Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bewegung und Interaktion zwischen Mikroglia, Monozyten und anderen Zelltypen im verletzten Rückenmark zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst chimäre Knochenmarkmäuse gezüchtet werden, die entweder residente Mikroglia oder aus dem Knochenmark stammende Makrophagen haben, die mit einem fluoreszierenden Marker markiert sind. Der zweite Schritt besteht darin, eine Quetschverletzung der dorsalen Säule im Rückenmark zu erzeugen.

Dann werden die Tiere wieder geöffnet und das Rückenmark stabilisiert. Bei der Multiphotonen-Bildgebung besteht der letzte Schritt darin, entweder Einzelbilder oder Zeitrafferfilme innerhalb der Läsion aufzunehmen. Letztendlich zeigt die Bildanalyse die zelluläre Bewegung und die zelluläre Interaktion mit umgebenden Substraten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Techniken, wie z. B. Zellkultur und fixiertem Gewebe, besteht darin, dass Zellen in ihrer natürlichen komplexen Umgebung im lebenden Tier abgebildet werden können.

Verwenden Sie für diese Operation chimäre oder doppelt transgene Tiere. Siehe das Textprotokoll zur Markierung von residenten oder aus dem Knochenmark stammenden Zellen nach Einleitung der Anästhesie, halten Sie es mit einem bis 2%igen ISO-Fluor für eine Atemfrequenz von etwa 60 bis 100 Atemzügen pro Minute aufrecht. Tragen Sie nun Augensalben auf und bestätigen Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit einem Zehenkneifen.

Bereiten Sie sich auf die Operation vor, indem Sie zuerst den Zielbereich des Rückenmarks rasieren und dann die Haut mit Povidon-Jod- und 70%iger Alkoholpeelings reinigen, das Tier drapieren und ein Loch machen, um Zugang zur Operationsstelle zu erhalten. Legen Sie dann die Autoklavenwerkzeuge auf ein steriles Tuch. Dazu gehört eine Pinzette mit der Nummer vier, die einen Millimeter zwischen den Zinken befestigt ist und Markierungen hat, die einen Millimeter von den Spitzen entfernt sind.

Nun könnte man die Haut an der Mittellinie mit einer Irisschere öffnen und so die Muskulatur freilegen. Fahren Sie mit der Operation unter einem Präpariermikroskop fort. Schneiden Sie entlang der Mittellinie die Rückenmuskulatur ab, wo sie an den dorsalen Wirbelsäulenfortsätzen befestigt ist, mit dem Ziel, die Wirbelsäule freizulegen.

Dabei werden der Trapezius und die Bänder des Latisimus dorsi durchtrennt. Als nächstes entfernen Sie die Rotatorenmuskulatur zwischen den Querfortsätzen und dem Dorsalfortsatz, um die Lamina des spezifischen Wirbels freizulegen, der entfernt werden soll. Hier ist T 10 freigelegt.

Fahren Sie fort, indem Sie die RO-Jurorspitzen in den Raum über und unter dem Prozess einsetzen. Heben Sie dann leicht an, um sicherzustellen, dass die Spitzen fest und nicht zu tief sitzen. Schließen Sie dann die RO-Juroren, um die Lamina zu entfernen.

Entferne nun alle kleineren Teile des verbleibenden Wirbels und vergrößere so die Öffnung. Stechen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel zwei Löcher im Abstand von einem Millimeter in die Dura, um einen Zugang für die feste Pinzette zu schaffen. Führen Sie dann die feststehende Pinzette in einem 90-Grad-Winkel durch die Dura ein, wobei Sie die Markierungen auf den Zinken über der Dura halten.

Kneifen Sie nun die Pinzette 10 Sekunden lang zusammen. Mache den zehnsekündigen Druck noch zwei Mal und entferne die Pinzette. Tränken Sie als Nächstes ein Stück resorbierbare Gelatine und einen komprimierten Schwamm in Kochsalzlösung und bedecken Sie die Verletzungsstelle damit.

Verschließen Sie den Muskel über dem Gelatineschwamm mit Nummer vier, synthetischen Laufnähten ohne Nylon. Verwenden Sie dann fünf Millimeter gewickelte Clips, um die Haut zu sichern. Beenden Sie den Eingriff mit einer subkutanen Injektion von 10 Mikrolitern Bupivacain in 490 Mikroliter Kochsalzlösung für ein Milligramm pro Kilogramm.

Injizieren Sie dann fünf Mikroliter Buprenorphin für 100 Mikrogramm pro Kilogramm in den Gesäßmuskel. Postoperativ. Wärmen Sie das Tier und überwachen Sie es, bis es wieder zu Bewusstsein kommt. Um das Tier wieder für die Bildgebung zu öffnen, leiten Sie die Anästhesie wie zuvor ein und entfernen Sie dann die Wundclips gemäß den Anweisungen des Herstellers und der Anweisungen.

Tragen Sie bei Bedarf ein Haarentfernungsprodukt auf den Bereich um den Schnitt auf. Tragen Sie dieses Mal zusätzliche Peelings mit Povidon, Jod und 70% Alkohol auf. Öffnen Sie nun die Haut entlang des vorherigen Schnitts wieder.

Entfernen Sie die restlichen Nähte und öffnen Sie die Muskeln mit einer Pinzette und bei Bedarf mit einer Schere. Unter dem Präpariermikroskop machen Sie mit der Schere Taschen für die Rückenmarksklemmen entlang der Querfortsätze am Wirbel, eine Ebene über der Laminektomie und eine Ebene unterhalb der Laminektomie. Führen Sie die Klemmen des Rückenmarksstabilisators um jeden Wirbel ein und ziehen Sie die Klammern fest.

Stellen Sie die Klemmen so ein, dass das Rückenmark parallel zur Bildgebungsplattform verläuft und das Gewebe stabil ist. Wenn ein Atemartefakt zu sehen ist, passen Sie die Klammern an, um die Bewegung zu minimieren. Decken Sie dann die Klemmen ab und paraform.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Gelschaum mit einer Pinzette. Entfernen Sie so viel wie möglich. Entfernen Sie auch dickes Narbengewebe über den Hirnhäuten, das möglicherweise vorhanden ist.

Sobald der gesamte Gelschaum entfernt ist, bedecken Sie das Rückenmark mit Kochsalzlösung. Wenn Blutungen festgestellt werden, verwende einen Gelatineschwamm, um die Blutung zu stillen. Falls erforderlich, verwenden Sie während der Kauterisation Kauter.

Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu berühren und halten Sie es mit Kochsalzlösung und Gelschaum bedeckt. Erstellen Sie nun eine Vertiefung für die Tauchflüssigkeit, versiegeln Sie die Haut und das Gewebe mit Cyanacrylatkleber. Bauen Sie dann zwischen den beiden Klemmen eine Vertiefung aus Zahnacryl auf.

Lassen Sie die Vertiefung aushärten. Nach dem Aushärten die Vertiefung mit künstlichem Liquor füllen. Überwachen Sie während dieser Schritte weiterhin auf Blutungen.

Zu diesem Zeitpunkt werden optional fluoreszierende Gefäßmatrizen in die Schwanzvene injiziert. Um Blutgefäße während der Bildgebung hervorzuheben, verwenden Sie einen fluoreszierenden DExT-Strang oberhalb von 70 Kilodalton-Quantenpunkten oder fluoreszenzmarkierte Lektine. Halten Sie die Maus während der Bildgebung in einer kontrollierten Umgebung bei 37 Grad Celsius Auf dem Mikroskoptisch besteht der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Vorbereitung darin, sicherzustellen, dass das Rückenmark sauber ist, nicht blutet und dass es keine sichtbaren Atemartefakte gibt.

Überprüfen Sie während der Bildgebung regelmäßig den Grad der Anästhesie, indem Sie die Atmung des Tieres überwachen, die zwischen 60 und 100 Atemzügen pro Minute liegen sollte. Korrigieren Sie die Anästhesie, indem Sie den ISO-Fluorgehalt anpassen. Nach der Bildgebung bringen Sie das Tier dort an die Operationsstelle zurück, entfernen die Wirbelsäulenklemmen und ziehen das Acryl von der Haut.

Die Maus kann dann für eine spätere Bildgebung wie am Ende der ersten Operation geschlossen oder fünf Tage nach der Verletzung eingeschläfert werden. Die Einführstellen der Zange sind noch sichtbar, aber die Läsion hat begonnen, aufgrund einer sekundären Verletzung, die durch eine Entzündung verursacht wurde, an Größe zuzunehmen. Die Axone am Co-Ende der Läsion haben sich von der ursprünglichen Stelle der Verletzung zurückgezogen.

Gleichzeitig ist ein großer Zustrom von CX drei C 1-positiven Zellen, entweder Mikroglia oder Makrophagen, zu beobachten, die in und um die Quetschläsion infiltrieren, um das Verhalten dieser Zellen in der Mikroumgebung der Läsion zu erkennen. Die Knochenmarkvorläuferzellen einer CX drei CR eins positiven GFP-Maus wurden durch nicht fluoreszierende Spenderzellen ersetzt, so dass nur GFP-positive ZNS-residente Mikroglia sichtbar waren. Zweitens wurden Knochenmarkvorläuferzellen in einer nicht fluoreszierenden Maus durch Knochenmarkzellen aus einer CX mit drei CR und einer positiven GFP-Maus ersetzt, um aus dem Knochenmark gewonnene Zellen zu betrachten.

Vor der Verletzung waren die einzigen GFP-positiven Zellen, die aus dem Knochenmark gewonnen wurden, größtenteils paravaskulär, von denen berichtet wurde, dass sie nach der Quetschverletzung kontinuierlich aus dem Knochenmark ersetzt wurden. CX drei C 1 positive GFP-Zellen sind entlang der Innenseite der Blutgefäße, die die Läsion umgeben, vermehrt. Zusätzlich wurde das Läsionszentrum mit infiltrierenden CX drei CR one positiven GFP-Makrophagen gefüllt.

Mit dieser Technik können verschiedene transgene Tiere verwendet werden, um andere fluoreszierende Zellpopulationen zu markieren und ihre Wechselwirkungen sowohl innerhalb des Rückenmarks als auch in anderen Krankheitsmodellen zu identifizieren.