Name: Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Lernen Sie Live-Cell-Imaging von Alphaherpesvirus-Transport und -Ausbreitung in primären Neuronenkulturen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung viraler Dynamiken in Echtzeit.

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LWE und RK werden von der US National Institutes of Health Zuschüsse R37 NS033506-16 und R01-03 NS060699 unterstützt. MPT wurde von einem American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC) unterstützt. Die Beratung und das Wissen von Dr. Matthew Lyman und Dr. Oren Kobiler waren maßgeblich an der Gestaltung des Mikroskops Konfiguration und Live Cell Imaging Verfahren. Wir verlängern auch dank Neal Barlow und Brian T. Kain von Nikon Instruments für ihre technische Unterstützung bei der Anschaffung, Installation und Performance des Mikroskops.

Abschnitt 1 - Environmental Control Bedingungen für die Live-Zelle Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> 30 min vor jeder Imaging Experiment anschließen und beginnen Erwärmung des Mikroskops top Inkubator. <ol><li> Schalten Sie Mikroskop, Durchlicht und epifluoreszenten Lichtquellen und automatisierte Hardware-Bedienelemente. Öffnen Sie die Mikroskop-Software, NIS Elements, um das Mikroskop anschließen und beginnen Abkühlen der EM-CCD-Kamera. </li><li> Bringen Objektiv wärmer entsprechende Ziel (entweder 60X oder 100X Öl-Immersion). Hinweis: Wählen Sie Objektivlinse auf Experiment Typ. Die 100X Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) ist am besten für die Verfolgung von anterograde Transport virion Baugruppen während der Phase 60X Ziel geeignet ist, anterograden Ausbreitung visualisieren. Lower Vergrößerung, haben Nicht-Öl-Immersions-Objektive erfordern eine Linse wärmer als sie nicht machen direktem Kontakt mit der Probe. </li><li> Bringen Bühne top Inkubator auf den motorisierten Stufe mi<html> kop. Sicherstellen, dass die entsprechenden Einsatzes, halten sich die Probe im Ort wird. Befestigen Sie die befeuchtete Luft Linie aus dem Inkubator Kontrolle an den Eingangs-Port auf der Bühne oben Inkubator. </li><li> Schalten Sie Inkubator und Objektiv wärmer Kontrollen und Temperatur einstellen Einstellungen vorher überprüft spezifischen Bedingungen für die objektive und Probe abgebildet (siehe Diskussion). </li><li> Öffnen Sie das Regelventil auf dem 5% CO 2/95% atmosphärischen Tank zu CO 2 ergänzt Luft nach oben bieten Inkubator zu inszenieren. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte zwischen 60 und 80 ml Gas pro Minute. Schnellere Preise werden in umfangreichen Probe Austrocknung trotz der Befeuchtungskammer führen. </li></ol></li><li> In Objektiv Öl Objektiv und sofort legen die Kultur, die in die Stufe oben Inkubator abgebildet werden. </li><li> Erlauben Äquilibrierung der Temperatur in der Kultur für ein Minimum von 10 min. Eine Stunde wird bevorzugt, vor allem für Übernachtung Bildgebung in Abschnitt 3 beschrieben. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Abschnitt 2 - Echtzeit-Imaging von Anterograde Virion Transport Protocol Events <ol><li> Sechs bis acht Stunden vor der Bildgebung, infizieren 35 mm Deckglas-bottom Schale der reifen, distanzierte SCG Neuronen mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et beschrieben al. 2012a 11. Wird die Prüfung mehr als ein Virus, off-set Impfungen von 30-60 min bis zum Abbilden von sequentiellen Proben zu ähnlichen Zeiten nach der Infektion zu ermöglichen. </li><li> Legen Gericht in die Stufe oben Inkubator für ein Minimum von 10 Minuten vor der Ausführung jedes Experiment. Während die Temperatur im Gleichgewicht, wird der Brennebene Verschiebung und wird sich negativ auf alle bildgebenden Experimenten. </li><li> Mit Durchlicht und dem Okular des Mikroskops, finden Sie einen neuronalen Zellkörper, die eine deutlich isoliert axonal Erweiterung. Alternativ verwenden Sie die entsprechende Fluoreszenz-Beleuchtung zu einer Zelle, die Detektoren findenTabelle Mengen von fluoreszierenden Proteinen. Es ist wichtig, um die Exposition der Probe Fluoreszenzbeleuchtung begrenzen, in diesem Schritt und die folgenden Schritte durch Licht induzierten Zellschäden und Bleichen von fluoreszierenden Proteinen. </li><li> Dämpfen Fluoreszenzbeleuchtung um die Intensität des Anregungslichts auf dem die Zellen ausgesetzt zu reduzieren. Engage Lichtdämpfungsmittel Neutral Density (ND)-Filter in der Fluoreszenz Beleuchtungslichtweg. Bei Filmen, die länger als 1 min, ein Minimum von ND4 muss verwendet werden, um Foto-Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und umfangreiche Foto-Schäden der Axone zu verhindern. Stark fluoreszierende Strukturen können in der Regel visualisiert werden mit einem ND8-Filter im Ort. </li><li> Mit dem Mikroskop-Software (Abbildung 2 und Supplemental Film 1A), schalten Sie das Licht-Pfad zum EM-CCD-Kamera. </li><li> Bestimmen Sie optimale Bildgebung und-bedingungen für jeden Kanal Fluoreszenz. <ol><li> Starten Sie eine Live-Bild-Fenster mit dem &quot;Play&quot;-Taste. &lt;/ Li&gt; <li> Bestimmen Sie die optimalen Belichtungseinstellungen der Kamera für jeden fluoreszierenden Proteins. Nicht mehr als 300 ms pro Kanal als motional Aberrationen schnelllebigen virion Strukturen auftreten. Nutzen Sie die EM Verstärkung der Kamera auf eine Einstellung von 300 (Hersteller empfohlene maximale Verstärkung), um die Exposition zu minimieren und verbessern Erkennung von schwachen Signalen. Korrigieren Belichtungszeiten sollte einen Bild mit niedriger Intensität Hintergrund und hohe spezifische Signale. </li></ol></li><li> Nach dem Einstellen Expositionen und der Suche nach einem gut definierten Bereich des Axon, muss die Software konfiguriert ist, um automatisierte Bildaufnahme durchzuführen. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe zu verhindern Bleichen. <ol><li> In der NIS Elements-Software, wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der &quot;Applications&quot; Dropdown-Menü. </li><li> In der ND Erwerb Fenster klicken Sie auf die Registerkarte Zeit, die die Frequenz der Bildaufnahme bestimmen. Legen Sie die Interval auf &quot;Keine Verzögerung&quot; und die Dauer bis 5 min. The Software wird dann erwerben Bildrahmen bei der höchsten Frequenz möglich Dauer von 5 min. </li><li> Wählen Sie den &quot;Lambda&quot;-Reiter, die Auswahl der voreingestellten Hardware-Konfigurationen für mehrere fluoreszierende Bildaufnahme verwendet werden können. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü, um eine geeignete Hardware-Konfiguration wählen. Wiederholen Sie dies für alle fluoreszierenden Proteinen, die abgebildet werden. </li><li> Sicherstellen, dass die Tabs für &quot;XY Positionen&quot;, &quot;Z-Serie&quot; und &quot;Großes Bild&quot; sind abgewählt. </li><li> Über den Registerkarten wählen Sie das Kästchen mit der Aufschrift &quot;Save to File&quot;, um automatisch Bilder speichern auf der Festplatte während der Aufnahme. Konfigurieren Sie den Speicherort und den Dateinamen des Experiments Ausgabedatei. Als sequentielle Experimente durchgeführt werden, wird die Software eine sequentielle Zahl am Ende des bezeichneten Dateinamen hinzuzufügen. </li><li> Sobald alle Registerkarten ausgewählt wurden. Initiieren Sie das Experiment, indem Sie auf den &quot;Run-Now&quot;-Button. </li><li> Optimieren Sie die Bildaufnahmerate durch Belichtungseinstellungen und image Größe. Mit einem kleinen Bereich der bedruckbaren Bereich wird oft beschleunigen Rahmen Abtastraten. Definieren Sie die Region of Interest mit dem ROI-Tool in NIS-Elements, Auswählen eines Bereichs zwischen 25% und 50% des gesamten Bildbereich. Alternativ werden kürzere Belichtungszeiten erhöhen Rahmen Erfassungsraten, verringert aber die Qualität des Signals (siehe Diskussion). </li></ol></li></ol> Abschnitt 3 - Overnight Zeitraffer-Imaging von Anterograde Spread-Events <ol><li> Vier Stunden vor der Bildgebung, infizieren compartmentalized neuronalen Kultur auf einer 35 mm μ-Dish konstruiert. Impfen neuronalen Zellkörper mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Sanft legen Kulturschale in die Stufe oben Inkubator. Sicherstellen, dass die Position des Objektivs auf die Seite der Schale festgelegt ist. Langsam bringen das Ziel in den Mittelpunkt, ensurING das Ziel nicht Push-up in die Probe. Sobald der Fokus Feld identifiziert worden ist, bewegen sich langsam das Ziel in der Mitte der Schale, in der Nähe der inneren Barriere Demarkierung der Innenseite der Axon Fach. Während der Bewegung sicherzustellen, die Fokustiefe gehalten wird und vermeiden treibt in der Probe. Durchbiegung der Kunststoffoberfläche durch das Objektiv beschädigt die Axone und Kunststoff. </li><li> In etwa 2 ml warmem (~ 37 ° C) Phosphat-gepufferter Salzlösung in die Kulturschale außerhalb des Teflon-Ring. Diese umgibt den neuronalen Kultur mit einem Ring von PBS zu Probe Dehydratisierung zu minimieren und Wärmedämmung. </li><li> Erlauben Temperatur für mindestens 1 Stunde vor dem Einleiten ins Gleichgewicht automatisierte Bildaufnahme (3.8). Steps 3.5 durch 3.7 können während dieser Zeit konfiguriert werden. </li><li> Beschränken Sie die Intensität der Beleuchtung auf der niedrigst möglichen Ebene durch Einbeziehung aller Neutralfilter. Dies ermöglicht häufige Bildaufnahme over lange Zeiträume ohne übermäßige Foto-Schäden. Reduzierung Beleuchtung wird in Low-Signal führen, erfordern längere Belichtungszeiten (siehe Diskussion). </li><li> Verwenden historischen Belichtungseinstellungen oder vor dem Versuchsaufbau erzeugen eine parallel Gericht aus infizierten Epithelzellen exprimieren die Ziel-fluoreszierende Proteine ​​zu Belichtungseinstellungen zu etablieren, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben. </li><li> Nach dem Einstellen Forderungen für die notwendigen Kanäle, ist es Zeit, um die Software für die automatisierte Bildaufnahme konfigurieren. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe begrenzen Bleichen. <ol><li> In Elements Software (Abbildung 2 und ergänzende Film 2), wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der &quot;Applications&quot; Dropdown-Menü, um das ND Acquisition Fenster. </li><li> In ND Acquisition-Fenster auf die Registerkarte Uhrzeit. Legen Sie die Interval auf &quot;5 min&quot;. Stellen Sie die Dauer auf 20 Stunden. Die Schlaufen Feld wird automatisch für die Anzahl der Wiederholungen der progra berechnet werdenm führt. </li><li> Wählen Sie den &quot;Lambda&quot;-Registerkarte. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü wählen Sie die entsprechende Lambda-Konfiguration für Phase Kontrast. Wiederholen für nachfolgende Positionen eine entsprechende Konfigurationen für jedes fluoreszierende Protein abzubildenden. </li><li> Wählen Sie das &quot;Große Bild&quot;-Registerkarte, die die Parameter von mehreren Bildern zu einem einzigen größeren Sichtfeld kombiniert werden bestimmt. Eine ziemlich große Gebiet besteht aus 5 x 2 Bildern mit einem 7% Nähte überlappen. Dies wird für die maximale Anzahl der Zellen pro Lage, ohne Auswirkungen auf die Häufigkeit der Bildaufnahme abgebildet werden können. Auch deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für &quot;Close Active Shutter während Bühne Bewegung&quot;. Diese Option steigert die Geschwindigkeit der Übernahme durch Rollläden schließt nicht zwischen den Bildern. </li><li> Wählen Sie den &quot;XY Position&quot;-Registerkarte, um mehrere Positionen, die nacheinander in parallel werden im Laufe der Nacht Film wird abgebildet identifizieren. Wählen Sie Positionen, die das Zentrum po definierenint für jeden großen Bildbereich. Wählen Sie 6-8 Bild Positionen in der Probe. Ein gutes Bild, werden kleine Gruppen von Zellen in enger Apposition zu klar definierten Axone haben. Zellen sollten nicht auf der jeweils anderen und Axon Bündelung gestapelt werden sollte minimiert werden. Der Brennpunkt ist der Kern der Zelle. Positionieren des Ziels, so dass eine definierte Kernhülle für die Mehrheit der Zellen gesehen wird. </li><li> Sicherstellen, dass der &quot;Z-Serie&quot; Registerkarte abgewählt wird. </li><li> Konfigurieren Sie die Auto-Save-Funktion, wie oben beschrieben in Abschnitt 2.6.5. </li><li> Testen Sie die Belichtung und die Position Einstellungen durch Klicken auf &quot;1 Mal loop&quot;. Bewerten Sie die resultierenden Bilder für Durchlicht-Beleuchtung, Fokus und Rahmung. Wenn der Fokus verschoben hat, setzen Sie den Fokus für jede Position unter der Registerkarte XY. Warten Sie 10 min und wiederholen Sie diesen Schritt, bis Fokus ist stabil. </li><li> Nachdem alle Einstellungen überprüft und getestet wurde, starten Sie die automatische Experiment, indem Sie auf den &quot;Run Now&quot;-Button. </li></ol></li&gt; </ol> Abschnitt 4 - Bildverarbeitung und Export Data Export <ol><li> Datensätze während der Live-Cell-Imaging des Verkehrs oder Verbreitung Veranstaltungen erhalten sollten aus der NIS Elements-Software in gängige Dateitypen werden für die spätere Verwendung in Präsentationen und Publikationen (Supplemental Movie 3) exportiert. So exportieren Filme öffnen Sie das entsprechende Rohmaterial. Nd2 Datei in NIS Elements und wählen Sie die &quot;Split-Anteil&quot; im Hinblick auf die gewünschten Kanäle fluoreszierenden visualisieren. Wiedergabe der Datei mit einer geeigneten Geschwindigkeit; 5 Bildern pro Sekunde ist ein guter Ausgangspunkt für die Visualisierung der schnellen Transport. </li><li> Fügen Sie einen Zeitstempel, eine Echtzeituhr während der Filmwiedergabe zu vertreten. Auf das Bild mit der rechten Maustaste und wählen Sie, ND-Informationen hinzufügen. Ein digitaler Zähler wird in der oberen linken Ecke angezeigt. <ol><li> Bearbeiten Sie den Zeitstempel, um Informationen anzuzeigen. Rechts auf der Theke auf und wählen Sie Bearbeiten ND-Informationen. In der anschließenden Pop-up-Fenster, den Text bearbeiten, um die Phantasie widerspiegelnng Parameter, die wichtig sind. Bearbeiten Schriftart, Farbe und Größe für Klarheit. </li></ol></li><li> Zum Menü &quot;Bearbeiten&quot; und finden Sie &quot;Create view Momentaufnahme&quot; oder drücken Sie die &quot;x&quot;-Taste. Dieser Befehl öffnet die &quot;Ansicht Snapshot&quot;-Fenster. Wählen Sie &quot;Zu allen Frames anwenden&quot;, um eine 8-Bit-, RGB-, Export-ready-Datei mit den fluoreszierenden Kanäle aus dem gesamten Film zu erzeugen. </li><li> Speichern als. AVI-Datei für Cross-Plattform-Kompatibilität. Stellen Sie die Wiedergabe bei 200 ms pro Frame. Die. AVI-Dateien durch NIS Elements erzeugt wird, kann dann weiter mit anderen Konvertierungs-Software werden in den gewünschten Dateityp komprimiert. </li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Ziel des Live Cell Imaging beobachtet biologische Prozesse, wie sie ohne signifikante Veränderung durch den Akt der Beobachtung auftreten. Umwelt-Kontrolle, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Fluoreszenz-Beleuchtung: Dieses Ziel wird durch die Optimierung der drei Variablen erreicht. Diese inter-abhängigen Variablen müssen ausgeglichen werden, um tragfähige Abbildungsbedingungen erreichen. Die Protokolle vorgestellt nutzen spezifischen Bedingungen, die repräsentative Ergebnisse zu produzieren. Wir werden kurz au...

Infektion des peripheren Nervensystems (PNS) durch alphaherpes Viren wie Herpes-simplex-Virus (HSV) -1, -2 und Pseudorabies-Virus (PRV) umfasst mehrere komplizierte und stark regulierten Schritte gesamten Lebenszyklus des Virus. Transport innerhalb der Neuronen des PNS ist kritisch während der Ereignisse der beiden primären Virusinfektion und anschließende inter-Host Verbreitung. Die molekularen Mechanismen, die beiden Komponenten des viralen Lebenszyklus modulieren; gerichteten Transport von viralen Baugruppen vom Zellkörper in Axonen (anterograde Transport) und die anschließende Übertragung der Virionen auf empfängliche Zellen (anterograde Spread) sind wichtig, um Verständnis Herpesvirus Pathogenese. Die Transport-und Austritt von Viruspartikeln in Neuronen ist abhängig von der Montage eines reifen infektiösen Virion 1,2. Vorher festgelegten Assays, einschließlich Immunfluoreszenz (IF) und Elektronenmikroskopie (EM), wurden verwendet, um die Teilchen Montagezustand und prot studierenEin Wechselwirkungen mit virion Transport und Ausbreitung 3-6 verbunden. Doch die dynamische Natur der Transport Virionen und experimentelle Artefakte durch chemische Fixierung führte die Interpretation der fixierten Bilder 7,8 verwechselt. In jüngster Zeit haben eine Reihe von viralen fluoreszierenden Fusionsproteine ​​für HSV und PRV, die geringe Auswirkungen auf die Protein-Funktion beschrieben worden. Green Fluorescent Protein (GFP) und Rot fluoreszierende Proteine ​​(mCherry oder mRFP) Fluorophore sind oft gepaart Bildgebung von zwei der drei strukturellen Komponenten eines reifen Virion erlauben: Kapsid, Spelzen, und Glykoprotein 9-11. Live Cell Imaging der anterograde Transport mit Dual-markierten Viren visualisiert die Montage Zustand der viralen Partikel während des Transports. Ähnliche Fluorophor Ausdruck Virusstämme werden verwendet, um Anzahl und die Vielfalt der viralen Genomen nach Ausbreitung 12,13 visualisieren. Die Eigenschaften der fluoreszierenden Proteine ​​(Bewertung in 14,15) stark beeinflussendie Fähigkeit, virale oder zelluläre Baugruppen visualisieren. Die intrinsischen Eigenschaften des fluoreszierenden Proteins, einschließlich Self-Interaktionen und Stabilität, sollten bei der Entwicklung und Erprobung neuer Protein-Fusionen für die Erhaltung der Wildtyp-Funktionalität werden. In Verbindung mit fluoreszierenden Protein-Fusionen, zwei in vitro-Zellkultur-Systeme gut charakterisiert sind für Live-Cell-Imaging von Herpes-Virus-Infektion eingesetzt: dissoziierten 16 und 17 Kompartimente (Abbildung 1A) Ratte überlegen Halsganglien (SCG) Neuronen. Bei beiden Systemen werden embryonale SCG seziert, dissoziiert einzigen Zellkörper und plattiertem zur in vitro Kultivierung von 18. SCG Neuronen sind Teil des vegetativen Nervensystems und kann leicht kultiviert und differenziert von neuronalen Wachstumsfaktor (NGF) zu einer reifen polarisierten Zustand ex vivo. Dissoziierte SCG Neuronen bilden ein ausgedehntes Netz von Axonen, die f erlaubtoder die Visualisierung von viralen Partikeln, wie sie anterograden transport 6 zu unterziehen. Unterteilte SCG Kulturen bieten fluidischen Trennung der neuronalen Zellkörper (S Abteil) und distalen Axon-Termini (N Abteil) 19. Eine Reihe von detaillierten Protokolle für den Bau und die Nutzung von compartmentalized Neuronen mit original 20 oder mutierend Campenot Kammern 17 wurden bereits veröffentlicht. Fluidic Isolierung ermöglicht selektive Infektion von neuronalen Zellkörper und den Nachweis von Nachkommenvirionen nach dem Transport zu isolierten Axon-Termini. Plating Epithelzellen über den Termini vor der Infektion bietet Rezipientenzellen für Ausbreitung der Virusinfektion. Es gibt viele wesentliche Elemente wichtig für alle Live Cell Imaging Experimente, aber die meisten für uns relevanten Protokolle sind: automatisierte Bildaufnahme, fluoreszierende Beleuchtung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Umweltkontrolle. Für alle bildgebenden Experimenten verwenden wireine invertierte, automatisierte Epifluoreszenz Beleuchtung Mikroskop (Abbildung 1B). Das Mikroskop ist rund um die Nikon Eclipse-Ti Basis gebaut und beschäftigt eine Reihe von Computer gesteuert motorisierten Systeme möglichst schnell rekonfiguriert das Mikroskop während automatisierte Bildaufnahme. Für Fluoreszenz-Beleuchtung, verwenden wir ein breites Spektrum Quecksilberbogenlampe, die gedämpft werden mit Neutralfilter entlang der Beleuchtungspfad können. Anregung Filter begrenzen das Spektrum der Fluoreszenz-Beleuchtung und wenn es mit Multi-Pass-dichroitischen Spiegel und Fluoreszenzemission Filter visualisieren spezifischen fluoreszierenden Verbindungen gepaart. Die Anregungs-und Emissions-Filter werden in unabhängigen, schnelles Umschalten Filter Räder montiert, um eine schnelle sequentielle Erwerb von verschiedenen fluoreszierenden Kanäle ermöglichen. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist ferner mit einer empfindlichen und schnellen EM-CCD-Kamera, nützlich für die Detektion von niedriger Signalstärke und kurze Bild Lesezeiten verbessert. Umweltkontrolle auf der MicroscOPE ist mit einer Bühne oben Wärmeschrank und eine Objektivlinse Heizgerät Proben bei erhöhten Temperaturen zu halten, während ein befeuchtet und CO 2 angereicherten Atmosphäre in den Inkubator geleitet wird erreicht. Das Mikroskop wird in einem abgedunkelten Raum mit Umgebungstemperatur gehalten knapp 25 ° C gehalten und Außenleuchte mit Verdunkelung an allen Fenstern minimiert. Die folgenden Protokolle beschreiben die Verwendung dieses Systems für anterograde Transport und Ausbreitung Assays. Eine Reihe von Alternativen gibt es für die Variablen des Live Cell Imaging steuern. Die Steuerung der Mikroskopie Einstellungen können manuell oder durch automatisierte Systeme abhängig von proprietärer Software durchgeführt werden. Fluoreszenz Beleuchtung kann mit Halogen-, LED-oder Laser-Quellen erreicht werden. Die Geschwindigkeit der Bildgebung durch die Geschwindigkeit der Filterwechsel und die Zeit, um das Signal mit dem gepaarten Detektionssystem sichtbar verändert. Umwelt-Steuerung kann mit spezialisierten Hardware auf dem Meilen erreicht werdenkroskop Stufe Gehäuse ganz oder teilweise von dem Mikroskop in einem erwärmten und befeuchteten Feld oder durch Erhöhen der Temperatur des Raumes, wo Mikroskopie durchgeführt wird. Jede dieser Alternativen hat Vor-und Nachteile in Bezug auf Kosten und Leistung. In der anschließenden Protokoll, detail wir den Einsatz von Live Cell Imaging, um eine schnelle anterograde Transport und anterograde Ausbreitung von Viren alphaherpes durch den Einsatz von rekombinanten Virusstämme zu studieren. Echtzeit-Live Cell Imaging visualisiert Kapsid, Spelzen, und / oder Glykoprotein Co-Lokalisation auf dynamische Strukturen unterziehen Transport innerhalb 11 Axone. Übernachtung Zeitraffer Bildgebung compartmentalized neuronalen Kulturen visualisiert axonal virion Austritt und Infektion empfänglicher Zellen 12. Die hier vorgestellten Protokolle sind für den Einsatz mit unseren speziellen Imaging-System optimiert worden, sind aber in groben Zügen in Bezug auf die vier Elemente des Live Cell Imaging präsentiert. In der Diskussion, die wirwird näher einige der Optimierung, die notwendig für eine erfolgreiche Experimente ist.

<table><tbody><tr><td>35 mm Kulturschale mit Glasboden,</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Verona, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopgehäuse </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Motorisiertes Mikroskop X-Y-Tisch</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierte Filterräder</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 10-Positionen-Filterrad</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstoffröhrenbeleuchtung </td><td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Kanada</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Multiband-Fluoreszenzfilter-Sets</td><td>, Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Kamera</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide Stage Top Umwelt-Inkubator</td><td>Live Cell Instruments; Seoul, Südkorea</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>Objektivheizung</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 Controller 150819-12-08</td><td></td></tr><tr><td>Software zur Heizungsanalyse</td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging von alphaherpes virus anterograde transport und aufstrich

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie Techniken, sowie die Konstruktion von rekombinanten Virusstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine ​​exprimieren haben Echtzeit-Visualisierung von Transport und die Ausbreitung von alphaherpes Virusinfektion von Neuronen aktiviert. Der Nutzen der neuen fluoreszierenden Fusionsproteine ​​Virusmembran, Spelzen und Kapside in Verbindung mit Live Cell Imaging, identifiziert Viruspartikel Baugruppen unterziehen Transport innerhalb Axone. Ähnliche Instrumente wurden erfolgreich für die Analyse von Zell-Zell von Viruspartikeln verbreitet, um die Anzahl und die Vielfalt der Virionen zwischen Zellen übertragen quantifizieren beschäftigt. Wichtig ist, produzieren die Techniken des Live Cell Imaging der anterograde Transport und Ausbreitung eine Fülle von Informationen, einschließlich Partikeltransport Geschwindigkeiten, Verteilungen von Partikeln und zeitliche Analysen von Protein-Lokalisierung. Neben den klassischen viralen genetischen Techniken haben diese Methoden kritische Einblicke bereitgestelltin wichtige mechanistische Fragen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail die bildgebenden Verfahren, die entwickelt, um grundlegende Fragen der alphaherpes Virus Transport und Ausbreitung zu beantworten waren.

Anterograde Transport Anwendung dieses Protokolls, um Infektionen von dissoziierten SCG Kulturen mit PRV 348 hat ein rekombinantes PRV-Stamm, die GFP-US9 und GM-mCherry Membranfusionsproteine, die Visualisierung der anterograde Transport von Virionen (Abbildung 3 und Supplemental Movie 4) erleichtert. Incorporation dieser Fusionsproteine ​​in virale Partikel zu deren Erkennung auf den Transport puncta und den genannten bildgebenden Bedingungen minimieren die je...

Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine ​​Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vorgänge des Transports und der Ausbreitung von Herpesviren mittels fluoreszierender Proteinfusionen in primären neuronalen Kulturen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Probeninkubation bei physiologisch relevanten Temperaturen an einem Mikroskop etabliert wird, das eine schnelle Umschaltung der Fluoreszenzbeleuchtung ermöglicht. Im zweiten Schritt werden die Parameter der Fluoreszenzbildgebung so eingestellt, dass einerseits zelluläre Photodamage begrenzt wird, andererseits aber aussagekräftige Daten gewonnen werden können.Anschließend erfolgt entweder die sequenzielle Erfassung der fluoreszierenden Kanäle oder eine Mehrpositionsaufnahme. Im letzten Schritt werden mehrteilige, gekachelte Bildaufnahmen angefertigt. Die Daten werden analysiert und für die Präsentation sowie Veröffentlichung umformatiert.Schließlich dient diese Methode der Live-Cell-Imaging dazu, die Bewegung fluoreszierender viraler Partikel in Neuronen zu verfolgen und die Ausbreitung der Infektion zwischen Zellen zu beobachten. Diese Methode kann Einblicke in den Transport und die Ausbreitung von Herpesviren in Neuronen ermöglichen. Sie kann außerdem auf andere dynamische Vorgänge in der Zellbiologie und Mikrobiologie angewendet werden, wie beispielsweise die endozytotische Aufnahme von Partikeln oder die Zellmigration.Bevor ein Bildgebungs-Experiment beginnt, schließen Sie den Inkubator für die Mikroskopstufe an und starten Sie die Aufwärmphase. Nach 30 Minuten schalten Sie das Mikroskop, die transmittierte und die epifluoreszierende Lichtquelle sowie die automatisierten Hardware-Steuerungen ein. Öffnen Sie anschließend die Mikroskop-Steuerungssoftware NIS Elements, um eine Verbindung zum Mikroskop herzustellen.Hier ist ein Screenshot einer Standard-Benutzeroberfläche in NIS-Elementen dargestellt. Die Wiedergabe- und Stopp-Tasten steuern das Live-Bildfenster, das die aktuellen Hardware-Konfigurationen für die Bildgebung sowie das aktuell abgebildete Objekt zeigt. In der oberen Leiste befinden sich eine Reihe optischer Konfigurationen, die voreingestellte Hardware-Einstellungen implementieren, um das Mikroskop für die transilluminierte oder fluoreszenzbasierte Detektion einzurichten.Die Kamera-Steuerung und Belichtungseinstellungen ermöglichen die Konfiguration der Kameradetektion, um die Bildqualität und Geschwindigkeit zu optimieren. Alle Experimente werden über die ND-Aufnahme-Steuerungen koordiniert. Als Nächstes befestigen Sie einen Objektivwärmer am entsprechenden Öl-Immersion-Objektiv und anschließend den Inkubator für den Objekttisch am motorisierten Mikroskoptisch.Stellen Sie sicher, dass der geeignete Probeneinsatz eingesetzt ist, und verbinden Sie anschließend die befeuchtete Luftzufuhr der Inkubatorkontrolle mit dem Eingangsanschluss des Inkubators auf dem Objekttisch. Schalten Sie den Inkubator und die Objektivheizung ein und stellen Sie die Temperatur auf die zuvor überprüften, für das jeweilige Objektiv und die Probe spezifischen Bedingungen ein. Öffnen Sie abschließend das Steuerventil an der 5 % Kohlendioxid und 95 % Atmosphärenluft enthaltenden Gasflasche, um den Inkubator auf dem Objekttisch mit kohlendioxidangereicherter Luft zu versorgen.Um die Transportvorgänge von eintretenden, hochinfektiösen Virionen in Echtzeit abzubilden, platzieren Sie zuerst eine Zellkulturschale mit infizierten Neuronen für mindestens 10 Minuten in den Inkubator auf dem Mikroskoptisch, bevor Sie das Experiment starten. Suchen Sie anschließend mithilfe von Durchlicht und dem Okular des Mikroskops einen neuronalen Zellkörper, der eine klar abgegrenzte axonale Ausstülpung aufweist.Das Auffinden bildgebbarer Bereiche in der neuronalen Kultur ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Der Erfolg wird sichergestellt, indem mehrere Kulturen angelegt werden, um im Fall von schlechtem Zellwachstum oder Infektion oder einer physischen Störung der Kultur während der Bildgebung Ersatz zur Verfügung zu haben. Schalten Sie nun mithilfe der Mikroskop-Software den Lichtweg auf die EM-CCD-Kamera um und klicken Sie anschließend auf die Wiedergabetaste, um ein Live-Bildfenster zu starten.Nach der Einstellung der optimalen Belichtungsparameter der Kamera für jeden Satz fluoreszierender Proteine den Elektronenvervielfachungsgewinn der Kamera auf 300 setzen. Um die Belichtungszeit zu minimieren und die Detektion schwacher Signale zu verbessern. Das Live-Bildgebungs-Fenster anhalten, um eine Bleiche des Probenmaterials zu verhindern.Als Nächstes, nachdem die Belichtungszeiten eingestellt und ein gut definierter Bereich des Axons in den NIS-Elementen gefunden wurde, konfigurieren Sie die Software für die sequenzielle Bildaufnahme. Öffnen Sie das Dropdown-Menü „Applications“ und wählen Sie die Anwendung „Six D Define Run Experiment“. Klicken Sie im ND-Aufnahmefenster auf den Reiter „Time“, um die Frequenz der Bildaufnahme festzulegen.Stellen Sie das Intervall auf keine Verzögerung und die Dauer auf fünf Minuten ein. Klicken Sie nun auf den Reiter Lambda, um die voreingestellten Hardware-Konfigurationen für die mehrfache Aufnahme fluoreszierender Bilder auszuwählen. Aktivieren Sie das erste Kästchen und wählen Sie dann in den darauf folgenden Dropdown-Menüs eine geeignete Hardware-Konfiguration aus.Wählen Sie das Feld „In Datei speichern“ aus und konfigurieren Sie den Speicherort und den Dateinamen der Ausgabedatei des Experiments. Sobald alle diese Parameter festgelegt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche „Jetzt ausführen“, um das Experiment zu starten. Die Bildaufnahmerate wird über die Belichtungseinstellungen und die Größe des aufgenommenen Bildes optimiert.Verwenden Sie das Werkzeug für den Bereich von Interesse in NIS-Elementen, um den Bereich von Interesse zu definieren. Wählen Sie einen Bereich zwischen 25 und 50 % der gesamten Bildfläche, um eine Übernacht-Zeitrafferaufnahme von Enter-Grade-Spread-Ereignissen durchzuführen. Platzieren Sie zunächst vorsichtig die Kulturschale in den Inkubator auf dem Mikroskoptisch.Nachdem sichergestellt wurde, dass die Position des Objektivs an der Seite der Schale eingestellt ist, das Objektiv langsam in den Fokus bringen und darauf achten, dass es nicht in die Probe hineingedrückt wird. Sobald das Fokussierfeld identifiziert wurde, das Objektiv langsam in die Mitte der Schale nahe der inneren Barriere bewegen, die die innere Seite des Axon-Kompartiments markiert, wobei die Tiefenschärfe beibehalten und ein Hineindrücken in die Probe vermieden werden muss. Anschließend die Neuronen in der Kulturschale mit etwa zwei Millilitern PBS bei 37 Grad Celsius außerhalb des Teflon-Rings umgeben, um eine Austrocknung der Probe zu minimieren und eine thermische Isolation zu gewährleisten.Danach alle Neutraldichtefilter aktivieren, um die Intensität der Beleuchtung auf das niedrigstmögliche Niveau zu begrenzen, wodurch eine häufige Bildaufnahme über längere Zeiträume hinweg ohne übermäßige phototoxische Schäden ermöglicht wird. Im ND-Aufnahmefenster den großen Bildreiter anklicken und anschließend einen Bereich auswählen, der aus fünf mal zwei Bildern besteht. Unter Verwendung einer 7 %igen Überlappung zum Zusammensetzen die mehreren Positionen nacheinander parallel abbilden.Während des Übernacht-Films wählen Sie die Registerkarte „XY-Positionen“. Definieren Sie dann die Positionen, die den Mittelpunkt für jeden großen Bildbereich festlegen. Der Fokuspunkt sollte der Zellkern sein; positionieren Sie das Objektiv so, dass für die Mehrheit der Zellen eine deutlich abgegrenzte Kernmembran sichtbar ist.Klicken Sie dann einmal auf die Schleife, um die Belichtungs- und Positionseinstellungen zu testen, und bewerten Sie die resultierenden Bilder hinsichtlich Durchlicht, Beleuchtung, Fokus und Bildausschnitt. Nachdem alle Einstellungen überprüft und getestet wurden, starten Sie das automatisierte Experiment, indem Sie auf die Schaltfläche „Jetzt ausführen“ klicken, um die während der Live-Cell-Bildgebung aufgezeichneten Filme zu exportieren. Öffnen Sie zunächst die entsprechende rohe ND2-Datei in NIS-Elements und wählen Sie die Ansicht mit getrennten Komponenten.Um die gewünschten fluoreszierenden Kanäle zu visualisieren, spielen Sie die Datei mit einer geeigneten Geschwindigkeit ab. Fünf Bilder pro Sekunde sind ein guter Ausgangspunkt zur Visualisierung schneller Transportvorgänge. Fügen Sie eine Zeitanzeige hinzu, um während der Filmwiedergabe eine Echtzeituhr darzustellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie „ADD ND information“.In der oberen linken Ecke erscheint ein digitaler Zähler. Um den Zeitstempel zu bearbeiten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Zähler und wählen Sie „ND-Informationen bearbeiten“. Bearbeiten Sie im daraufhin erscheinenden Fenster den Text, sodass er die relevanten Bildgebungsparameter widerspiegelt. Ändern Sie Farbe und Größe der Schrift, um die Lesbarkeit zu verbessern.Wechseln Sie dann zum Bearbeitungsmenü und wählen Sie „Ansichtsschnappschuss erstellen“, um das Fenster für den Ansichtsschnappschuss zu öffnen, um eine 8-Bit-RGB-Exportdatei zu generieren, die die fluoreszierenden Kanäle aus dem gesamten Film enthält; wählen Sie „Auf alle Bilder anwenden“. Speichern Sie die Datei abschließend im AVI-Format, um plattformübergreifende Kompatibilität zu gewährleisten, und stellen Sie die Wiedergabegeschwindigkeit auf 200 Millisekunden pro Bild ein. In diesem Phasenkontrastbild ist eine repräsentative, reife, dissoziierte Kultur des oberen Halsganglions (superior cervical ganglia, SCG), die für die Abbildung des Intergrad-Virionentransports verwendet wird, dargestellt; PRV-348-infizierte Neuronen exprimieren die GFP-19- und mCherry-Membranfusionsproteine.In dieser Abbildung wird eine repräsentative Live-Cell-Bildgebung von SCG-Axonen acht Stunden nach Infektion mit PRV 348 gezeigt, bei der anterograd transportierte Strukturen in distalen Axonen in zwei fluoreszierenden Kanälen, GFP und mCherry, sichtbar gemacht werden. Eine anterograd transportierte Struktur, wie durch die weißen Pfeile angezeigt, bewegt sich entlang des Axons fort. Die beiden fluoreszierenden Proteine sind räumlich versetzt zueinander, bedingt durch die sequenzielle Aufnahme der Fluoreszenzkanäle und die schnelle Bewegung der viralen Strukturen.Die Anwendung dieses Protokolls auf Infektionen dissoziierter SCG-Kulturen mit PRV 3 48 hat die Visualisierung des anterograden Transports von Vons ermöglicht. Die Einbindung dieser Fusionsproteine in virale Partikel führt zu deren Nachweis auf transportierenden Pünktchen, die als bewegte fluoreszierende Punkte sichtbar werden. Die oben genannten Bildgebungsbedingungen minimieren die Verschiebung jedes Fluorophors auf einem sich bewegenden Partikel während des Filterwechsels.Die Verwendung von schnellschaltenden Filterrädern und gepaarten Multipass-Dichroikspiegeln ermöglicht die schnelle, sequenzielle Aufnahme von zwei oder mehr fluoreszierenden Kanälen mit Geschwindigkeiten von bis zu 0,8 Bildern pro Sekunde innerhalb eines dreiminütigen Bildaufnahmezeitraums. Es werden zahlreiche transportierte Punta beobachtet, und große Stichprobenumfänge für Kolokalisierungsanalysen lassen sich rasch generieren. Hier ist ein Schema des kompartimentierten Kultursystems abgebildet, bei dem SCG-Neuronen im linken Kompartiment platziert sind und axonale Fortsätze unterhalb der inneren Barrieren bis in das äußerste rechte Kompartiment hineinragen.Die folgenden Bilder wurden aus einem großen, zeitraffergestützten, gekachelten Bildfilm der Virionenübertragung von PRV 4 27-infizierten Axonen in empfängliche epitheliale Zellen ausgewählt. In diesem ersten Bildausschnitt erscheinen die übertragenen fluoreszierenden YFP- und RFP-Bilder zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Infektion. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die empfangenden Zellen, ein membrangebundenes YFP sowie Fusionsproteine aus VP26 und mRFP zu exprimieren.Die weiße Box hebt einen Bereich der empfängenden Epithelzellen hervor, der infizierende Kapsid-Assemblys enthält. Hier wird derselbe Bereich wie im vorherigen Bild ausschließlich im RFP-Kanal dargestellt. Die durchgezogene weiße Linie kennzeichnet die schematische Darstellung des Zellumrisses. Die gestrichelten weißen Linien zeigen die Zellkerne an, und die blauen Linien umreißen die Axone. In diesem zweiten Panel sind nur die YFP- und RFP-Kanäle gemeinsam dargestellt. Beachten Sie die große Anzahl von MRFP-Punkten, die mit den Axonbahnen assoziiert sind.Diese Zellen wurden kürzlich infiziert und exprimieren keines der beiden Fusionsproteine. Infizierte Zellen können rückwärts verfolgt werden, um die fluoreszierenden Kapside sichtbar zu machen, die die Virusinfektion eingeleitet haben. Diese einzelnen Zellen können aus dem großen Bildausschnitt isoliert und ohne nennenswerten Detailverlust verfolgt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass die Live-Cell-Mikroskopie den beobachteten biologischen Prozess beeinflusst. Eine sorgfältige Optimierung dieser Protokolle ermöglicht jedoch die Visualisierung, ohne den Prozess zu verändern.

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

Forschung

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