Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine beschichtete Quarzobjektträgeroberfläche von hervorragender Qualität zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst gebohrte Quarzobjektträger und Deckgläser mit Wasser und Aceton gereinigt werden. Anschließend wird der Objektträger mit Kaliumhydroxid und der Piranha-Lösung geätzt, um die Qualität der Oberfläche zu verbessern.

Anschließend werden die Objektträger und Deckgläser mit Amin-Gruppen funktionalisiert und danach zweimal einer Oberflächenbehandlung unterzogen, bei der ein Polymer verwendet wird, um die Glasoberfläche inert zu machen. Im letzten Schritt wird die mikrofluidische Kammer aus Objektträger und Deckglas zusammengesetzt, wobei die mit Polyethylenglykol beschichteten oder pegylierten Oberflächen einander zugewandt sind. Letztendlich verbessert eine neue Strategie, die Oberfläche in zwei Durchgängen mit PEG-Molekülen zu behandeln, die Qualität der Passivierung deutlich, wie durch Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Polymerschichtbeschichtung nach Ätzen mit Kaliumoxid besteht darin, dass diese Technik eine überlegene Qualität gewährleistet. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da mehrere Behandlungsschritte durchgeführt werden müssen. Um zu beginnen, bohren Sie die Quarzplättchen wie im Textprotokoll beschrieben.

Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie sie in ein Glas-Präparatgefäß stellen. Typischerweise können fünf bis 15 Objektträger in einem einzigen Gefäß platziert werden. Anschließend spülen Sie die Objektträger nach dreimaligem Wiederholen des Ausspülens mit UE-Wasser, lassen die Objektträger fünf Minuten lang im Ultraschallbad mit UE-Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen, entsorgen das Wasser und spülen die Objektträger zusätzlich dreimal mit UE-Wasser aus.

Als Nächstes ersetzen Sie das UE-Wasser durch Aceton und behandeln die Objektträger mit Ultraschall in Aceton für 20 Minuten oder länger, entsorgen anschließend das Aceton und spülen die Objektträger mit Milli-Q-Wasser, um Rückstände von Aceton zu entfernen. Danach ersetzen Sie das Wasser durch einmolariges Kaliumhydroxid und behandeln die Objektträger erneut mit Ultraschall für 20 Minuten oder länger. Eine übermäßige Ätzung verbessert zwar die Oberflächenqualität, kann jedoch Kratzer verursachen, die die Fluoreszenzbildgebung stören könnten.

Spülen Sie die Objektträger dreimal mit Milli-Q-Wasser, um Rückstände von Kaliumhydroxid zur Durchführung der Piranha-Ätzung zu entfernen. Überführen Sie die Objektträger in einen Duran-Objektträgerhalter oder einen speziell angefertigten Teflonhalter und stellen Sie diesen in einen Ein-Liter-Becher, der sich in einer Abzugshaube befindet. Füllen Sie den Becher mit 450 Milliliter Schwefelsäure.

Gegeben Sie dann 150 Milliliter Wasserstoffperoxid zu, um ein Verhältnis von drei zu eins zwischen Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid zu erreichen. Rühren Sie die Lösung gut durch und lassen Sie das Becherglas 20 Minuten lang ungestört stehen. Nehmen Sie die Objektträger aus der Piranha-Lösung und legen Sie sie in einen Objektträgerhalter, der Millipore-Wasser enthält.

Entsorgen Sie in der Zwischenzeit die Piranha-Lösung in eine dafür vorgesehene Abfallflasche. Nachdem sie Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie die Objektträger nach der Abdeckungsscheiben-Reinigung dreimal mit UE-Wasser ab. Ersetzen Sie das UE-Wasser in den Färbeschalen durch Methanol. Bewahren Sie die Objektträger und die Abdeckungsscheiben in Methanol auf.

Unterdessen bereiten Sie die Amino-Silanisierungslösung vor, indem Sie 100 Milliliter Methanol in den Kolben geben. Fügen Sie dann fünf Milliliter Essigsäure und drei Milliliter 3-Aminopropyl-trimethoxysilan hinzu und mischen vorsichtig durch Schütteln. Ersetzen Sie das Methanol in den Färbegläsern, die die Objektträger und Deckgläser enthalten, durch die Amino-Silanisierungs-Reaktionsmischung.

Incubieren Sie 20 bis 30 Minuten lang; während der Inkubation beschallen Sie einmal für eine Minute. Ersetzen Sie danach die Amino-Isolierungsreaktion durch Methanol. Entsorgen Sie anschließend das Methanol und geben Sie eine frische Methanol-Lösung hinzu.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die erste Runde der Oberflächenfunktionalisierung. Verwenden Sie zunächst das Polymer, trocknen Sie die Objektträger und Deckgläser mit Stickstoffgas. Anschließend platzieren Sie sie in saubere Pipettenkästen, die teilweise mit Milli-Q-Wasser gefüllt sind, sodass die Seite, die pegyliert werden soll, nach oben zeigt. Geben Sie danach 64 µL des frisch zubereiteten Reaktionspuffers zu einer vorbereiteten PEG-Lösung hinzu.

Pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, um sie vollständig aufzulösen. Zentrifugieren Sie dann bei 16.100 ×g eine Minute lang. Um Luftblasen zu entfernen, geben Sie 70 µL der PEGylierungs-Mischung auf eine trockene Quarz-Platte.

Legen Sie vorsichtig einen trockenen Deckgläser auf die Lösung und inkubieren Sie die Objektträger zwei Stunden bis über Nacht in einer dunklen und feuchten Umgebung, um die pegylierten Objektträger und Deckgläser aufzubewahren. Bauen Sie den Objektträger und das Deckglas vorsichtig ab, indem Sie das Deckglas zur Seite schieben und beide mit UE-Wasser spülen, bevor Sie sie mit Stickstoffgas trocknen. Legen Sie ein Paar aus Objektträger und Deckglas in ein 50-Milliliter-Gefäß, sodass die pegylierten Oberflächen voneinander abgewandt sind.

Schließen Sie das Röhrchen teilweise und evakuieren Sie es, bevor Sie es mit Stickstoffgas füllen und die Kappe fest zuschrauben. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Diese Schritte tragen dazu bei, die pegylierte Oberfläche über einen langen Zeitraum hinweg zu stabilisieren.

Führen Sie eine zweite PEGylierungsrunde gemäß dem schriftlichen Protokoll unmittelbar vor der Verwendung des Objektträgers zur Montage einer mikrofluidischen Kammer durch. Legen Sie einen Quarzobjektträger mit der PEGylierten Seite nach oben auf eine ebene Oberfläche. Erstellen Sie einen Kanal diagonal auf der PEGylierten Oberfläche, indem Sie doppelseitiges Klebeband über den Objektträger legen.

Stellen Sie sicher, dass sich die Löcher in der Mitte des Kanals befinden. Legen Sie dann vorsichtig einen pegylierten Deckel auf die Oberseite, um die Kammer zu vervollständigen. Dabei muss die pegylierte Seite nach unten zeigen.

Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie das Deckglas vorsichtig, aber gründlich über die Bereiche drücken, auf denen das doppelseitige Klebeband angebracht ist, sodass die Kammer wasserdicht verschlossen wird. Verschließen Sie abschließend die Kanten der Kammer mit Epoxidharzkleber.

Fahren Sie fort, Streptavidin oder NeutrAvidin zu immobilisieren, und geben Sie biotinylierte biologische Moleküle für die Einzelmolekül-Bildgebung hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn die Oberflächenfunktionalisierung erfolgreich durchgeführt wurde, werden weniger als 10 unspezifisch adsorbierte Proteine pro Bildgebungsfläche beobachtet. Wenn ein fluoreszenzmarkiertes Protein in einer Konzentration von einem bis zehn Nanomolar in die Messkammer gegeben wird, steigt die Zahl der unspezifisch adsorbierten Proteine erheblich an, falls einer der Reinigungs- oder Reaktionsschritte nicht ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Wenn beispielsweise das Piranha-Ätzen ausgelassen wird, tritt eine um das 100-fache stärkere unspezifische Adsorption auf.

Die überlegene Eigenschaft der doppelten PEGylierung wird hier deutlich. Die Hintergrundsignale von fluoreszierenden Molekülen und Lösung erwiesen sich als deutlich schwächer, wenn die doppelte PEGylierung verwendet wurde, wie in der linken Darstellung gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Proteine durch die doppelt PEGylierte Schicht effektiver abgestoßen werden.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit AYA äußerst gefährlich sein kann; daher sollten stets geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille und Schürze getragen werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.