Name: Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von DNA-Protein-Komplexen mit Rasterkraftmikroskopie in wässrigen Puffern kennen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Bildgebung für Studien zu molekularen Chaperonen.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants GM086822 finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. of Washington Nanotechnologie User Facility (NTUF)) und Andrea Slade (Bruker AXS) für ihre technische Unterstützung durch Experten. DNA AFM wurde an der Univ durchgeführt. Washington NTUF, ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network. Die 2xGal4-2xGRE-luciferease Plasmid wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Dr. Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco) zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung DNA-und Protein-Proben, die abgebildet frei von Verunreinigungen sein <ol><li> Isolieren von Biomolekülen zu sein bebildert und in einem geeigneten wässrigen Puffer. Proteine, die abgebildet werden gereinigt kann die Verwendung von Flüssig-Chromatographie 6, gefolgt Immunadsorption durch die Entfernung der Antikörper-und Pellet 1,2 oder Profinity eXact Reinigung und Entfernung tag 7 (Abbildung 2A). Isolieren Sie DNA-Moleküle durch Miniprep Reinigung (Abbildung 2B) abgebildet werden. </li><li> Bestätigen Zusammensetzung und Reinheit von Protein-Proben, die abgebildet mit SDS-PAGE und Western Blot werden. Für die DNA, bestätigen Sequenz und Reinheit durch Ausfüllen eines Restriktionsverdau und Gelelektrophorese. </li><li> Inkubieren Proben in einem AFM Adsorption Puffer, um die Einhaltung der Probe auf Glimmer zu fördern. Für Protein-Proben können 10 mM HEPES-Puffer verwendet werden. Zusätzliche Low-Ionenstärke Salzen oder anderen Cofaktoren können ebenfalls hinzugefügt werden. Für die DNA-Proben umfassen ein zweiwertiges Kation (z. B. Mg 2 + oder Ni 2 +), um die Adsorption der Glimmer-Substrat zu fördern. Ein geeignetes Mg 2 +-haltigem Puffer für DNA ist 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Eine Alternative Ni 2 +-Puffer 10 mM HEPES, pH 6,8, 10 mM NiCl 2. </li><li> Verdünnen Sie die Probe auf eine Konzentration von 5 ug / ml in der Adsorption Puffer. Vorsichtig mischen. Auf Eis, während das Mikroskop vorbereitet wird. </li></ol> 2. Montage AFM-Sonde <ol><li> Legen Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter auf den entsprechenden freitragenden Einbau-Dockingstation. </li><li> Suchen Sie den langen, dicken Cantilevers (bezeichnet als 'B' Freischwinger) der scharfen Nitrid Hebel (SNL) Sonde für die Bildgebung verwendet werden. Sorgfältig übertragen, um die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter, sicherzustellen, dass die Spitze aufrecht bleibt. Technischer Hinweis: Besondere Vorsicht bezahlt werden muss, während die Sonde auf der Durchreise sind, und lassen Sie sie von jeder beliebigen Höhe kann zu Schäden oder Zerstörung der Freischwinger oder Spitze. Ein microlever SNL (MSNL) Sonde kann als Alternative zu den SNL-Sonde verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die Sonde Halter aus der Docking-Station und untersuchen die Cantilever unter einem Lichtmikroskop zu gewährleisten, ist es intakt und ordnungsgemäß in die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter sitzt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die AFM Kopf aus dem Instrument Schwalbenschwanz Montage durch Anziehen der Rändelschraube Klemmschraube. Technischer Hinweis: Besondere Vorsicht bezahlt werden muss, während die Manipulation der AFM Kopf, und lassen Sie sie von selbst eine kurze Strecke (z. B. wenn sie nicht richtig in den Schwalbenschwanz Montage sitzend) kann zu erheblichen Schäden. </li><li> Kehren Sie die AFM Kopf und fest drücken Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter auf die vier Stifte an der Unterseite des AFM Kopf. Vorsichtig wieder die AFM Kopf in das Gerät Schwalbenschwanz Montage. Lassen Sie die Rändelschraube Klemmschraube an die AFM Kopf in das Gerät zu befestigen. </li></ol> 3. Locating Cantileverspitze, Ausrichten Laser und Einstellen Photodetektor <ol><li> Mit dem AFM Instrument Software, suchen Sie die Cantilever-Spitze, indem Sie die Knöpfe der Onboard-Lichtmikroskop. Passen Sie die Beleuchtung des Mikroskops, wenn nötig bis zur Spitze Identifikation zu verbessern. Bringen Sie das Ende des Auslegers Spitze in der Nähe des Fadenkreuzes auf der Geräte-Software angezeigt. </li><li> Bringen Sie die Cantilever-Spitze in den Fokus, indem die oben und unten Pfeile der Optik-Controller an die Software. Verwenden Sie langsam (S) oder medium (M) Geschwindigkeit, während die Anpassung der Optik. </li><li> Richten Sie den Laser auf die Cantilever-Spitze mit dem Laser Einstellknöpfe. Bewegen Sie die Einstellknöpfe, bis der rote Laser in das weiße Ausleuchtung vor Ort. Trace entlang der Ausleger mit einem Zick-Zack-Muster, bis der Laser auf der Cantilever-Spitze positioniert ist. Wenn sie richtig ausgerichtet ist, wird eine starke Reflexion vor Ort in die Frontscheibe des AFM Kopf erscheinen. </li><li> Zentrum der Photodetektor durch Anpassung der Photodetektor Noppen auf der AFM Kopf. Dies wird der Laserpunkt in das Fadenkreuz der Photodetektor Anzeige der Geräte-Software ausrichten. Das beobachtete Signal Summe sollte etwa 4-6 werden. </li></ol> 4. Positioning AFM Kopf-und Tuning-Cantilever <ol><li> Legen Sie eine frisch gespaltene Blatt Glimmer an einem Metall-AFM Probe-Disc auf die magnetisierten Probenhalter Spitze des AFM Halteplatte. Dieses Setup wird verwendet, um die AFM Kopf vor der Abbildung der DNA-oder Protein-Probe in Schritt 1 vorbereitet Position sein. <ol><li> Technischer Hinweis: Die magnetisierten Probenhalter und flüssige Zelle Sondenhalter sind dicker als andere Probe Befestigungsmechanismen und Sondenhalterungen. Wenn es derzeit keine ausreichenden Abstand zwischen den Glimmer-Probenhalter Montage-und AFM Kopf, bewegen Sie die AFM Kopf hoch, indem Sie den Rücktritt Symbol auf der Geräte-Software mehrere Male. </li></ol></li><li> Drehen Sie das AFM Halteplatte so die Probe Disc für das erste bildgebende positioniert ist. Sicherstellen, dass die Glimmer-Substrat unter dem AFM Kopf zentriert ist. </li><li> Bewegen Sie die AFM Kopf nach unten in Richtung derOberfläche der Glimmer-Probenteller mit dem Schwerpunkt Oberfläche Steuerung der Geräte-Software. Wählen Sie das Medium (M) Geschwindigkeit auf der Z-Motor, und weiter in Richtung der Oberfläche, bis die AFM Spitze beträgt ca. 2 mm über dem Glimmer. Zu diesem Zeitpunkt, um mit dem langsamen (S) Z Motordrehzahl, um abrupte Kontakt zwischen der Sonde und der Oberfläche (im Folgenden als Absturz der Spitze) zu vermeiden wechseln. </li><li> Fahren Sie mit der Sonde näher an den Glimmersubstrat Oberfläche zu bewegen, bis deutliche Merkmale auf der Glimmer-Oberfläche oder die Spitze Reflexion im Mittelpunkt stehen. Umschalten zwischen Oberfläche und Spitze Reflexion Brennebenen mit dem "Fokus auf:" Symbol aus der Gerätesoftware. </li><li> Wählen Sie die Melodie Symbol aus der Geräte-Software und stellen Sie den Ausleger. Die Resonanzfrequenz der empfohlenen SNL und MSNL Cantileversonden ist 20-60 kHz. Wählen Sie einen 5% peak ausgeglichen. Technischer Hinweis: Ausreichende Cantilever-Tuning ist für eine ausreichende Probe Bildgebung unverzichtbar. </li></ol> 5. Imaging Glimmer Probenoberfläche <ol><li> Engage der Sonde auf die Glimmer-Oberfläche. Set ersten Scan Größe bis 10 um und Abtastrate bis 1 Hz. Integral gewinnen und Proportionalverstärkung kann zunächst auf 0,2 und 0,4 eingestellt werden, bzw.. Passen Sie Gewinne als erforderlich, um Spuren haben und verfolgen Scans etwa überlappen. Eine Verringerung der Amplitude Sollwert erhöht sich die Wechselwirkung zwischen der Sonde und der Glimmer und sicherzustellen Engagement. </li><li> Erfassen kompletter Scan Bilder des 10 pm Feld. Abnahme Scanformat bis 5, 1 und 0,5 mu m und Capture abzuschließen Bilder der einzelnen Felder. Passen Gewinne und Abtastrate wie nötig. Die Aufnahme von Bildern der Glimmer-Oberfläche bietet eine Grundlage für den Vergleich der DNA-und Protein-haltigen Proben. </li><li> Lösen Sie die Sonde mit einem einfachen Klick auf das Lösen Symbol auf der Geräte-Software. </li></ol> 6. Imaging von Biomolekülen von Interesse <ol><li> Vorsichtig mischen die DNA-oder Protein-Probe in Schritt 1 vorbereitet und bereiten Sie es auf der abgebildeten Glimmer-Oberfläche zu laden. Mix 5 ul der vorbereiteten Probe mit 45 ml frisches Adsorption Puffer (Endprobe Konzentration = 0,5 ug / ml). </li><li> Vorsichtig 50 ul der 0,5 ug / ml Biomolekül-haltigen Lösung direkt auf die Glimmer-Oberfläche. Tun Sie dies, ohne die Sonde oder AFM Kopf und sorgen für die Probelösung (aber nicht Pipettenspitze) in Kontakt mit der Sonde. </li><li> Pause 5 Minuten, damit die Biomoleküle in der Probe auf die Glimmer-Oberfläche haften. </li><li> Am Ende der 5 Minuten, pipet eine zusätzliche 50-100 &amp;mgr; l der Adsorption Puffer in die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter darauf achten nicht zu berühren die Sonde, AFM Kopf, oder Glimmer mit der Pipettenspitze. Dies bildet einen Meniskus und damit für AFM-Tapping-Modus Bildgebung in der Flüssigkeit. Abbildung 3 zeigt die endgültige Anordnung der Flüssigkeit Zelle, Freischwinger, Probe, Probenhalterung und Meniskus. </li><li> Danach ist der Photodetektor und richten Sie den Laser auf die Cantilever wie nötig. Technischer Hinweis: Zum Betrachten der Sondenspitze und Laser-Ausrichtung wird durch das Beugungsmuster, indem Probenpuffer in den Sondenhalter verursacht kompliziert. Manuell neu einstellen zu dem Ausleger, wenn nötig. </li><li> Re-greifen die Sonde mit der Gerätesoftware. Einstellen der vertikalen Auslenkung, integrale Verstärkung und Proportionalverstärkung wie nötig. Dies wird den Prozess der Re-Imaging Abschnitt von Glimmer gescannt unmittelbar vor Zugabe Probe und Erfassen von Bildern. </li><li> Erhöhen Scangröße (500 nm-10 um) in Regionen von Interesse zu identifizieren. Zoom-in und reduzieren Abtastrate bis 0,5 Hz bis Bildauflösung zu verbessern </li><li> Sobald Imaging abgeschlossen ist, lösen Sie die Sonde durch die Auswahl zurückzutreten Symbol auf der Geräte-Software mehrere Male. Ausreichend Freiraum zwischen der AFM Spitze und Probe-Disc vor der Demontage des flüssigen Zell-oder Probe-Disc. </li><li> Spülen Sie die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter und Probenteller mit destilliertem Wasser, Salz die Bildung von Kristallen als Rest-Adsorption Puffer verdunstet zu verhindern. Dry mit Druckluft. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für AFM-Aufnahmen sind in Abbildung 4 dargestellt. Mica-Substrat (A) bietet eine molekular flachen Oberfläche, auf die DNA-und Protein adsorbieren kann. Imaging Glimmer vor Biomolekül Proben eine negative Kontrolle und Beurteilung der Bildgebung Lärm. Es bietet auch ein Maß an Gewissheit, dass der Ausleger richtig eingestellt ist und die anschließende Probe Bildgebung erfolgreich sein wird. Doppelsträngige Plasmid-DNA (B, D), mutmaßlich supercoiled, ist leicht durch seine asymmetrische Erscheinungsbild und einheitliche Ablage auf dem zuvor unauffällig Glimmersubstrat identifiziert. Protein-Komplexe von diskreten Partikelgrößen (C, E) sind ebenfalls eindeutig unterscheidbar von den Glimmer-Substrat. Partikelgröße Unterschiede zeigen Probe Heterogenität und kann nützlich sein, auf eine Angleichung Protein-Komplex Stöchiometrie oder biochemische Aktivität. Die allgemeine diagonal Form und die konsequente Ausrichtung der Protein Partikel in Panel C beobachtet ist ein bildgebendes Artefakt, wie Proteine ​​erwartungsgemäß wäre auf dem Glimmer-Substrat orientiert nach dem Zufallsprinzip. Mögliche Ursachen der beobachteten Artefakt ist ein physischer Spitze Anomalie oder AFM in zu schnell von einer Scan-Rate. Während Spitze Faltung (siehe Abbildung 1B) verhindert absolute Längenmessung Berechnungen in der x-und y-Achsen, Höhenmessung (z-Achse) und die relative x-und y-Messungen kann dennoch nützlich für die Abschätzung biophysikalischen Eigenschaften der abgebildeten Biomolekülen. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Tapping-Modus Rasterkraftmikroskopie (AFM). A, das Mikroskop. Am Ende des Auslegers ist eine scharfe Spitze, die bis schwingt auf und ab, während sie über die Oberfläche eines Glimmer-Substrat-Scans, um die biomolekularen Komplexen adsorbieren. Da der Scanner bewegt sich in x-und y-Richtung, wird ein Laserstrahl von der Rückseite des Cantilevers auf eine Position Sensitive Photodioden-Detektor reflektiert wird, um die vertikale (z) Abstand zur Spitze bewegt, wie es über die biomolekularen Komplexen auf den sitzenden Pässe Karte Glimmer. B. Verzerrung des Bildes in x-und y-Richtung durch die Spitze Faltung verursacht. Die nominelle Radius eines herkömmlichen Siliciumnitrid-Spitze ist größer als die Partikel, die abgebildet werden, und der Rand der Spitze in Kontakt mit der Probe beim Durchqueren der Oberfläche. Tipp Faltungsergebnisse in der abgebildeten Partikel erscheinen größer in der x-und y-Richtung, nicht aber die z-Richtung. Dieser Effekt kann durch die Verwendung von Spitzen mit einem kleineren nominal Spitzenradius minimiert werden. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Illustration der immunoadsorbed Protein-und DNA Probenvorbereitung. A, Veröffentlichung immunoadsorbed GR • Hsp70-Protein-Komplex aus dem monoklonalen Antikörper (mAb)-Protein A-Sepharose (PAS) Pellets. Inkubation des immunopellet mit einem Peptid, das die mAb Epitop erleichtert die Freigabe der GR • Hsp70-Protein-Komplex aus dem Pellet, so dass der Komplex aus dem Überstand und visualisiert durch AFM gesammelt werden. B, erfordert Vorbereitung der DNA für die AFM die Verwendung eines zweiwertigen Kations Adsorption Puffer. Die zweiwertigen Kations erhöht die Affinität der DNA für die Glimmer-Substrat. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Final Anordnung der AFM Spitze, flüssige Zelle Sondenhalter, Probe, Probenhalter und Puffer Meniskus. A, darauf zu achten, bei der Hinterlegung Probe und zusätzlichen Puffer auf die Glimmer-Substrat, um körperlichen Kontakt zwischen der Pipettenspitze und AFM Kopf, Flüssigkeit nennen, und Glimmer-Substrat zu vermeiden. B, Vergrößerung von A. Der Puffer Meniskus reicht von der Objektplatte, um die Flüssigkeit Zelle Sondenhalter. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Atomic Force Aufnahmen von Glimmer-Substrat (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease Plasmid-DNA 8 (B, D) und GR • Hsp70-Protein-Komplexe (C, E) in einer gepufferten Lösung. Mica dient als Kontrolle Bild mit der Visualisierung von DNA und Protein zu vergleichen. GR • Hsp70-Protein-Komplexe wurden durch Immunadsorption von GR mit hsp70 und dann aus dem Antikörper-Bead-Pellet freigesetzt mit einem mAb konkurrierenden Antikörper (dargestellt in Abbildung 2A) grundiert vorbereitet. DNA wurde durch konventionelle Plasmid Miniprep vorbereitet. Panels A, B und C ein Äquivalent Vergrößerung (Maßstab = 200 nm) sind, wie auch Panels D und E (Maßstab = 40 nm).

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AFM bietet eine einzigartige mikroskopischen Technik in der Lage Bildgebung einzelnen unbeschichteten Biomolekülen in wässrigen und nahezu physiologischen gepufferten Lösungen in Echtzeit. Dies ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Proteine ​​und DNA-Moleküle, sowie Multiproteinkomplexen-und Protein-DNA-Komplexe. Imaging makromolekularen Teilchen mit AFM kann nützlich sein für die Beurteilung der Probe Homogenität und zur Ermittlung der physikalischen Anordnung der Bestandteile der beobachteten Teilchen. Dieser Ansatz der Beobachtung einzelner makromolekulare Partikel können eine sinnvolle Ergänzung sein zu herkömmlichen biochemischen Techniken, wie Immunpräzipitationsassays, Polyacrylamidgelelektrophorese und Size-Exclusion-Säulenchromatographie, die erhebliche summative Daten, die den 10 3 -10 11 einzelnen biomolekularen Komplexen von Interesse anwesend bieten in einer Probe. Die Erforschung Multiproteinkomplex Stöchiometrie biomolekularen Wechselwirkungen und Cofaktor Anforderungen können alle untersuchten mittels AFM werden. Die hier vorgestellte Methode lässt sich an spezifischen biophysikalischen Fragestellungen von Interesse aufnehmen werden. Zum Beispiel mit einer Flüssigkeit Zelle Sondenhalter der Lage, den Austausch von Puffer, wird es möglich sein, Assay-Cofaktor für Protein-Komplexbildung. DNA-Protein-Baugruppen gebildet und getrennt werden, während sie abgebildet in near-real-time und sogar. DNA kann mit spezifischen Sequenzen von Interesse (zB ein mutmaßliches Response-Elementen oder neuartige Protein-Bindung Sequenz), mit der Hypothese bindendes Protein gemischt erzeugt werden, und abgebildet, einen direkten Nachweis von intermolekularen Wechselwirkungen liefern. Tapping Mode-AFM-Bildgebung ist wesentlich weniger kompliziert, wenn trockene Proben statt Proben in wässrigen Lösungen, und lineare DNA steht und geschlossenen Kreis DNA-Plasmide haben beide auf diese Weise 3,9 abgebildet worden sind verwendet. Die hier vorgestellte Methode nutzt Proben in gepufferten Lösungen, um eine physiologische Bildgebung Umfeld zu schaffen. Andere bemerkenswerte Methoden der Bildgebung Proteine ​​sollten ebenfalls berücksichtigt werden, einschließlich Nahfeld Infrarot-Mikroskopie 10. Die komplementäre Nutzung der Immunadsorption in Gemahlin mit AFM bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von Protein-Komplexe, mit gut etablierten biochemischen Techniken, und dann visualisieren folgende Entlassung aus dem immunoadsorbing Antikörper-Bead-Pellet. Zum Beispiel hat immunoadsorbed GR für seine Assoziation mit der molekularen Chaperon-Protein hsp70 1 sowie die Dynein Motorprotein untersucht 2 mit diesem Ansatz, um komplexe Größe und Stöchiometrien zu schätzen. Partikelgröße und biophysikalischen Eigenschaften (zB Festigkeit) haben sich als nützlich erwiesen bei der Ermittlung der Identität der Biomoleküle in AFM abgebildet Proben 11,12 beobachtet. Es ist auch möglich, Biomolekül Identität durch die Zugabe von einem interagierenden Biomolekül (zB ein Ligand oder monoklonale Antikörper), die zu seinem Ziel und verursachen eine Teilchengröße erhöhen binden würde, wenn das Ziel-Biomolekül vorhanden ist zu bestätigen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Dimension Fluidzelle </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Sharp-Nitrid-Hebel (SNL) Siliziumnitrid AFM-Sonde </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever scharfe Nitrid Hebel (MSNL) Siliziumnitrid AFM-Sonde </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM Gerätesoftware </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Metall AFM Objektplatten </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grade V1 Mica Discs, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualisierung von rekombinanten dna-und protein-komplexe mit atomic force microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic Force Microscopy (AFM) ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Proteine, DNA-Moleküle, Protein-Protein-Komplexe, und DNA-Protein-Komplexen. Am Ende des Mikroskops Freischwinger ist ein Nano-Sonde, die Traversen Bildbereiche von Nanometern bis Mikrometern, die Messung der Höhe von Makromolekülen ruht auf der Substratoberfläche zu einem bestimmten Zeitpunkt. Elektrostatische Kräfte verursachen Proteine, Lipide und Nukleinsäuren zu locker an das Substrat in zufälligen Orientierungen legen und erlauben Bildgebung. Die generierten Daten ähneln einer topographischen Karte, wo die Makromoleküle als dreidimensionale Teilchen diskrete Größen (Abbildung 1) 1,2 lösen. Tapping-Modus AFM beinhaltet die wiederholte Schwingung des Cantilevers, die Bildgebung des relativ weichen Biomaterialien wie DNA und Proteine ​​ermöglicht. Einer der bemerkenswertesten Vorteile von AFM gegenüber anderen nanoskaligen Mikroskopie-Techniken ist die relative Anpassbarkeit an individuelle Proteine ​​und makromolekulare Komplexe in wässrigen Puffern, darunter nahezu physiologischen gepufferten Bedingungen, in Echtzeit und ohne Flecken oder Beschichtung der Probe, die abgebildet werden zu visualisieren. Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Darstellung von DNA und einer immunoadsorbed Transkriptionsfaktor (dh den Glucocorticoid-Rezeptor, GR) in gepufferter Lösung (Abbildung 2). Immunoadsorbed Proteinen und Protein-Komplexe können aus den immunoadsorbing Antikörper-Bead-Pellet durch den Wettbewerb mit dem Antikörper-Epitop und dann abgebildet (Abbildung 2A) getrennt werden. Dies ermöglicht für die biochemische Manipulation von Biomolekülen von Interesse vor Bildgebung. Nach der Reinigung kann die DNA und Proteinen gemischt und die resultierende Interaktion Komplex kann auch abgebildet werden. Die Bindung von DNA auf Glimmer erfordert ein zweiwertiges Kation 3, wie Ni 2 + oder Mg 2 +, die Probenpuffer hinzugefügt werden noch werden halten Protein-Aktivität. Mit einem ähnlichen Ansatz hat AFM verwendet worden, um einzelne Enzyme, darunter RNA-Polymerase 4 und ein Reparatur-Enzym 5, gebunden, einzelne DNA-Stränge zu visualisieren. Diese Experimente liefern wichtige Einblicke in die Protein-Protein-und DNA-Protein-Interaktionen biophysikalischen statt auf der molekularen Ebene. Imaging einzelnen makromolekularen Teilchen mit AFM kann nützlich sein für die Bestimmung Teilchen Homogenität und zur Ermittlung der physikalischen Anordnung der Bestandteile der abgebildeten Partikel. Während die vorliegende Methode zur Visualisierung von GR-Chaperon-Protein-Komplexe 1,2 und DNA-Stränge, auf die die GR binden können entwickelt wurde, kann es im Großen und Ganzen zu bildgebenden DNA-und Protein-Proben angewandt werden aus einer Vielzahl von Quellen.

A-Tapping-Modus Rasterkraftmikroskop (AFM)-Methode zur Visualisierung von Plasmid-DNA, cytoplasmatische Proteine ​​und DNA-Protein-Komplexen beschrieben. Das Verfahren umfasst das alternative Ansätze zur Vorbereitung der Proben für AFM folgenden biochemischen Manipulation. DNA mit spezifischen Protein interagiert Regionen sind in der Nähe-physiologischen Puffer Bedingungen beobachtet.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ermöglicht die Visualisierung einzelner Proteine, DNA-Moleküle, Protein-Protein-Komplexe und DNA-Protein-Komplexe. Auf ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biomoleküle wie DNA und Proteine in wässrigen Puffern in Echtzeit mittels Rasterkraftmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die zu bildgebenden Biomoleküle vorbereitet werden. Anschließend wird das Rasterkraftmikroskop eingerichtet und eine FM-Kantilever-Sonde positioniert.Die Probenoberfläche und die interessierenden Biomoleküle werden anschließend abgebildet und analysiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die unter Pufferbedingungen mittels Rasterkraftmikroskopie die allgemeine Größe, Menge und Organisation von DNA und Proteinen sowie heterogener biomolekularer Komplexe zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der molekularen Chaperone zu beantworten, beispielsweise welche STO-Geometrie Chaperone und Co-Chaperone im Komplex mit einem Zielprotein aufweisen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist vorteilhaft, da die Vorbereitungsschritte für die A FM- und Kent-Hebelsonde aufgrund der Komplexität der damit verbundenen manuellen Handgriffe schwer allein anhand schriftlicher Anleitungen zu erlernen sind. Die Durchführung der Methode demonstrieren Morgan Shannon und John Gertz, zwei Studenten aus meinem Labor. Zunächst werden die zu bildgebenden Proteine oder DNA-Moleküle isoliert und in einem wässrigen Puffer suspendiert. Nach Bestätigung der Reinheit der Probe wird diese zur Förderung der Anheftung der Probe an Glimmer auf Eis in einem FM-Absorptionspuffer inkubiert.Für Proteinstichproben verwenden Sie einen 10 Millimolar HEPES-Puffer. Für DNA eignet sich ein magnesiumhaltiger Puffer, der aus 10 Millimolar Tris, pH 7,5, 10 Millimolar Natriumchlorid und 2 Millimolar Magnesiumchlorid besteht, um die AFM-Sonde zu montieren. Setzen Sie den Flüssigzellen-Sondenhalter auf die entsprechende Cantilever-Montage-Dockstation.Suchen Sie den langen, dicken Kragarm der scharfen Nitridhebelsonde, die für die Abbildung verwendet werden soll. Übertragen Sie sie vorsichtig in den Sondenhalter für die Flüssigzelle, wobei sichergestellt werden muss, dass die Spitze nach oben bleibt. Untersuchen Sie anschließend den Kragarm unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass er unbeschädigt ist und korrekt im Sondenhalter für die Flüssigzelle sitzt.Entfernen Sie dann vorsichtig einen AFM-Kopf aus der Keilführung der Instrumentenanordnung, indem Sie die Halteschraube für den Kopf festziehen. Drehen Sie den AFM-Kopf um und drücken Sie den Probenträger für die Flüssigzelle fest auf die vier Stifte an der Unterseite des AFM-Kopfs. Setzen Sie den AFM-Kopf schließlich vorsichtig wieder in die Keilführung des Instruments ein.Um den aFM weiter für die Bildgebung von Proben vorzubereiten, bewegen Sie die Knöpfe des integrierten Lichtmikroskops, um die Cantileverspitze zu lokalisieren, und justieren Sie mithilfe der Pfeiltasten „Hoch“ und „Runter“ des Optik-Controllers in der Software die Fokusebene der Cantileverspitze. Nutzen Sie die Justierknöpfe für den Laser, um den Laserstrahl auf die Cantileverspitze auszurichten. Dieser Schritt gehört zu den technisch anspruchsvollsten des Protokolls. Die Positionierung erfolgt manuell und erfordert eine präzise Einstellung der Knöpfe.Sorgfältige Überwachung des Lasers im Reflexionspunkt und im Beleuchtungspunkt erhöht die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Ausrichtung. Anschließend justieren Sie die Regler des Photodetektors am FM-Kopf, um den Photodetektor zu zentrieren. Platzieren Sie ein frisch gespaltene Blatt Glimmer, das an einer metallischen FM-Probenplatte befestigt ist, auf dem magnetisierten Probenhalter oben auf der FM-Halterplatte.Drehen Sie die FM-Halterplatte, sodass die Probenscheibe für die anfängliche Bildaufnahme positioniert ist. Verwenden Sie die Fokussierflächensteuerung der Gerätesoftware, um den FM-Kopf in Richtung der Oberfläche der MICA-Probenscheibe abzusenken. Wählen Sie das Abstimm-Symbol in der Gerätesoftware und stimmen Sie den Cantilever ab, bis deutliche Merkmale auf der MICA-Oberfläche oder die Spiegelung der Spitze scharfgestellt sind.Die Resonanzfrequenz empfohlener MSNL- oder SNL-Sonden liegt zwischen 20 und 60 Kilohertz. Wählen Sie einen 5-%-Spitzen-Offset, um die MICA-Probe abzubilden. Bringen Sie zunächst die Sonde auf der MICA-Oberfläche in Kontakt, stellen Sie die anfängliche Scan-Größe auf 10 Mikrometer und die Scan-Frequenz auf ein Hertz ein.Erfassen Sie vollständige Scan-Bilder des 10-Mikrometer-Feldes. Verringern Sie anschließend die Scan-Größe auf fünf, einen und 0,5 Mikrometer und erfassen Sie jeweils vollständige Bilder jedes Feldes. Lösen Sie die Sonde, indem Sie im Instrumenten-Software auf das Löse-Symbol klicken.Um Biomoleküle von Interesse abzubilden, mischen Sie fünf µL der vorbereiteten Probe mit 45 µL frischem Absorptionspuffer. Geben Sie vorsichtig 50 µL der Lösung mit einer Konzentration von 0,5 µg/mL enthaltenden Biomolekülen direkt auf die MICUs-Oberfläche. Warten Sie fünf Minuten, damit die Biomoleküle in der Probe an der Micah-Oberfläche haften können.Danach pipettieren Sie weitere 50 bis 100 Mikroliter Pufferlösung in den Flüssigkeitszellen-Probenhalter. Achten Sie darauf, die Sonde, einen FM-Kopf oder MICA nicht mit der Pipettenspitze zu berühren, stellen Sie den Fotodetektor neu ein und richten Sie den Laser bei Bedarf erneut auf dem Cantilever aus. Anschließend verwenden Sie die Gerätesoftware, um die Sonde erneut einzurichten.Vergrößern Sie die Scan-Größe, um interessierende Bereiche zu identifizieren. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie mehrmals das Symbol zum Zurückziehen in der Gerätesoftware aus, um die Sonde zu lösen. Spülen Sie anschließend den Probenträger für die Flüssigzelle und die Probenscheibe gründlich mit destilliertem Wasser. Danach mit Druckluft probieren. Ein Beispiel eines A-FM-Bildes ist hier dargestellt. Das Glimmer-Substrat bietet eine molekular ebene Oberfläche, an die sich DNA und Protein anlagern können.Die Bildgebung von MICA vor biologischen Molekülproben liefert eine negative Kontrolle und eine Beurteilung der Bildrauschen. Außerdem gewährleistet sie, dass der Cantilever korrekt abgestimmt ist, und gibt Sicherheit, dass die anschließende Bildgebung der Probe erfolgreich verlaufen wird. Doppelsträngige, vermutlich supercoiled vorliegende Plasmadna wird leicht an ihrem asymmetrischen Erscheinungsbild und ihrer gleichmäßigen Ablagerung auf dem zuvor unauffälligen MICA-Substrat erkannt.Protein-Komplexe mit diskreten Partikelgrößen sind außerdem eindeutig vom Micah-Substrat unterscheidbar. Unterschiede in der Partikelgröße weisen auf Heterogenität der Probe hin und können nützlich sein, um die Stöchiometrie, Geometrie oder biochemische Aktivität der Protein-Komplexe abzuschätzen. Die allgemeine diagonale Form und die konsistente Ausrichtung der beobachteten Proteinpartikel.Hier ist ein Bildartefakt zu sehen, da die Proteine auf dem Micah-Substrat erwartungsgemäß zufällig ausgerichtet wären. Mögliche Ursachen des beobachteten Artefakts sind eine physische Spitzenanomalie oder eine FM-Aufnahme mit zu hoher Scan-Geschwindigkeit, wobei die Tip-Konvolution präzise Längenmessungen entlang der X- und Y-Achse oder der Höhe entlang der Z-Achse verhindert. Dennoch können relative X- und Y-Messungen nützlich sein, um biophysikalische Eigenschaften der abgebildeten Biomoleküle abzuschätzen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Cantilever genau einzustellen und den Photodetektor auszurichten, indem man diesem grundlegenden FM-Verfahren folgt.Weitere Schritte, wie die Verwendung einer Pufferaustausch-Flüssigzelle, können hinzugefügt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen, beispielsweise die Fähigkeit molekularer Chaperone, die Freisetzung von Steroidrezeptoren von ihren DNA-Bindungsstellen zu beeinflussen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man DNA-Proteine und biomolekulare Komplexe mittels Rasterkraftmikroskopie unter Pufferbedingungen abbilden kann.

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