Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Expression und zelluläre Lokalisation von Mikroglia-Makrophagen-Phänotypmarkern nach Hirnischämie zu visualisieren. Zunächst werden Kryoschnitte aus ischämischen Mäusegehirnen gefärbt, um Marker für die Aktivierung von Mikroglia-Makrophagen zu identifizieren. Die gefärbten Schnitte werden einer dreidimensionalen konfokalen Bildgebung unterzogen.

Die resultierenden Bilder werden dann verarbeitet, um dreidimensionale Renderings zu erzeugen, und es wird eine Bildanalyse durchgeführt, um die Expression von Markern in Zellclustern zu lokalisieren. Die daraus resultierenden Daten zeigen die Wirksamkeit der dreidimensionalen konfokalen Analyse bei der korrekten Zuordnung der Markerexpression zu einem bestimmten Zellkörper. Wenn zwei Marker von derselben Zelle, aber in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten exprimiert werden, ist die Kolokalisation allein möglicherweise nicht sehr aussagekräftig. Die Verwendung der dreidimensionalen Analyse, wie wir hier zeigen werden, ermöglicht eine bessere Auflösung und Genauigkeit.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Komplexität der Gehirnreaktion auf ischämische Verletzungen geben kann, kann sie auch auf andere akute oder chronische Erkrankungen angewendet werden, bei denen eine doppelte Rolle von Mikroglia-Makrophagen bei Verletzungen und Reparaturen vorgeschlagen wurde. Oder in den Fällen, in denen Signale selektiv in verschiedenen Spezialebenen lokalisiert werden müssen, führen Sie Carlo Perigo und Stefan von Magali durch die verschiedenen Schritte des Verfahrens. Das folgende Protokoll verwendet Hirngewebe von Mäusen, bei denen eine Ischämie durch einen dauerhaften Verschluss der mittleren Hirnarterie induziert wurde.

Verwenden Sie einen Kryostaten, um serielle 20-Mikron-Koronaler Schnitte des Gehirns auf Gelatine zu sammeln. Abgedeckte Objektträger bringen alle Reagenzien und Proben vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Bitte beachten Sie, dass die Arbeitsverdünnung von Antikörpern und Serum, die in ihrem Begleitdokument aufgeführt ist, aus Versuchen resultiert, die durchgeführt wurden, um die beste Leistung zu erzielen, wenn verschiedene Antikörper und Serum verwendet werden.

Das Protokoll muss validiert werden. Beginnen Sie damit, die Abschnitte auf dem Objektträger mit einem Flüssigblocker zu umkreisen, um die Menge der benötigten Reagenzien zu minimieren. Legen Sie anschließend die Gehirnabschnitte mit einer Ein-Milliliter-Pipette in eine Nasskammer.

Geben Sie PBS bei Raumtemperatur in die Sektionen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang, um sie zu waschen. Entfernen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Einwegspritze mit Nadel die Lösung und wiederholen Sie den Waschvorgang erneut. Nachdem Sie die zweite Wäsche entfernt haben, färben Sie die Proben mit einer Ein-Milliliter-Pipette und einer Einwegspritze für den gesamten Lösungswechsel. Das Färbeverfahren sollte wie zusammengefasst durchgeführt werden. Hier.

Weitere Informationen, einschließlich der Waschschritte, finden Sie im Begleittext. Zuerst werden die Zellen mit 1%Wasserstoffperoxid inkubiert, nachdem sie mit normalem Ziegenserum blockiert wurden. Anschließend werden die Objektträger mit einem primären Antikörper gegen CD 11 B inkubiert, gefolgt von Triss, NACL-Tween-Puffer oder TNT, dann Triss, H-C-L-N-A-C-L, Blockierungspuffer oder TNB nach der Inkubation mit TNB.

Die Objektträger werden mit Streptavidin HRP inkubiert, gefolgt von einem Amplifikationsverdünnungsmittel, das Cyanid-Fünf-Tyrom enthält, das das Immunfluoreszenzsignal verstärkt. Als nächstes werden die Objektträger mit NGS inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Dann werden sie mit einem primären Antikörper gegen CD 68 inkubiert.

Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper werden die Zellen dann in den entsprechenden Fluor-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert, gefolgt von einem Mikrogramm pro Milliliter Haken zur Markierung der DNA. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, montieren Sie Kryo-Schnitte mit verlängertem Gold, wenn Sie Schnitte montieren, vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Lagern Sie die Schnitte bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie analysiert sind.

Die Erfassung des Fluoreszenzsignals sollte innerhalb einer Woche erfolgen. Dieses Protokoll verwendet ein IX 81-Mikroskop, das mit einer konfokalen Scaneinheit FV 500 ausgestattet ist, mit drei Laserlinien: Argon, Krypton bei 488 Nanometern, Helium, Neonrot bei 646 Nanometern und Heliumneongrün bei 532 Nanometern, plus eine UV-Diode in der Grippe der U 500-Software. Wählen Sie die geeigneten Anregungslaser und dichroitischen Spiegel aus.

Stellen Sie außerdem eine Bildauflösung von mindestens 800 x 600 Pixeln ein. Legen Sie dann den Objektträger auf den Tisch des Mikroskops und identifizieren Sie mit Epi-Fluoreszenz einen Interessenbereich und erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 40-fache Objektiv. Wechseln Sie dann zur Laserscanning-Mikroskopie und führen Sie wiederholte Scans durch, während Sie die Photomultiplier-Leistung und die Verstärkung für jeden Kanal anpassen.

Dadurch wird die Signalüberlappung reduziert, die durch die gleichzeitige Anregung bei verschiedenen Wellenlängen verursacht wird. Halten Sie die Verstärkung so gering wie möglich, um unerwünschte unspezifische Signale zu vermeiden. Setzen Sie den wiederholten Scan fort, passen Sie den Fokus an und definieren Sie die unteren und oberen Enden der Z-Achse mit einer Gesamtlänge der Z-Achse von 10 Mikrometern.

Stoppen Sie dann den wiederholten Scan. Geben Sie als Nächstes die Schrittweite ein. Sie sollte so nah wie möglich an der Pixelgröße liegen, die 0,225 Mikrometer beträgt.

Dadurch ergibt sich ein standardmäßiges Größenverhältnis von eins zu eins über die Z-Achse in der Software Kalman-Filter mindestens zweimal aktivieren. Der Kalman-Algorithmus ist eine iterative Funktion, die zufällige Signale, wie z. B. einzelne positive Voxel, die zum Hintergrundrauschen gehören, eliminiert und so das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert. Aktivieren Sie nun den sequentiellen Scanmodus, um Durchblutungseffekte zu vermeiden.

Bewegen Sie sich zum Mittelpunkt der Z-Achse und führen Sie einen sequenziellen XY-Scan durch. Überprüfen Sie die Einstellungen von PMT und Verstärkung, um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis sicherzustellen. Führen Sie die Erfassung XY, Z nach der Erfassung aus.

Exportieren Sie die Daten als Multi-TIF-Datei. Jede Multi-TIF-Datei enthält in der Regel drei Farbkanäle und 44 Fokusebenen für die Verarbeitung. Beginnen Sie mit dem Öffnen der imas-Software.

Wählen Sie zuerst die Surpass-Ansicht aus und laden Sie dann die Multi-TIF-Datei hoch. Wählen Sie anschließend im Anzeigeanpassungsfeld die gewünschte Farbe für jeden Kanal aus Hier. Rot steht für CD 11 B.Grün steht für CD 68 und Blau für den DNA-Fleck des Hakens. Um Rauschen aus dem Hintergrund zu entfernen, erhöhen Sie den Mindestwert auf dem Anzeigeeinstellfeld für jeden Kanal.

Gehen Sie dann zur Schnittansicht, um eine einzelne XY-Brennebene mit orthogonalen Projektionen der x-, z- und YZ-Achse zu visualisieren. Bewegen Sie sich entlang der Z-Achse und suchen Sie nach Kolokalisierung, die als gelbe Pixel angezeigt wird. Klicken Sie auf einen gelben Bereich, um zu sehen, ob die Kolokalisierung entlang der Z-Achse vorhanden ist, was darauf hinweist, dass sie zu einer Z-Achse eines Festkörperobjekts gehört.

Projektionen sind im rechten und unteren Teil der Figur sichtbar. Machen Sie einen Schnappschuss und kehren Sie dann zur Ansicht "Übertreff" zurück. Wählen Sie anschließend im Dropdown-Menü "Bearbeiten" die Option "3D zuschneiden" aus und skizzieren Sie einen interessanten Bereich, um eine Zelle oder einen Zellcluster zu isolieren.

Wählen Sie dann auf dem Anzeigeanpassungsfeld einen Kanal aus. Wählen Sie den Algorithmus zum Übertreffen von Oberflächen aus. Um den Algorithmus einzurichten, wählen Sie zunächst einen Kanal aus.

Definieren Sie dann den Schwellenwert als denselben Mindestwert, der im Anzeigeanpassungsfenster festgelegt wurde, und definieren Sie bei Bedarf die Größenänderung. Definieren Sie als Nächstes die Glättung als 0,200. Wählen Sie das Farbfeld aus und ändern Sie das Erscheinungsbild nach Bedarf.

Wiederholen Sie die Einrichtung für den Algorithmus zum Übertreffen von Oberflächen für jeden Kanal. Deaktivieren Sie dann auf dem Anzeigeanpassungsfeld die Auswahl der Fluoreszenzkanäle und wählen Sie alle drei Oberflächen aus. Verschieben Sie abschließend das Volume, um die beste Ansicht zu finden, und machen Sie einen Schnappschuss, um das Muster der Co-Expression von MM-Markern zu bestimmen.

Die in diesem Video beschriebenen Protokolle für Immunfluoreszenz und konfokale Akquisition wurden in einem Mausmodell der fokalen Ischämie durchgeführt, die durch einen dauerhaften Verschluss der mittleren Hirnarterie induziert wurde. Eine zweidimensionale Ansicht der aufgenommenen Bilder zeigt, dass 24 Stunden nach der Ischämie der lysosomale Marker CD 68, der in grün dargestellt ist, in den hypertrophen Zellen inmitten von CD 11 B exprimiert wird, die in Rot im ischämischen Kern zu sehen sind. Die Projektion der Z-Achse unten rechts zeigt, dass die in der Einzelebenenansicht dokumentierte Markierungsverteilung auch entlang der Z-Achse im Randbereich vorhanden ist.

Die CD 11 B-positiven Zellen weisen hypertrophe Zellkörper mit Prozessen auf, die für CD 68 sehr positiv sind, was darauf hindeutet, dass Phagosomen an die Zellmembran gebunden sind. Dies deutet auf ein aktives saures PHA-Verhalten von Mikrogliazellen hin, um die Co-Expression von CD 68 und YM eins, einem Marker für die Polarisierung von M zwei, zu beurteilen. Die fluoreszierenden Bilder wurden dreidimensional gerendert.

Die dreidimensionale Ansicht der hier aufgenommenen Bilder zeigt das Vorhandensein von CD 68-positiven Zellen in grün und YM 1-positiven Zellen in rot fluoreszierenden Voxeln. Wenn der Blick des Beobachters parallel verläuft, kann er ein kolokalisiertes Signal erhalten, das als gelb angesehen wird und möglicherweise nicht mit dem tatsächlichen Abstand zwischen den Markern zusammenhängt. So definieren Sie die Kolokalisierung.

Eine Einzelebenenansicht mit Projektionen der Z-Achse sollte entlang der Z-Achse erzeugt werden. Auf der Suche nach Kolokalisierung. Die Projektion der Z-Achse wird so erhalten, wie im rechten und unteren Teil dieses Bildes zu sehen ist.

Fluoreszierende Voxel können durch dreidimensionales Rendering in feste Objekte umgewandelt werden, wobei die Markerexpression einem bestimmten Zellkörper zugewiesen wird. Nach einer starken Vergrößerung und 3D-Rendering scheinen die beiden Marker zu verschiedenen Zellen zu gehören, die sich in unmittelbarer Nähe befinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Immunfluoreszenz-Assay mit mehreren Markern und Farbstoffen durchführt und wie man dreidimensionale Bilder durch konfokale Mikroskopie richtig erfasst und visualisiert.

Darüber hinaus kann die beschriebene Post-Processing-Analyse fruchtbar genutzt werden, um jede Co-Expression oder Co-Lokalisation auf zellulärer Ebene zu analysieren, oder in den Fällen, in denen Signale selektiv in verschiedenen räumlichen Ebenen lokalisiert werden müssen.