal, dass die beiden Runden der PEGylation für Einzelmoleküluntersuchungen eingeführt. Die zwei Runden der PEGylation garantieren die höchste Qualität von PEG Schichtbildung (Bild 3b). Die überlegene Art der Doppel PEGylation ist prominent in den Filmen gezeigt (vgl. 1a Film mit Movie-1b). In diesen Filmen werden die Hintergrundsignale von fluoreszierenden Molekülen in Lösung beobachtet sehr viel schwächer als die doppelte PEGylierung zu sein<html> verwendet, was bedeutet, dass Proteine ​​werden dadurch von der doppelt PEGylierte Schicht abgestoßen. Obwohl das Zwei-Schritt-Verfahren wird dringend empfohlen, könnte der zweite PEGylation Schritt übersprungen werden, wenn Ihr Experiment ist erträglich nicht optimale Passivierung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1:. Schema der Oberflächenbehandlungen (a) einen Objektträger mit Aceton, KOH und Piranha-Lösung gereinigt. Es ist mit APTES und mit PEG-NHS-Ester funktionalisierten PEG. (B) Ein Deckglas wird mit KOH, sowie mit Piranha-Lösung gegebenenfalls gereinigt. Es ist mit APTES und mit PEG-NHS-Ester funktionalisierten PEG. fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 2:. Microfluidic Kammer (a) Ein Single-Channel-Kammer. Der Mikroskop-Objektträger hat zwei Löcher gebohrt. Es wird mit einem Deckglas mit zwei Scheiben eines doppelseitigen Klebeband montiert. (B) Ein Drei-Kanal-Kammer. Der Mikroskop-Objektträger hat sechs Löcher gebohrt. Es wird mit einem Deckglas mit vier Scheiben eines doppelseitigen Klebeband montiert. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3: CCD-Bilder mit Farbstoff-markierten Proteine ​​in Lösung aufgenommen. (A) CCD-Bilder wurden durch Prisma-Typ-Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit einem 60X Objektiv mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. (Links) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel erstellt. (Mitte) Eine Oberfläche war Vorbereitungrot nach dem Protokoll in diesem Artikel, aber Piranha Ätzen wurde übersprungen. (Rechts) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll hergestellt, das in diesem Artikel und für 3 Monate bei -20 º C unter Stickstoff gelagert. (B) CCD-Aufnahmen mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. (Links) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel erstellt. (Rechts) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel vorbereitet, aber die zweite Runde der PEGylation übersprungen wurde. Maßstabsbalken = 5 um. Film 1: CCD-Filme mit Farbstoff-markierten Proteine ​​in Lösung aufgenommen. CCD-Filme wurden von Prisma-Typ-Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit einem 60X Objektiv mit 10 nM Cy3-labeld Rep in Lösung aufgenommen. Die Zeitauflösung beträgt 100 ms. (A) Eine Oberfläche wurde nach dem Protokoll hergestellt, das in diesem Artikel. (B) A-Oberfläche wurde nach dem Protokoll in diesem Artikel vorbereitet, aber die zweite Runde der PEGylation wurde übersprungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Klicken Sie hier</a> , um Film-1a anzeigen und <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">klicken Sie hier</a> , um Film-1b zu sehen.

Wir beschreiben ein Verfahren zum Passivieren einer Glasoberfläche unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG). Dieses Protokoll umfasst die Oberflächenreinigung, Oberflächen Funktionalisierung und PEG-Beschichtung. Wir führen eine neue Strategie für die Behandlung der Oberfläche mit PEG-Molekülen über zwei Runden, die im Vergleich zu bestehenden Methoden überlegene Qualität der Passivierung ergibt.

Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine beschichtete Quarzobjektträgeroberfläche von hervorragender Qualität zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst gebohrte Quarzobjektträger und Deckgläser mit Wasser und Aceton gereinigt werden. Anschließend wird der Objektträger mit Kaliumhydroxid und der Piranha-Lösung geätzt, um die Qualität der Oberfläche zu verbessern.Anschließend werden die Objektträger und Deckgläser mit Amin-Gruppen funktionalisiert und danach zweimal einer Oberflächenbehandlung unterzogen, bei der ein Polymer verwendet wird, um die Glasoberfläche inert zu machen. Im letzten Schritt wird die mikrofluidische Kammer aus Objektträger und Deckglas zusammengesetzt, wobei die mit Polyethylenglykol beschichteten oder pegylierten Oberflächen einander zugewandt sind. Letztendlich verbessert eine neue Strategie, die Oberfläche in zwei Durchgängen mit PEG-Molekülen zu behandeln, die Qualität der Passivierung deutlich, wie durch Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Polymerschichtbeschichtung nach Ätzen mit Kaliumoxid besteht darin, dass diese Technik eine überlegene Qualität gewährleistet. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da mehrere Behandlungsschritte durchgeführt werden müssen. Um zu beginnen, bohren Sie die Quarzplättchen wie im Textprotokoll beschrieben.Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie sie in ein Glas-Präparatgefäß stellen. Typischerweise können fünf bis 15 Objektträger in einem einzigen Gefäß platziert werden. Anschließend spülen Sie die Objektträger nach dreimaligem Wiederholen des Ausspülens mit UE-Wasser, lassen die Objektträger fünf Minuten lang im Ultraschallbad mit UE-Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen, entsorgen das Wasser und spülen die Objektträger zusätzlich dreimal mit UE-Wasser aus.Als Nächstes ersetzen Sie das UE-Wasser durch Aceton und behandeln die Objektträger mit Ultraschall in Aceton für 20 Minuten oder länger, entsorgen anschließend das Aceton und spülen die Objektträger mit Milli-Q-Wasser, um Rückstände von Aceton zu entfernen. Danach ersetzen Sie das Wasser durch einmolariges Kaliumhydroxid und behandeln die Objektträger erneut mit Ultraschall für 20 Minuten oder länger. Eine übermäßige Ätzung verbessert zwar die Oberflächenqualität, kann jedoch Kratzer verursachen, die die Fluoreszenzbildgebung stören könnten.Spülen Sie die Objektträger dreimal mit Milli-Q-Wasser, um Rückstände von Kaliumhydroxid zur Durchführung der Piranha-Ätzung zu entfernen. Überführen Sie die Objektträger in einen Duran-Objektträgerhalter oder einen speziell angefertigten Teflonhalter und stellen Sie diesen in einen Ein-Liter-Becher, der sich in einer Abzugshaube befindet. Füllen Sie den Becher mit 450 Milliliter Schwefelsäure. Gegeben Sie dann 150 Milliliter Wasserstoffperoxid zu, um ein Verhältnis von drei zu eins zwischen Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid zu erreichen. Rühren Sie die Lösung gut durch und lassen Sie das Becherglas 20 Minuten lang ungestört stehen. Nehmen Sie die Objektträger aus der Piranha-Lösung und legen Sie sie in einen Objektträgerhalter, der Millipore-Wasser enthält.Entsorgen Sie in der Zwischenzeit die Piranha-Lösung in eine dafür vorgesehene Abfallflasche. Nachdem sie Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie die Objektträger nach der Abdeckungsscheiben-Reinigung dreimal mit UE-Wasser ab. Ersetzen Sie das UE-Wasser in den Färbeschalen durch Methanol. Bewahren Sie die Objektträger und die Abdeckungsscheiben in Methanol auf.Unterdessen bereiten Sie die Amino-Silanisierungslösung vor, indem Sie 100 Milliliter Methanol in den Kolben geben. Fügen Sie dann fünf Milliliter Essigsäure und drei Milliliter 3-Aminopropyl-trimethoxysilan hinzu und mischen vorsichtig durch Schütteln. Ersetzen Sie das Methanol in den Färbegläsern, die die Objektträger und Deckgläser enthalten, durch die Amino-Silanisierungs-Reaktionsmischung.Incubieren Sie 20 bis 30 Minuten lang; während der Inkubation beschallen Sie einmal für eine Minute. Ersetzen Sie danach die Amino-Isolierungsreaktion durch Methanol. Entsorgen Sie anschließend das Methanol und geben Sie eine frische Methanol-Lösung hinzu.Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die erste Runde der Oberflächenfunktionalisierung. Verwenden Sie zunächst das Polymer, trocknen Sie die Objektträger und Deckgläser mit Stickstoffgas. Anschließend platzieren Sie sie in saubere Pipettenkästen, die teilweise mit Milli-Q-Wasser gefüllt sind, sodass die Seite, die pegyliert werden soll, nach oben zeigt. Geben Sie danach 64 µL des frisch zubereiteten Reaktionspuffers zu einer vorbereiteten PEG-Lösung hinzu.Pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, um sie vollständig aufzulösen. Zentrifugieren Sie dann bei 16.100 ×g eine Minute lang. Um Luftblasen zu entfernen, geben Sie 70 µL der PEGylierungs-Mischung auf eine trockene Quarz-Platte. Legen Sie vorsichtig einen trockenen Deckgläser auf die Lösung und inkubieren Sie die Objektträger zwei Stunden bis über Nacht in einer dunklen und feuchten Umgebung, um die pegylierten Objektträger und Deckgläser aufzubewahren. Bauen Sie den Objektträger und das Deckglas vorsichtig ab, indem Sie das Deckglas zur Seite schieben und beide mit UE-Wasser spülen, bevor Sie sie mit Stickstoffgas trocknen. Legen Sie ein Paar aus Objektträger und Deckglas in ein 50-Milliliter-Gefäß, sodass die pegylierten Oberflächen voneinander abgewandt sind.Schließen Sie das Röhrchen teilweise und evakuieren Sie es, bevor Sie es mit Stickstoffgas füllen und die Kappe fest zuschrauben. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Diese Schritte tragen dazu bei, die pegylierte Oberfläche über einen langen Zeitraum hinweg zu stabilisieren.Führen Sie eine zweite PEGylierungsrunde gemäß dem schriftlichen Protokoll unmittelbar vor der Verwendung des Objektträgers zur Montage einer mikrofluidischen Kammer durch. Legen Sie einen Quarzobjektträger mit der PEGylierten Seite nach oben auf eine ebene Oberfläche. Erstellen Sie einen Kanal diagonal auf der PEGylierten Oberfläche, indem Sie doppelseitiges Klebeband über den Objektträger legen.Stellen Sie sicher, dass sich die Löcher in der Mitte des Kanals befinden. Legen Sie dann vorsichtig einen pegylierten Deckel auf die Oberseite, um die Kammer zu vervollständigen. Dabei muss die pegylierte Seite nach unten zeigen.Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie das Deckglas vorsichtig, aber gründlich über die Bereiche drücken, auf denen das doppelseitige Klebeband angebracht ist, sodass die Kammer wasserdicht verschlossen wird. Verschließen Sie abschließend die Kanten der Kammer mit Epoxidharzkleber.Fahren Sie fort, Streptavidin oder NeutrAvidin zu immobilisieren, und geben Sie biotinylierte biologische Moleküle für die Einzelmolekül-Bildgebung hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn die Oberflächenfunktionalisierung erfolgreich durchgeführt wurde, werden weniger als 10 unspezifisch adsorbierte Proteine pro Bildgebungsfläche beobachtet. Wenn ein fluoreszenzmarkiertes Protein in einer Konzentration von einem bis zehn Nanomolar in die Messkammer gegeben wird, steigt die Zahl der unspezifisch adsorbierten Proteine erheblich an, falls einer der Reinigungs- oder Reaktionsschritte nicht ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Wenn beispielsweise das Piranha-Ätzen ausgelassen wird, tritt eine um das 100-fache stärkere unspezifische Adsorption auf.Die überlegene Eigenschaft der doppelten PEGylierung wird hier deutlich. Die Hintergrundsignale von fluoreszierenden Molekülen und Lösung erwiesen sich als deutlich schwächer, wenn die doppelte PEGylierung verwendet wurde, wie in der linken Darstellung gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Proteine durch die doppelt PEGylierte Schicht effektiver abgestoßen werden.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit AYA äußerst gefährlich sein kann; daher sollten stets geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille und Schürze getragen werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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