Plasmidaufreinigung

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Plasmid Purification

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08:16 min

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April 30, 2023

Overview

Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, mit dem man Plasmid-DNA von der bakteriellen genomischen DNA, Proteinen, Ribosomen und Zellwänden trennt und aufreinigt. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül, das als Träger bestimmter DNA Moleküle benutzt wird. Wenn sie in Gastorganismen durch Transformation eingefügt werden, können Plasmids repliziert werden, wodurch vielfache Kopien des DNA Fragments entstehen.

In diesem Video stellen wir ein Schritt-für-Schritt Verfahren vor, mit dem man Plasmide isoliert. Plasmidpräparationen beinhalten 3 Schritte: das Wachsen der bakteriellen Kultur, dem Ernten und der Lysierung der Bakterien, und der Aufreinigung der Plasmid-DNA. Dieses Video erklärt wo sich die Plasmid-DNA in jedem Schritt des Protokolls befindet und wie man die Plasmid-DNA quantitativ und qualitativ mit einem Spektrophotometer oder mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es gibt verschiedene Arten von Plasmidpräparationsverfahren, die auf die Ausbeute, den Replikationsursprung und das bakterielle Kulturvolumen ausgerichtet sind.

Procedure

Plasmide sind ringförmige, extrachromosomale DNA Moleküle, die in der molekularen Biologie als Träger, oder Vektoren, für spezifische DNA Fragmente fungieren. Bakterien werden benutzt, um die DNA zu vervielfältigen. Der Prozess mit dem man Plasmide von Bakterien isoliert, wird Plasmidpräparation genannt. Dieses Verfahren wird in diesem Video erklärt.

Es ist offensichtlich das die Plasmidpräparation die Isolierung des Plasmids aus den Bakterien beinhaltet – aber was genau bedeutet das eigentlich? Für die Plasmidpräparation müssen Plasmide von bakteriellen Chromosomen, Proteinen, Membranen und Ribosomen isoliert werden.

Es gibt viele verschiedene Kits für Plasmidpräparationen. Das grundlegende Prinzip der Aufreinigung ist jedoch immer das Gleiche. Zuerst wird die ausgewählte bakterielle Kolonie in dem Kulturmedium, welches das richtige Antibiotikum enthält, vervielfältigt. Da das Plasmid ein antibiotisches Resistenz-Gen enthält, wachsen nur die Bakterien, die das Plasmid tatsächlich enthalten. Die Bakterien werden geerntet und bei einem hohen pH-Wert lysiert. Dann wird der pH-Wert neutralisiert und Salz wird hinzugegeben. Danach wird das Gemisch zentrifugiert, um Abbauprodukte und genomische DNA zu entfernen.

Das neutralisierte Zell-Lysat wird dann auf eine Silica-Säule aufgetragen. Die Plasmid-DNA klebt dabei durch einen Mechanismus, den man Anionen-Austausch nennt, an der Säule fest. Beim Anionen-Austausch bindet die stark anionische DNA durch kationische Salzbrücken an die negativ geladene Säule. Andere Stoffe in dem Lysat, wie beispielsweise Proteine, werden mit Waschpuffern mit hoher Salzkonzentration durch die Säule gespült. Letztendlich wird das Plasmid von der Säule durch die Zugabe eines Puffers mit niedriger Salzkonzentration isoliert, da die Salzbrücke unterbrochen wird.

Bei diesem Verfahren sollte man einen Laborkittel, Handschuhe und eine Sicherheitsbrille tragen.

Die bakteriellen Kulturen, die mit dem gewünschten Plasmid transformiert worden sind, werden über Nacht mit dem geeigneten Antibiotikum bei 37°C in einem Schüttler angesetzt.

Am nächsten Tag werden die Bakterien in ein Pellet abzentrifugiert, wobei der Überstand aspiriert wird. Das bakterielle Pellet wird in dem Resuspensionspuffer resuspendiert.

Nach dem Resuspendieren können die Bakterien in ein kleineres Reaktionsgefäß überführt werden, in welchem dann der Lysispuffer hinzugefügt wird. Der Lysispuffer hat einen hohen pH-Wert und enthält Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, welche die Zellwände zerstören, wodurch die Bakterieren lysiert werden. Bei der Zugabe des Lysispuffers wird die Lösung trüb, nach dem Mischen wird sie klar. Das Gemisch sollte nicht mit dem Vortexmischer gemischt werden, da die genomische DNA zerbrechen könnte und dann eine Verunreinigung in der Plasmidpräparation darstellen kann.

Dann gibt man den Neutralsierungspuffer hinzu, um die alkalinenen Bedingungen zu neutralisieren und den pH-Wert zu senken. Durch sanftes Mischen präzipitiert die genomische DNA und die daran gebundenen Proteine. Die Plasmid-DNA bleibt allerdings in Lösung. Man sollte Mischen mit dem Vortexmischer immer noch vermeiden, so dass die Plasmide frei von genomischer DNA bleiben.

Das Gemisch wird dann zentrifugiert, wobei sich die präzipitierte genomische DNA und Proteine als Pellet ansammelt. Der Überstand besteht aus löslichen Proteinen und der Plasmid-DNA.

Der Überstand wird dann durch dekantieren (also einfachem Schütten oder Pipettieren) auf eine Säule aufgetragen. Das Pellet kann entsorgt werden.

Danach lässt man den Waschpuffer mit hoher Salzkonzentration durch die Säule laufen – die DNA bleibt dabei an die Silica-Säule gebunden. Wiederholtes Waschen mit Puffern mit hoher Salzkonzentration entfernt Endonukleasen, RNA, Proteine, Farbstoffe und Unreinheiten mit niedriger Molekularmasse. Bei den Waschschritten wird der Durchfluss verworfen. Nach dem letzten Waschschritt stellt man sicher, dass der Filter komplett trocken und kein Puffer mehr vorhanden ist. Die Plasmid-DNA befindet sich immer noch in dem Filter.

Die Plasmid-DNA wird dann mit sterilem Wasser oder Eluierpuffer eluiert. Die DNA kann danach für vielfältige Anwendungen weiterverwendet werden.

Es gibt verschiedene Methoden, wie man die Reinheit der Plasmidpräparation messen kann. Ein Spektrophotometer kann benutzt werden um die Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen zu bestimmen, wodurch die Reinheit der Plasmid-DNA berechnet werden kann. Mit einer Analyse des aufgereinigten Plasmids mit einem Agarose-Gel kann bestimmt werden, ob das Plasmid die richtige Größe hat und das keine Verunreinigungen vorhanden sind. Bei diesem Schritt kann man auch sicherstellen, dass keine Kontamination mit genomischer DNA vorliegt und dass das Plasmid nicht durch die Bakterien verändert wurde.

Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, das je nach Plasmidgröße, Replikationsursprung und Kulturvolumen variiert werden kann. Es kann verschiedene Bestandteile für das Binden, Waschen und Eluieren enthalten. Die Ausbeute ist das wichtigste Unterscheidungsmerkmal der verschiedenen Verfahren, die oft in Miniprep, Midiprep und Maxi- oder Megaprep, abhängig von der gewünschten Ausbeute, unterteilt werden.

Eine Anwendung die häufig auf eine Plasmidpräparation folgt ist die Transfektion, also die Einfügung der Plasmid DNA in eukaryotische Zellen. Transfektionen werden häufig mit dem Ziel gemacht die Strukturen von Zellen und Geweben mit Reporterproteinen abzubilden, wie zum Beispiel mit diesem Plasmid was Neuronen in diesen Bildern einfärbt.

Manchmal können Plasmids, die durch mehrere Aufreinigungsschritte isoliert worden sind, in die gleichen Bakterien eingefügt werden und durch die Produktion der kodierten Enzyme ganze biosynthetische Pfade reproduzieren. Das Endresultat ist die Herstellung eines komplexen Stoffes, wie zum Beispiel eines Antibiotikums, wie hier zu sehen ist.

Aufgereinigte Plasmide können auch in Bakterien eingefügt werden, um große Mengen eines Proteins zu produzieren, das durch das Plasmid kodiert wird. Hier sieht man wie Bakterien homogenisiert und lysiert werden, bevor Zielproteine durch ein Verfahren das man Affinitätsaufreinigung nennt, isoliert werden. Die purifizierten Proteine können dann kristallisiert werden, um ihre Struktur zu bestimmen.

Das war die Einführung in die Plasmidpräparation von JoVE. In diesem Video haben wir die grundlegenden Prinzipien, die hinter diese Methode stehen behandelt. Wir haben außerdem eine Schritt-für-Schritt Anleitung gegeben und einige nützliche Anwendungen diskutiert. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

Plasmids are circular, extra chromosomal, DNA molecules and in molecular biology they act as carriers, or vectors, for a specific DNA fragment. Bacteria are used to replicate plasmids, so that your DNA of interest is mass-produced. The process by which researchers obtain plasmids from bacteria is called plasmid purification, which will be explained in this video.

Obviously, plasmid purification involves purifying plasmids, but what does that mean exactly? To purify plasmids, they must be isolated from the bacterial chromosome, proteins, the bacterial membrane, and bacterial ribosomes.

Though many different kits exist for purifying plasmids, the basic principle behind plasmid purification remains the same for all. First, the selected bacterial colony is grown in an appropriate culture media that contains the correct antibiotics. Thanks to an antibiotic resistance gene, encoded by the plasmid, only bacteria containing the plasmid will grow in this media. The bacteria are harvested and lysed under a high pH. The pH is neutralized, salt is added, and then the mixture is spun down to remove debris and genomic DNA.

Neutralized cell lysate is added onto a silica column. Plasmid DNA is believed to adhere to the column via a mechanism called anion exchange, where DNA, a strong anion, binds to the negatively charged column via a cation salt bridge. Other material from the lysate, such as proteins, are washed through the column with high salt buffers. Finally, purified plasmid is released from the column when a low salt buffer is added disrupting the salt bridge.

For this procedure a lab coat, disposable gloves and protective goggles should be worn.

The bacterial cultures, which are transformed with the desired plasmid DNA, should be grown overnight in growth media with appropriate antibiotic in a 37°C shaking incubator.

The next day, the bacteria culture is pelleted by centrifugation and the supernatant is removed. The remaining pellet is resuspended in lysis buffer.

Once resuspended, bacteria can be transferred to a smaller tube where lysis buffer is added. Lysis buffer has a high pH and contains detergents, such as sodium dodecyl sulfate, which disrupt the bacterial membranes, thereby lysing the bacteria. The solution will turn cloudy with the addition of the lysis buffer and after mixing the solution becomes more clear. The mixture should not be vortexed due to the possibility of shearing, or breaking apart, genomic DNA, which could then contaminate plasmid DNA purification.

Then, neutralization buffer is added to neutralize the alkaline conditions and lower the pH. With gentle mixing genomic DNA as well as any proteins bound to it will precipitate, while plasmid DNA will stay in solution. Once again avoid vortexing, so as your plasmids are free of genomic DNA contamination.

The mixture is then centrifuged and the genomic DNA/protein precipitate is pelleted. The supernatant contains the plasmid DNA as well as soluble proteins.

This supernatant is placed onto the column by decanting, a fancy name for pouring it off, or pipetting. The pellet can be discarded.

Next, high salt washing buffer passes through the column while the DNA remains bound to the silica. Repeated washing steps with high salt buffer removes endonucleases, RNA, proteins, dyes, and low-molecular weight impurities. The flow-through of the wash steps should be discarded. After the final washing step make sure the filter is completely dry without any buffer remaining. The plasmid DNA is still located on the filter.

The plasmid DNA is eluted with sterile water or an elution buffer. The DNA is readily available for immediate use in a wide range of applications.

There are a number of ways to verify the purity of plasmids after purification. A spectrometer can be used to compare absorbance at different wavelengths to determine the concentration of plasmid DNA. An agarose gel analysis of the purified plasmid can determine if the plasmid is the correct size and there are no contaminants. This step ensures there is no genomic DNA contamination and the plasmid was not modified in bacteria.

The plasmid purification procedure can be modified to accommodate different plasmid sizes, copy number, culture volume, and can include different equipment for the binding, washing, and elution steps. Yield happens to be one of the most prominent distinctions between plasmid preparations and they are often divided into the minipreparation, or miniprep, the midiprep, a maxiprep, and a megaprep depending on the yield desired.

In terms of downstream applications, one procedure that commonly follows plasmid purification is transfection, which involves the introduction of plasmid DNA into eukaryotic cells. Often the goal of a transfection experiment is to visualize the structure of cells and tissues with reporter proteins, such as those labeling the neurons in the images you see here.

Sometimes multiple plasmids purified by several purification preps can be introduced into the same bacteria, thereby reproducing an entire biosynthetic pathway through the production of a number of enzymes encoded by the plasmids. The end result is the manufacturing of a complex compound, like the antibiotic you see here, by the cell.

Purified plasmids may be reintroduced into bacteria, in order generate large amounts of protein encoded by the plasmid. Here you see bacterial cells being homogenized and lysed before a technique called affinity purification can be performed to isolate the target protein. Purified protein is crystallized and its structure then identified.

You’ve just watched JoVE’s introduction to plasmid purification. In this video we discussed the basic principles behind this method, its step by step description, and a handful of applications of your plasmid prep. As always, thanks for watching!