Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Migration von nicht-adhärenten Effektor-T-Lymphozyten über eine Monoschicht adhärenter Tumorzellen zu zeigen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Monoschicht aus adhärenten Tumorzellen in den Vertiefungen von Poly-D-Lysin-beschichteten Teflon-maskierten Objektträgern etabliert wird, da in einem zweiten Schritt fluoreszenzmarkierte Effektor, T-Lymphozyten, unter Verwendung eines Zellsedimentationsverteilers in das Zentrum der Monoschicht sedimentiert werden. Anschließend werden Licht- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Wanderung der nicht adhärenten Zellen über die Monoschicht sichtbar zu machen.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Migrations- und Effektorfunktionen von nicht-adhärenten T-Lymphozyten in Co-Kultur mit einer adhärenten Tumorzell-Monoschicht erhalten bleiben, nachdem die Lymphozyten mit einem retroviralen Vektor transduziert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die radiale Migration von nicht-adhärenten Effektor-T-Lymphozyten in Kohlekultur mit adhärenten Tumorzellen gemessen werden kann. Dies hat weitreichende Auswirkungen auf Patienten mit primären oder metastasierten Hirntumoren, da allogene zytotoxische T-Lymphozyten, die so modifiziert sind, dass sie ein Pro-Wirkstoff-Aktivator-Gen exprimieren, wie z. B. die Cytosin-Deaminase, als multimodaler Ansatz zur Eliminierung von Tumoren im Gehirn getestet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Heterogenität des Tumorzellwachstums in den Adhärenzmerkmalen Schwierigkeiten haben, adhärente Tumorzell-Monoschichten zu etablieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Erzeugung einer gleichmäßigen Tumormonoschicht und einer effektiven Sedimentation von nicht-adhärentem L-O-C-T-L ein erfahrenes Verständnis der Eigenschaften beider Zelltypen erfordern. Zu Beginn bis zu vier sterilisierte Plätze.

10 Well teflonbeschichtete Objektträger in einer sterilen 150 Millimeter x 15 Millimeter großen Petrischale. Stellen Sie eine 35 Millimeter x 10 Millimeter große Petrischale mit zwei bis drei Millilitern sterilem Wasser neben die Objektträger, um für Feuchtigkeit zu sorgen. Als nächstes präkotieren Sie die Objektträger, indem Sie jede Vertiefung mit einer Lösung von 100 Mikrogramm pro Milliliter entweder Poly-D-Lycin oder Poly-L-Lysin bedecken.

Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur, aspirieren Sie dann die Lösung und spülen Sie die Oberfläche der Vertiefung zweimal mit PBS aus, während die Probenvertiefungen vorbereitet sind. Entnehmen Sie einen konfluenten Kolben mit adhärenten Tumorzellen. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Lichtmikroskopie und suspendieren Sie die Zellen dann in einer Konzentration von fünf mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter.

In gepuffertem Wachstumsmedium je nach Tumorzelltyp fünf bis 10 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben, das Volumen der Vertiefung mit Medium auf 40 Mikroliter bringen und langsam auf und ab pipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Lassen Sie die Tumorzellen nach dem Aussäen der Vertiefungen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur absetzen. Legen Sie dann den Deckel auf die Petrischale und geben Sie ihn vorsichtig in einen 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid und inkubieren Sie ihn mindestens 24 Stunden lang.

Wechseln Sie das Nährmedium täglich in den Vertiefungen, indem Sie vorsichtig einen Teil des Mediums aus der Monoschicht entfernen und durch ein größeres Volumen frisches, vollständiges T-Zell-Medium ersetzen. Die Zellen sind in der Regel innerhalb von ein bis drei Tagen konfluent, um die Zellen für die Sedimentation auf der Tumorzell-Monoschicht vorzubereiten. Ernten Sie die nicht adhärenten T-Zellen und markieren Sie sie mindestens eine Stunde vor dem Assay mit einem Zellproliferationsfarbstoff gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Legen Sie anschließend die befeuchtete Kammer mit den Tumorzell-Objektträgern in die biologische Sicherheitswerkbank. Waschen Sie die Vertiefungen durch Pipettieren mit PBS und geben Sie dann 45 Mikroliter vollständiges Medium mit 10 % Serum in die Vertiefungen. Schieben Sie einen sterilisierten Zellsedimentationsverteiler über die Vertiefungen, bis der Haken am Ende des Verteilers den Boden des Objektträgers berührt.

Stellen Sie sicher, dass das Medium in den Verteilerkanälen sichtbar ist. Zählen Sie dann die nicht anhaftenden Zellen und suspendieren Sie sie bei ein- bis zwei mal 10 bis zur fünften. Zellen pro Mikroliter im Medium.

Unterbrechen Sie die Zellen vorsichtig, um Zellcluster zu beseitigen, die die Zellsedimentation beeinträchtigen würden. Pipettieren Sie langsam jeweils einen Mikroliter der Zellsuspension in den Kanal des Verteilers. Nun, dann inkubieren Sie das Gerät 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen im Kanal auf der Monoschicht absetzen können.

Nachdem sich die Zellen abgesetzt haben, heben Sie den Verteiler vorsichtig gerade nach oben, ohne den Objektträger zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Zellpellets innerhalb des Umfangs des Verteilerkanals platziert wurden. Mit Hilfe eines Mikroskops sollten die sitzenden Zellen leicht an der Monoschicht haften, damit das Pellet durch leichtes Bewegen des Objektträgers nicht zerstreut wird.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Zellen sedimentiert sind, übertragen Sie den Objektträger in ein inverses Mikroskop, das mit einer Kohlendioxid- und Feuchtigkeitskammer ausgestattet ist. Verwenden Sie das Vier-fach-Objektiv für die Hellfeld- und Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung der Zellen. Erfassen Sie Bilder eines bestimmten Bereichs in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen und fügen Sie dann Mikrometerbalken mit der Bilderfassungssoftware hinzu.

Bewahren Sie den Objektträger zwischen den Zeitpunkten in einem befeuchteten Inkubator auf, sobald alle Zeitpunkte erfasst sind. Ziehen Sie die Bilddateien per Drag & Drop in das Bildbearbeitungsprogramm und wählen Sie die Option Ebene hinzufügen, um eine Bilddatei mit mehreren Ebenen zu erstellen. Führen Sie das Licht und die fluoreszierenden Bilder in einer Ebene zusammen.

Verwenden Sie die Erfassungssoftware, um Bilder von einem Bereich von acht Millimetern x acht Millimetern aufzunehmen. Die Software sollte so eingestellt sein, dass aufgenommene Bilder automatisch mit dem Kanal zusammengefügt werden, der am besten über das gesamte Feld dargestellt wird. Wenn nur Fluoreszenzkanäle abgebildet werden, sollte dies der Kanal für die Abbildung der adhärenten Zellen sein.

Alternativ können die Bilder mit Hilfe einer Bildbearbeitungssoftware zusammengefügt werden. Dies geschieht, indem Bereiche der Bilder, die von einem Bild zum anderen erhalten bleiben, ausgerichtet und die Bilder übereinander gelegt werden, bis ein vollständiges Bild erzeugt wird. Fügen Sie die Bilder mit der Bildsoftware zusammen.

Verwenden Sie die kombinierten Bilder, um mit der Image J-Software Fluoreszenzkarten für die Oberflächenintensität zu erstellen, um die Aggregation oder Ausbreitung von fluoreszierenden T-Zellen über die Zeit zu visualisieren. Humane allo-reagierende zytotoxische T-Lymphozyten, bekannt als Allo CTL, transduziert, mit einem replikationskompetenten retroviralen Vektor, der für ein smaragdgrün fluoreszierendes Proteinexpressionsgen kodiert, saßen im Zentrum einer Monoschicht von Gliomzellen. Nach vier Stunden hatte das gesamte OCTL nach 24 Stunden sichtbare Aggregate gebildet.

In der adhärenten Zellmonoschicht erschienen leere Flecken, die auf eine Lyse der Tumorzellen hindeuteten, und ein Teil von allo CTL war über die Vorderkante hinaus gewandert. Fluoreszenzmarkierte murine Allo CTL saßen in der Mitte einer Monoschicht von fluoreszenzmarkierten Gliomzellen der Grippe nach einer Stunde Allo CTL, die eng mit den Gliomzellen verbunden war, nach 48 Stunden war Allo CTL von der Mitte der Oberflächenintensität der Monoschicht weggewandert. Fluoreszenzkarten wurden aus diesen Bildern mit der Bild-J-Software erstellt und zeigen eine erhebliche Migration vom Zentrum weg nach 48 Stunden.

Es ist wichtig, das Kulturmedium für die Tumorzell-Monoschicht täglich zu wechseln, um gesunde Kulturbedingungen aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sollte die Sedimentation von nicht adhärenten Zellen nach dieser Beherrschung etwa 20 Minuten dauern. Andere Methoden, wie z. B. die Zellwegverfolgung, können verwendet werden, um Fragen über die Geschwindigkeit zu beantworten, mit der allo CTL durch die Monoschicht wandert, oder über die Zeit, in der sie mit Tumorzellen in Kontakt kommen, die ihre zytotoxischen Funktionen erfüllen.

Dieses Protokoll wird Forschern auf dem Gebiet der Immungentherapie helfen, die Migration von genmodifizierten T-Lymphozyten in Co-Kultur mit Tumorzellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man nicht-adhärente und adhärente Zellen pro Co-Kultur präpariert und wie man den Zellsedimentationsverteiler verwendet, um die horizontale radiale Migration von nicht-adhärenten Zellen über die Tumorzell-Monoschicht zu untersuchen.