Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomoleküle wie DNA und Proteine in wässrigen Puffern in Echtzeit mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst Biomoleküle für die Abbildung vorbereitet werden. Als nächstes wird das Rasterkraftmikroskop aufgebaut und eine FM-Cantilever-Sonde positioniert.

Die Probenoberfläche und die interessierenden Biomoleküle werden dann abgebildet und analysiert. Letztendlich können durch Rasterkraftmikroskopie Ergebnisse erzielt werden, die die allgemeine Größe, Menge und Organisation von DNA und Proteinen sowie heterogene biomolekulare Komplexe unter gepufferten Bedingungen zeigen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der molekularen Chaperone zu beantworten, wie z.B. die STO-Geometrie von Chaperonen und Cos-Chaperonen für einen Klienten.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von Vorteil, da die Schritte zur Vorbereitung der A FM- und Kent-Hebelsonde möglicherweise aufgrund der Feinheiten, die mit ihrer physischen Manipulation verbunden sind, aus gedruckten Anweisungen schwer zu erlernen sind. Morgan Shannon und John Gertz, zwei Studenten aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Zunächst isolieren Sie die Protein- oder DNA-Moleküle, die abgebildet werden sollen, und suspendieren sie in einem wässrigen Puffer. Nachdem Sie die Reinheit der Probe bestätigt haben, inkubieren Sie sie in einem FM-Absorptionspuffer auf Eis, um die Adhärenz der Probe an Glimmer zu fördern.

Verwenden Sie für Proteinproben einen 10-Millimolar-Heaps-Puffer. Und für DNAA-Magnesium-haltiger Puffer, der aus 10 Millimolar Tris, pH 7,5 10 Millimolar Natriumchlorid besteht, ist zwei Millimolare Magnesiumchlorid geeignet, um die A FM-Sonde zu montieren. Setzen Sie den Halterung für die Flüssigkeitszellensonde auf die entsprechende Dockingstation für die Cantilever-Installation.

Suchen Sie den langen, dicken Ausleger der scharfen Nitrid-Hebelsonde, die für die Bildgebung verwendet werden soll. Schieben Sie es vorsichtig in den Sondenhalter der Flüssigkeitszelle und stellen Sie sicher, dass die Spitze aufrecht bleibt. Untersuchen Sie anschließend den Ausleger unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass er intakt ist und richtig in der Sondenhalterung der Flüssigzelle sitzt.

Entfernen Sie dann vorsichtig den FM-Kopf von der Schwalbenschwanzbaugruppe des Instruments, indem Sie die Klemmschraube des Neuralkopfes festziehen. Drehen Sie den a FM-Kopf um und drücken Sie den Halter der Flüssigkeitszellensonde fest auf die vier Stifte an der Basis des a FM-Kopfes. Setzen Sie abschließend den FM-Kopf vorsichtig wieder in das Instrument der Leitwerksmontage ein

Um das FM vor der Bildgebung von Proben weiter vorzubereiten, bewegen Sie die Knöpfe des integrierten Lichtmikroskops, um die Cantilever-Spitze zu lokalisieren, und stellen Sie die Aufwärts- und Abwärtspfeile des Optik-Controllers in der Software ein, um die Cantilever-Spitze in den Fokus zu bringen. Verwenden Sie die Lasereinstellknöpfe, um den Laser auf die Cantilever-Spitze auszurichten. Dies ist einer der technisch anspruchsvollsten Schritte im Protokoll: Die Positionierung erfolgt manuell und erfordert eine präzise Einstellung des Knopfes.

Eine sorgfältige Überwachung des Lasers im Reflexionsfleck und im Beleuchtungsfleck erhöht die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Ausrichtung. Stellen Sie als Nächstes die Knöpfe des Fotodetektors an einem FM-Kopf ein, um den Fotodetektor zu zentrieren. Legen Sie ein frisch gespaltenes MICA-Blatt, das an einer FM-Probenscheibe aus Metall befestigt ist, auf den magnetisierten Probenhalter auf die A FM-Halterplatte.

Drehen Sie die FM-Halterplatte, so dass die Probenscheibe für die erste Bildgebung positioniert ist. Verwenden Sie die Fokussierflächensteuerung der Gerätesoftware, um den FM-Kopf nach unten in Richtung der Oberfläche der MICA-Probenscheibe zu bewegen. Bis deutliche Merkmale auf der MICA-Oberfläche oder die Spitzenreflexion scharf sind, wählen Sie das Tune-Symbol in der Instrumentensoftware und stimmen Sie den Cantilever.

Die Resonanzfrequenz der empfohlenen MSNL- oder SNL-Sonden beträgt 20 bis 60 Kilohertz. Wählen Sie einen Peak-Offset von 5 %, um die MICA-Probe abzubilden. Befestigen Sie zunächst die Sonde an der MICA-Oberfläche und stellen Sie die anfängliche Scangröße auf 10 Mikrometer und die Scanrate auf ein Hertz ein.

Erfassen Sie vollständige Scanbilder des 10-Mikrometer-Feldes. Verringern Sie dann die Scangröße auf fünf Ein- und 0,5 Mikrometer und erfassen Sie vollständige Bilder jedes Feldes. Lösen Sie die Sonde, indem Sie einmal auf das Entriegelungssymbol in der Gerätesoftware klicken.

Um die interessierenden Biomoleküle abzubilden, mischen Sie fünf Mikroliter der vorbereiteten Probe mit 45 Mikrolitern frischem Absorptionspuffer. Geben Sie vorsichtig 50 Mikroliter der 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Biomolekül enthaltenden Lösung direkt auf die Oberfläche der Intensivstationen. Machen Sie eine Pause von fünf Minuten, damit die Biomoleküle in der Probe an der Micah-Oberfläche haften können.

Pipettieren Sie dann weitere 50 bis 100 Mikroliter Absorptionspuffer in den Sondenhalter der Flüssigzelle. Achten Sie darauf, die Sonde, einen FM-Kopf oder eine Mikrokamera nicht mit der Pipettenspitze zu berühren, stellen Sie den Fotodetektor neu ein und richten Sie den Laser bei Bedarf wieder auf den Ausleger aus. Verwenden Sie dann die Gerätesoftware, um die Sonde wieder einzurasten.

Erhöhen Sie die Scangröße, um interessante Bereiche zu identifizieren. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie mehrmals das Entnahmesymbol in der Gerätesoftware, um die Sonde zu lösen. Verwenden Sie abschließend destilliertes Wasser, um den Flüssigzellensondenhalter und die Probenscheibe gründlich zu spülen.

Dann probieren Sie es mit Druckluft aus. Hier sehen Sie ein Beispiel für ein A FM-Bild. Das Glimmersubstrat bietet eine molekular flache Oberfläche, auf der DNA und Protein aufgenommen werden können.

Die Bildgebung von MICA vor Biomolekülproben ermöglicht eine Negativkontrolle und eine Beurteilung des Bildrauschens. Es bietet auch ein gewisses Maß an Sicherheit, dass der Cantilever richtig abgestimmt ist und die nachfolgende Probenbildgebung erfolgreich ist. Doppelsträngige Plasma-DNA, die vermutlich supergewickelt ist, ist leicht an ihrem asymmetrischen Erscheinungsbild und ihrer gleichmäßigen Ablagerung auf dem bisher unauffälligen Micah-Substrat zu erkennen.

Proteinkomplexe mit diskreten Partikelgrößen sind ebenfalls eindeutig vom Micah-Substrat unterscheidbar. Unterschiede in der Partikelgröße deuten auf die Heterogenität der Probe hin und können für die Approximation von Proteinen, komplexer stoischer Geometrie oder biochemischer Aktivität nützlich sein. Die allgemeine diagonale Form und konsistente Ausrichtung der beobachteten Proteinpartikel.

Hier ist ein bildgebendes Artefakt, da Proteine erwartungsgemäß zufällig auf dem Micah-Substrat orientiert sind. Mögliche Ursachen für das beobachtete Artefakt oder eine physikalische Spitzenanomalie oder eine FM-Bildgebung bei zwei schnellen Scanraten, während die Spitzenfaltung absolute Längenmessberechnungen in der X- und Y-Achse, Höhenmessung oder Z-Achse verhindert, und relative X- und Y-Messungen können dennoch nützlich sein, um die biophysikalischen Eigenschaften der abgebildeten Biomoleküle abzuschätzen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Ausleger genau abzustimmen und den Fotodetektor auszurichten.

Andere Schritte, einschließlich der Verwendung einer Pufferaustauschflüssigkeitszelle, können hinzugefügt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Fähigkeit molekularer Chaperone, die Freisetzung von Steroidrezeptoren aus ihren DNA-Reaktionselementen zu beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie DNA-Proteine und biomolekulare Komplexe mithilfe der Rasterkraftmikroskopie unter gepufferten Bedingungen abgebildet werden können.