Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Ereignisse des Transports und der Ausbreitung von Herpesviren mithilfe von fluoreszierenden Proteinfusionen in primären neuronalen Kulturen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Probeninkubation bei physiologisch relevanten Temperaturen an einem Mikroskop etabliert wird, das in der Lage ist, die Fluoreszenzbeleuchtung schnell umzuschalten. Im zweiten Schritt werden die Parameter der Fluoreszenzbildgebung so eingestellt, dass sie eine zelluläre Photoschädigung begrenzen und gleichzeitig vernünftige Daten erfassen.

Als nächstes wird entweder eine sequentielle Erfassung der Fluoreszenzkanäle oder eine mehrstufige Erfassung durchgeführt. Gekachelte Rahmen mit mehreren Bildern werden im letzten Schritt erfasst. Die Daten werden analysiert und für die Präsentation und Veröffentlichung neu formatiert.

Letztendlich wird diese Methode der Lebendzellbildgebung verwendet, um die Bewegung fluoreszierender Viruspartikel innerhalb von Neuronen zu verfolgen und die Ausbreitung der Infektion zwischen den Zellen zu verfolgen. Diese Methode kann Aufschluss über den Transport und die Ausbreitung von Herpesvirus-Neuronen geben. Es kann auch auf andere dynamische Ereignisse in der Zellbiologie und Mikrobiologie angewendet werden, wie z.B. die endozytäre Aufnahme von Partikeln oder die Zellmigration.

Schließen Sie vor jedem bildgebenden Experiment den oberen Inkubator des Mikroskoptisches an und beginnen Sie mit dem Erwärmen. Schalten Sie nach 30 Minuten das Mikroskop, die Durchlicht- und Epi-Leuchtstofflampen sowie die automatische Hardwaresteuerung ein. Öffnen Sie dann NIS elements, die Mikroskopsteuerungssoftware, um eine Verbindung zum Mikroskop herzustellen.

Hier wird ein Screenshot einer Standard-Benutzeroberfläche in NIS-Elementen angezeigt. Die Schaltflächen "Wiedergabe" und "Stopp" steuern das Live-Image-Fenster, in dem die aktuellen Hardwarekonfigurationen für das Imaging sowie die aktuell abgebildeten Elemente angezeigt werden. Auf der Oberseite befindet sich eine Reihe von optischen Konfigurationen, die die voreingestellten Hardwareeinstellungen implementieren, um das Mikroskop für die Trans-Illuminat- oder Fluoreszenzdetektion zu konfigurieren.

Die Kamerasteuerung und die Belichtungseinstellungen ermöglichen die Konfiguration der Kameraerkennung, um die Bildqualität und -geschwindigkeit zu optimieren. Alle Experimente werden mit Hilfe der ND-Erfassungssteuerung koordiniert. Befestigen Sie als Nächstes einen Linsenwärmer an dem entsprechenden Ölimmersionsobjektiv und befestigen Sie dann den Inkubator an der Tischoberseite am motorisierten Tisch des Mikroskops.

Stellen Sie sicher, dass der geeignete Einsatz, der die Probe hält, an Ort und Stelle ist, und befestigen Sie dann die befeuchtete Leitung von der Inkubatorsteuerung an der Eingangsöffnung des Inkubators auf der Bühne. Schalten Sie den Inkubator und die wärmeren Regler ein und passen Sie dann die Temperatureinstellungen an die zuvor überprüften Bedingungen an, die für das abzubildende Objektiv und die Probe spezifisch sind. Öffnen Sie abschließend das Steuerventil am 5 % Kohlendioxid 95 % atmosphärischen Tank, um den oberen Inkubator mit Kohlendioxid angereicherte Luft in den oberen Inkubator der Bühne zu leiten.

Um ein Bild einzugeben, geben Sie eine Klasse Virion Transport Ereignisse in Echtzeit ein. Setzen Sie zunächst eine Zellkulturschale mit infizierten Neuronen für mindestens 10 Minuten in den Inkubator auf der Bühne ein, bevor Sie das Experiment durchführen. Finden Sie dann mit Hilfe des Durchlichts und des Okulars des Mikroskops einen neuronalen Zellkörper, der eine klar isolierte axonale Ausdehnung aufweist.

Das Auffinden bebildbarer Bereiche in der neuronalen Kultur ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Der Erfolg wird durch das Einsetzen mehrerer Kulturen im Falle eines schlechten Zellwachstums oder einer Infektion oder durch eine physische Störung der Kultur während der Bildgebung gewährleistet. Schalten Sie nun mit der Mikroskopsoftware den Strahlengang auf die EM CCD-Kamera um und klicken Sie dann auf den Play-Button, um ein Live-Bildfenster zu starten.

Nach der Bestimmung der optimalen Kamerabelichtungseinstellungen für jeden Fluoreszenzproteinsatz wird die Elektronenmultiplikationsverstärkung der Kamera auf 300 erhöht. Zur Minimierung der Belichtungszeit und zur Verbesserung der Erkennung von schwachen Signalen. Stoppen Sie das Live-Imaging-Fenster, um ein Ausbleichen der Probe zu verhindern.

Nachdem Sie die Belichtungszeiten eingestellt und einen genau definierten Bereich des Axons in NIS-Elementen gefunden haben, konfigurieren Sie die Software für die sequenzielle Bildaufnahme. Öffnen Sie das Dropdown-Menü "Anwendungen", und wählen Sie die Anwendung "Experiment mit sechs D definieren" aus. Klicken Sie im ND-Aufnahmefenster auf die Registerkarte Zeit, um die Häufigkeit der Bildaufnahme zu bestimmen.

Stellen Sie das Intervall auf keine Verzögerung und die Dauer auf fünf Minuten ein. Klicken Sie nun auf die Registerkarte Lambda, um die voreingestellten Hardwarekonfigurationen auszuwählen, die für die Erfassung mehrerer Fluoreszenzbilder verwendet werden. Klicken Sie auf das erste Feld und wählen Sie dann in den nachfolgenden Dropdown-Menüs eine geeignete Hardwarekonfiguration aus.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen In Datei speichern, und konfigurieren Sie den Speicherort und den Dateinamen der Experimentausgabedatei. Wenn Sie alle diese Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Jetzt ausführen, um das Experiment zu starten. Die Bildaufnahmerate wird durch die Belichtungseinstellungen und die Größe des aufgenommenen Bildes optimiert.

Verwenden Sie das Werkzeug "Interessenbereich" in NIS-Elementen, um den Interessenbereich zu definieren. Auswahl eines Bereichs zwischen 25 und 50 % des gesamten Bildbereichs für die Durchführung von Zeitraffer-Bildgebungen über Nacht von Ereignissen zur Eingabe einer Notenverteilung. Stellen Sie zunächst die Kulturschale vorsichtig in den Inkubator auf der Bühne.

Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Position des Objektivs an der Seite der Schale eingestellt ist, bringen Sie das Objektiv langsam in den Fokus und achten Sie darauf, dass es nicht in die Probe hineindrückt. Sobald das Fokusfeld identifiziert wurde, bewegen Sie das Objektiv langsam in die Mitte der Schale in der Nähe der inneren Barriere, markieren Sie die Innenseite des Axonkompartiments, wobei Sie darauf achten, den Tiefenfokus beizubehalten und ein Hochdrücken in die Probe zu vermeiden. Als nächstes umgeben Sie die Neuronen in der Kulturschale mit etwa zwei Millilitern 37 Grad Celsius PBS außerhalb des Teflonrings, um eine Austrocknung der Probe zu minimieren und eine Wärmeisolierung zu gewährleisten.

Aktivieren Sie dann alle Neutraldichtefilter, um die Intensität der Beleuchtung auf die niedrigstmögliche Stufe zu begrenzen und so häufige Bildaufnahmen über lange Zeiträume ohne übermäßige Fotoschäden zu ermöglichen. Klicken Sie im ND-Aufnahmefenster auf die Registerkarte "Große Bilder" und wählen Sie dann einen Bereich aus, der aus fünf mal zwei Bildern besteht. Verwenden Sie eine Stitching-Überlappung von 7 %, um mehrere Positionen sequenziell parallel abzubilden.

Wählen Sie im Verlauf des Overnight-Films die Registerkarte XY-Positionen. Definieren Sie dann die Positionen, die den Mittelpunkt für jeden großen Bildbereich definieren. Der Schwerpunkt sollte auf dem Zellkern liegen, das Objektiv so positionieren, dass für die Mehrzahl der Zellen eine klar definierte Kernhülle zu sehen ist.

Klicken Sie dann auf eine Zeitschleife, um die Belichtungs- und Positionseinstellungen zu testen und die resultierenden Bilder auf Durchlicht, Beleuchtung, Fokussierung und Bildausschnitt auszuwerten. Nachdem alle Einstellungen überprüft und getestet wurden, starten Sie das automatisierte Experiment, indem Sie auf die Schaltfläche Jetzt ausführen klicken, um Filme zu exportieren, die während der Live-Zellbildgebung aufgenommen wurden. Öffnen Sie zunächst die entsprechende ND-Two-Rohdatei in NIS-Elementen und wählen Sie die geteilte Komponentenansicht aus.

Um die gewünschten Leuchtstoffkanäle zu visualisieren, geben Sie die Datei mit einer geeigneten Geschwindigkeit wieder. Fünf Bilder pro Sekunde sind ein guter Ausgangspunkt für die Visualisierung des schnellen Transports, um einen Zeitstempel einzuschließen, der eine Echtzeituhr während der Filmwiedergabe darstellt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie ND-Informationen hinzufügen.

In der oberen linken Ecke erscheint ein digitaler Zähler, um den Zeitstempel zu bearbeiten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Zähler und wählen Sie ND-Informationen bearbeiten. Bearbeiten Sie im folgenden Popup-Fenster den Text, um die relevanten Bildgebungsparameter widerzuspiegeln. Bearbeiten Sie die Schriftfarbe und -größe des Textes, um die Übersichtlichkeit zu verbessern.

Gehen Sie dann zum Bearbeiten-Menü und wählen Sie Ansichts-Schnappschuss erstellen, um das Ansichts-Schnappschuss-Fenster zu öffnen und eine Acht-Bit-RGB-exportbereite Datei zu generieren, die die fluoreszierenden Kanäle aus dem gesamten Film enthält, und wählen Sie Auf alle Bilder anwenden. Speichern Sie abschließend die Datei aus Gründen der plattformübergreifenden Kompatibilität im A-VI-Format und stellen Sie die Wiedergaberate auf 200 Millisekunden pro Frame ein. In diesem Phasenkontrastbild wird eine repräsentative, reife dissoziierte, obere Zervixganglien- oder SCG-Kultur, die für die intergrade Viriontransportbildgebung verwendet wird, gezeigt, dass mit dem Pseudotollwutvirus oder PRV 3 48 infizierte Neuronen GFPS neun und GMM-Kirschmembran-Fusionsproteine exprimieren.

In dieser Abbildung ist repräsentatives Lebendzell-Imaging von SCG-Axonen acht Stunden nach der Infektion mit P RV 3 48 zu sehen: Anterograde Transportstrukturen innerhalb distaler Axone sind in zwei Fluoreszenzkanälen, GFP und mCherry, sichtbar. Innerhalb des Axons verläuft eine anterograde Transportstruktur, die durch die weißen Pfeile angedeutet wird. Die beiden fluoreszierenden Proteine sind durch den sequentiellen Erwerb der Fluoreszenzkanäle und die schnelle Bewegung der viralen Strukturen räumlich versetzt.

Die Anwendung dieses Protokolls auf Infektionen von dissoziierten SCG-Kulturen mit PRV 3 48 hat die Visualisierung des anterograden Transports von Vons erleichtert. Der Einbau dieser Fusionsproteine in virale Partikel führt dazu, dass sie auf dem Transport von Punkten, wie durch die sich bewegenden fluoreszierenden Punkte sichtbar gemacht wird, nachgewiesen werden können. Die oben genannten Bildgebungsbedingungen minimieren den Versatz jedes Fluors auf ein sich bewegendes Partikel während des Filterwechsels.

Die Verwendung von schnell schaltenden Filterrädern und gepaarten dichroitischen Multipass-Spiegeln ermöglicht die schnelle sequentielle Erfassung von zwei oder mehr Fluoreszenzkanälen mit Geschwindigkeiten von bis zu 0,8 Bildern pro Sekunde in einem dreiminütigen Bildgebungsfenster. Zahlreiche Transport-Punta werden häufig beobachtet und große Stichprobengrößen für Kolokalisationsanalysen werden schnell generiert. Hier ist ein Schema des kompartimentierten Kultursystems gezeigt, das in diesem Bild abgebildet ist, mit SCG-Neuronen, die im linken Kompartiment plattiert sind, und mit axonalen Projektionen, die sich unter den internen Barrieren in das äußerste rechte Kompartiment erstrecken.

Die folgenden Bilder wurden aus einem großen, gekachelten Zeitrafferfilm ausgewählt, der die Virionenübertragung von PRV 4 27 infizierten Axonen in die Epithelzellen des Empfängers zeigt. In diesem ersten Panel entstand ein Bild der übertragenen YFP- und RFP-Fluoreszenzbilder zu einem Zeitpunkt nach der Infektion. Wenn die Empfängerzellen beginnen, eine membrangebundene YFP und VP 26 MRFP zu exprimieren, werden Fusionsproteine gezeigt.

Das weiße Feld markiert einen Bereich der Empfängerepithelzellen, der infizierende Kapsidanordnungen enthält. Hier wird derselbe Bereich wie im vorherigen Bild gezeigt, der nur über den RFP-Kanal angezeigt wird. Die durchgezogene weiße Linie stellt die schematische Darstellung des Zellumrisses dar.

Die gehashten weißen Linien zeigen die Zellkerne und die blauen Linien umreißen die Axone. In diesem zweiten Panel werden nur die YFP- und RFP-Kanäle zusammen angezeigt. Beachten Sie die große Anzahl von MRFP-Punkten, die mit den Axonbahnen assoziiert sind.

Diese Zellen wurden kürzlich infiziert und exprimieren keines der beiden Fusionsproteine. Infizierte Zellen können zurückverfolgt werden, um die fluoreszierenden Kapside sichtbar zu machen, die die Virusinfektion ausgelöst haben. Diese einzelnen Zellen können vom großen Rahmen isoliert und ohne nennenswerten Detailverlust verfolgt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Mikroskopie lebender Zellen einen biologischen Prozess beeinflusst, der beobachtet wird. Eine sorgfältige Optimierung dieser Protokolle ermöglicht jedoch eine Visualisierung ohne Änderung.