Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen
December 1st, 2020
Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.
Die Identifizierung von kleinmolekularen Proteininteraktionen ist essentiell für die Forschung und Entwicklung von Medikamenten sowie für das Verständnis der pathologischen Mechanismen, die Virus-DTCs zugrunde liegen. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Biopanning von Wirkstoff-Erkennungspeptiden und die globale Validierung von Wirkstoffbindungsstellen auf Proteinen für niedermolekulare Wirkstoffe von Interesse. Um einen QCM-Sensorchip vorzubereiten, befestigen Sie einen keramischen Sensorchip an den Oszillator eines 27-Megahertz-QCM-Geräts und zeichnen Sie die Eigenfrequenz in der Luftphase vor der Immobilisierung kleiner Moleküle auf.
Nach der Aufnahme nehmen Sie den Chip ab und fügen Sie vorsichtig einen 20-Mikroliter-Tropfen einer 1-millimolaren niedermolekularen Derivatlösung in 70%igem Ethanol hinzu, um eine selbstorganisierte Monoschicht auf der Goldelektrode des Sensorchips zu erzeugen. Legen Sie den Chip in eine mit angefeuchtetem Gewebe ausgelegte Petrischale, schützen Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur vor Licht, bevor Sie die Elektrodenoberfläche vorsichtig mit ultrareinem Wasser waschen. Trocknen Sie den Span mit sanfter Luftzufuhr und laden Sie den Span auf das QCM-Gerät.
Nach einer Stunde wird die Verringerung der Frequenz in der Luftphase aufgezeichnet, um die Menge des kleinen Moleküls zu messen, die immobilisiert wurde. Setzen Sie für das Biopanning der T7-Phagenbibliothek eine Küvette mit einem speziellen Magnetrührer auf den QCM-Biosensor, der auf 1000 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und fügen Sie der Küvette acht Milliliter Reaktionspuffer hinzu. Während der Puffer gerührt wird, befestigen Sie den QCM-Sensorchip am Oszillator. Halten Sie den Arm des Oszillators gedrückt, um den Chip in den Puffer einzutauchen und mit der Überwachung der QCM-Frequenz zu beginnen. Wenn das Sensorgramm auf eine Frequenzdrift von etwa drei Hertz pro Minute ausgeglichen ist, injizieren Sie acht Mikroliter einer T7-Phagenbibliothek in die Küvette und markieren Sie den Injektionspunkt auf dem Sensor.
Überwachen Sie die Frequenzreduzierung, die durch die Bindung der T7-Phagen an das kleine Molekül verursacht wird, das auf der Oberfläche der Goldelektrode immobilisiert ist. Stoppen Sie nach 10 Minuten den QCM-Frequenzmonitor und heben Sie den Oszillator schnell an, um den Sensorchip aus der Charge zu entfernen, den Sensorchip vom Oszillator zu lösen und den Puffer vom Chip zu entfernen. Legen Sie den getrockneten Sensorchip in eine feuchte Petrischale und geben Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen E-coli-Wirtszellen aus der logaritmischen Phase auf die Goldelektrode.
Inkubieren Sie die Schale 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 1000 bis 1500 Umdrehungen pro Minute auf einem 96-Well-Mikroplattenmischer, geschützt vor Licht, um die Rückgewinnung der gebundenen T7-Sieben-Phagen zu verbessern. Am Ende der Inkubation werden die 20 Mikroliter E-Coli-Suspension in 200 Mikroliter LB-Medium überführt. Gemäß dem allgemeinen Verfahren führen Sie die Phagen-Plaque-Isolierung in dem Medium und die DNA-Sequenzierung durch, die für das Arzneimittel kodiert, wobei Peptidsequenzen erkannt werden, die auf jedem Phagenkapsid angezeigt werden.
Verwenden Sie nach der Wartung des Sensorchips ein mit 1%iger Natriumdodecylsulfatlösung getränktes Wattestäbchen, um die Elektrodenoberfläche zu reinigen, die Goldoberfläche mit ultrareinem Wasser zu waschen und die Elektrode mit Luft zu trocknen. Behandeln Sie dann die Elektrodenoberfläche fünf Minuten lang mit fünf Mikrolitern frisch zubereiteter Parana-Lösung, gefolgt von einer Reinstwasserwäsche und zweimaligem Trocknen an der Luft. Um bioinformatische Analysen mit RELIC durchzuführen, entpacken Sie das eigenständige RELIC-Programm auf einem PC mit einem Windows-Betriebssystem und verwenden Sie die Aminosäuresequenzen von 15 mer-Peptiden oder einzelnen oder mehreren Proteinen in jeder Textdatei im schnellen A-Format.
Legen Sie die erforderlichen Textdateien in den Ordner AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con oder fast A scan. Klicken Sie auf jede ausführbare Datei im unabhängigen Ordner, um die persönliche Version von FTN 95 zu öffnen, und geben Sie den entsprechenden Dateinamen und die Erweiterung in der Befehlszeile ein, um jedes Programm auszuführen und die resultierende Textformatdatei zu erhalten. Die resultierenden Textformatdateien werden hier angezeigt.
Exportieren Sie dann die resultierende Textdatei in eine Tabelle, um ein Diagramm des Informationsgehalts oder der kumulativen Ähnlichkeitswerte zu erstellen, die mit einem Schlag von etwa 62 berechnet wurden. Mit dieser Strategie ist es gelungen, einzelne und mehrere niedermolekulare Bindungsstellen an den Zielproteinen für sechs niedermolekulare Wirkstoffe zu identifizieren. Zum Beispiel wurden 29 Peptide, die das klinisch zugelassene Medikament Irinotecan immobilisiert als selbstorganisierende Monoschicht erkennen, durch QCM-Biosensor-basiertes Ein-Zyklus-Biopanning identifiziert. Die anschließende paarweise Ausrichtung der 29 Peptide und der Acetylcholinesterase ergab maximale Punktzahlen für spezifische Aminosäurereste, die mit denen übereinstimmten, aus denen die Irinotecan-Bindungsstelle besteht.
Dieselbe Untergruppe von Peptiden wurde auch in der Nähe der katalytischen Triade in der Carboxylesterase erfolgreich identifiziert, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäuren ein Gerüst für die Irinotecan-Erkennung während der Entesterung bilden. Die 27 Peptide, die das Grippemedikament Oseltamivir erkennen, das die Goldelektrodenoberfläche des QCM-Sensorchips bedeckt, wiesen erfolgreich die Oseltamivir-Bindungsstelle in der Neuraminidase nach. Diese Bindungsstelle besteht aus unstrukturierten Peptidschleifen, die beim Andocken an Oseltamivir möglicherweise eine dynamische Bewegung erfahren.
Medikamente, Regionen, Chemikalien, rekombinante Bakteriophagen und Bakterien sind biologische Bestattungswagen und sollten gemäß dem Kulturgewinnprotokoll gehandhabt werden. Denken Sie daran, zur Sicherheit immer Handschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel zu tragen. Nach diesem Verfahren können Zielproteine für verschiedene Medikamente bei Menschen, pathologischen Viren und sogar Pflanzen global validiert werden, um die molekularen Mechanismen und die potenzielle therapeutische Wirksamkeit von Arzneimitteln von Interesse zu verstehen.
Überblick
Diese Studie präsentiert eine Strategie zur Identifizierung von Wirkstoff-Peptid-Interaktionen mittels eines Quarzkristall-Mikrowaagen-Biosensors (QCM). Die Methode beinhaltet das Biopanning von wirkstofferkennenden Peptiden und bioinformatische Analysen zur Beurteilung der Wirkstofferkennung und der Bindungsstellen an Proteinen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Arzneimittelentwicklung
- Biotechnologie
Hintergrund
- Das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und Proteinen ist entscheidend für die Arzneimittelforschung.
- Hochdurchsatzmethoden sind für das Peptide-Biopanning erforderlich.
- QCM-Biosensoren bieten eine Plattform für die Untersuchung von Wirkstoffbindungen.
- Die Identifizierung von Bindungsstellen unterstützt die therapeutische Entwicklung.
Ziel der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Identifizierung von wirkstoffbindenden Peptiden.
- Validierung von Wirkstoffbindungsstellen an Zielproteinen.
- Verbesserung des Verständnisses von Wirkstoffinteraktionen auf molekularer Ebene.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung von QCM-Sensorchips für die Immobilisierung kleiner Moleküle.
- Biopanning mit T7-Phage-Bibliotheken zur Identifizierung von Bindungspeptiden.
- Überwachung von Frequenzänderungen im QCM zur Beurteilung von Bindungsinteraktionen.
- Bioinformatische Analyse zur Bewertung von Peptidsequenz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Peptiden, die Wirkstoffe wie Irinotecan und Oseltamivir erkennen.
- Charakterisierung von Bindungsstellen an Proteinen wie Acetylcholinesterase und Neuraminidase.
- Nachgewiesene Wirksamkeit der Methode zur Validierung von Wirkstoffinteraktionen.
Schlussfolgerungen
- Die Strategie identifiziert wirksam Bindungsstellen von Wirkstoffen an Proteinen.
- Sie kann auf verschiedene Wirkstoffe angewendet werden, um therapeutische Erkenntnisse zu gewinnen.
- Verbessert das Verständnis der molekularen Mechanismen der Wirkstoffwirkung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
