Name: Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie die radiale Migration von nicht-haftenden T-Lymphozyten über Tumorzell-Monolagen mittels Sedimentationsmanifold und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen für Immuntherapieforschung.

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1. Schieben Vorbereitung <ol><li> Legen Zellsedimentation Manifold gleitet in Sterilisationsbeutel und Dichtung mit Autoklav-Band. Vor der Teflon-beschichteten Seite des Schiebers die Papierseite des Beutels an Kunststoff Ablagerungen auf den Vertiefungen zu vermeiden. </li><li> Autoklav Beutel für 15 min bei 121 ° C. </li><li> Objektträger aus Sterilisationsbeutel in einer Biosicherheitswerkbank und in eine sterile 150 x 15 mm sterilen Petrischale. Bis zu vier Dias pro Gericht passen. Legen Sie eine 35 x 10 mm Petrischale neben den Folien. Fügen Sie 2-3 ml sterilem H 2 O, um Befeuchtung zu schaffen. </li><li> Precoat-mit Poly-D-Lysin an 100 ug / ml unter Verwendung von genügend Volumen, um gut decken die gesamte. Nach einer Stunde bei RT absaugen und spülen Sie die Oberfläche der Wanne zweimal durch Pipettieren 1x PBS über die Oberfläche der Vertiefungen. </li><li> Fügen Sie optional Fibronektin oder andere ECM-Komponenten zu einer stärkeren Tumorzellhaftung zu gewährleisten. Hinzufügen Fibronektin bei 5 ug / ml in genügend Volumen That den Vertiefungen wird nicht trocken in einem kurzen Zeitraum bei Raumtemperatur. <ol><li> Nach 1 Stunde, saugt den Restlösung und waschen zweimal durch Auf- und Abpipettieren mit 1x PBS. </li></ol></li><li> Halten PBS auf den Brunnen, bis Tumor ist bereit für die Beschichtung. Verwendung gleitet am selben Tag. </li><li> Ernte einen konfluenten Flasche des gewünschten adhärenten Tumorzelltyp. Zählen lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau-Farbstoffausschluss durch Lichtmikroskopie und Resuspension in 5 x 10 6 Zellen / ml in ausreichend gepuffert Wachstumsmedium, beispielsweise Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), L- Glutamin und Natriumpyruvat. </li><li> Wenn Fluoreszenzabbildung der adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die adhärente Zellpopulation mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff oder ein Zellproliferations Farbstoff nach den Protokollen des Herstellers. </li><li> Sanft Pipette 10 ul Vollmedium in jede Vertiefung des Objektträgers kümmert, damit Sie keine Blasen in der wells, da diese einheitliche Tumorzellhaftung zu verhindern. </li><li> Hinzufügen 2,5-5,0 x 10 4 Zellen (5-10 ul Zellsuspension) zu dem Medium in jeder Vertiefung (1A). Stellen Sie die optimale Anzahl in Abhängigkeit von Tumorzelltyp und der Anzahl von Tagen Wachstum erwünscht. Größere Tumorzellen oder schnell wachsende Zellen weniger Zellen erfordern zunächst. Bringen Sie auch Volumen von bis zu 40 &amp; mgr; l durch Zugabe von Medium und Pipette auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. </li><li> Nachdem alle Vertiefungen ausgesät, damit die Tumorzellen bei RT auf dem 150 x 15 mm Petrischale haften, dann setzen Sie den Deckel vorsichtig bewegen Sie den Spiegel auf eine 37 ° C / 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für mindestens 24 Stunden. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium täglich. Einen Teil des verbrauchten Mediums aus der Monolage vorsichtig pipettieren und ersetzen mit frischem Vollmedium. Hinweis: Wegen der Verdampfung, mehr Volumen benötigen als entnommen wurde hinzugefügt. Wells ist bereit für Test, wenn eine gleichmäßige, confließend Schicht von Zellen vorhanden ist. Dieser ist in der Regel 1-3 Tage nach der ersten Aussaat. </li><li> Sanft einmal waschen Monolayer mit PBS, wie in Schritt 1.4 beschrieben und entweder zu Schritt 2, wenn Monoschichten erwünscht sind, oder mit Schritt 1.13 ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht zu extrahieren. </li><li> Einen 0,5% Triton-X (v / v) Lösung in komplettem Medium und füge 30 ul in jede Vertiefung. Lassen Mono verdauen Kapuze für 2 Minuten, dann waschen zweimal mit komplettem Medium mit einer Pipette wie oben beschrieben. HINWEIS: Die ECM-Schicht kann durch Lichtmikroskopie (Figur 2) angezeigt werden. Verwenden Sie Folien sofort, oder halten Sie in vollständigem Medium in der befeuchteten CO 2 Inkubator für 1-2 Tage. Lassen Sie die Vertiefungen zu trocknen. </li></ol> 2. Sedimentation Nicht anhaftende T-Zellen auf Slide <ol><li> Wenn Fluoreszenzabbildung des nicht-adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die nicht-adhärenten Zellpopulationen mit einem Vital fluoreszierenden Farbstoff wie CFSE, Cell Tracker Red CMPTX oder eFluor670 durch Befolgen der Protokolle des Herstellers mindestens 1 Stunde vor dem Test zur Verfügung gestellt. Alternativ zu manipulieren Zellen fluoreszierende Proteine ​​durch virale Vektoren kodiert wird. </li><li> Autoklavieren den Zellsedimentation vielfältig in einem Autoklav Beutel wie oben in 1.2 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie den befeuchteten Kammer mit Teflon beschichtete Objektträger aus dem Inkubator und in biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Waschen Vertiefungen mit 1x PBS durch Auf- und Abpipettieren, dann fügen Sie 45 ul Vollmedium mindestens 10% Serum mit. </li><li> Entfernen des Verteilers aus der Sterilisationsumschlag bilden und vorsichtig in den Vertiefungen bis &#39;Haken&#39; am Ende des Verteilers berührt den unteren Rand der Folie (1B). </li><li> Sicherstellen, dass das Kulturmedium in jedem der Kanäle sichtbar ist. Wenn keine zu sehen ist, nehmen Sie die vielfältigen und noch mehr auf das entsprechende Medium gut, dann ersetzen und erneut prüfen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.5 für jede channel des Verteilers oder für so viele Vertiefungen nach Wunsch. </li><li> Zählen nicht-adhärenten Zellen und Resuspension bei mindestens 1,0-2,0 x 10 5 / &amp; mgr; l. Auszuarbeiten 1 ul Zellen und langsam pipettiert sie in den Kanal (Abbildung 1C). Tun Sie dies für jede Vertiefung gewünscht. </li><li> Lassen Sie die gesamte Zelle geladenen Gerät, also vielfältig und Rutsche, in der Bio-Haube für 20-30 Minuten, damit sich die Zellen in den Kanal zu begleichen. </li><li> Entfernen Sie die vielfältigen, indem Sie beide Enden und leichtes Anheben sie gerade nach oben von der Folie, um die Zellen fokal in der Mitte der Brunnen (1D) ausgesät nicht stören. </li><li> Untersuchen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, daß die nicht-adhärenten Zellen wurden erfolgreich in der Mitte des Bohrlochs innerhalb des Umfangs des Verteilerkanals bleiben ausgesät. Die nichthaftenden Zellen werden in idealer leicht auf der Monoschicht oder ECM und aneinander haften daher sanft bewegt den Schieber herum wird die Zelle nicht Pelle verursachent zu zerstreuen. Drängen Sie nicht die Folie. </li></ol> 3. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bei entsprechender experimentelle Ausstattung, führen Sie die Bild nach Sedimentation wird bestätigt. Idealerweise mit einem Mikroskop, das mit einem CO 2 und Luftfeuchtigkeit Kammer ausgestattet ist. Bild mit geringer Leistung, das heißt, 4X oder 10X, um mehrere Bilder zu ermöglichen, von einer größeren Fläche aufgenommen, so dass die Gesamtheit der gut eingesehen werden kann. </li><li> Erwerben Sie digitale Bilder mit Aufnahmesoftware. Führen Hellfeld und / oder der Mehrkanal-Fluoreszenz-Imaging. </li><li> Falls gewünscht, kann ein Zeitraffer-Bilder in verschiedenen Kanälen über einen bestimmten Bereich aufzunehmen, oder halten Sie den Schiebe befeuchtet und in einem 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator und von Hand nehmen, um Bild zu den gewünschten Zeitpunkten (Bild gesetzt 1E &amp; F, für längere Zeitpunkten empfohlen). </li></ol> 4. Analyse und Anzeige <ol><li> Mit Bildbearbeitungssoftware, verschmelzen Licht und fluorescent Bilder in eine Schicht, so dass mehrere Zelltypen und Marken können in der gleichen Bildes gesehen werden. Ziehen Sie die Bilddateien für jede einzelne Farbe in das Programm und, wenn Sie gefragt werden, wählen Sie die &quot;Ebene hinzufügen&quot; Option, um eine Image-Datei mit mehreren Ebenen erstellen. <ol><li> Bei höherer Vergrößerung nehmen, ausrichten und zusammenfügen von Bildern über das auch digital. Richten Sie Dateien, indem du konservierten Regionen zwischen zwei Bildern und Überlagerung eines Bildes auf dem anderen, bis ein vollständiges Bild erzeugt. </li></ol></li><li> Fügen Mikron Bars um Bilder bei der Aufnahme mit Hilfe der Capture-Software zur Entfernung einzelner Zellen gewandert sind zu bestimmen. </li><li> Zur Bestimmung der Zellmigration zu verschiedenen Zeiten, stellen Oberfläche Intensität Fluoreszenz-Karten mit Software-Image, dh ImageJ, um fluoreszierende T-Zell-Aggregation oder über die Zeit verteilt zu quantifizieren. <ol><li> Um Oberflächendarstellung zu erzeugen, nehmen Sie ein Bild mit Ebenen in Schritt 4.1 und unter dem Fenster Ebenen erzeugt,Deaktivieren Sie alle Ebenen außer die, die entsprechend dem gewünschten Kanal. Zum Beispiel, wenn eine Oberflächendarstellung gewünscht ist, EMD Ausdrucks sichtbar zu machen, nur die &quot;grüne&quot; Schichten entsprechend dem für diesen Marker verwendete Filter sollte sichtbar sein. </li><li> Glätten Sie das Bild und speichern Sie sie in einem Dateiformat erkannt (zB PNG) und laden Sie das Bild in das Programm. Um die Oberfläche des Grundstückes zu erzeugen, ändern Sie den Bildtyp auf 8-bit, ändern Sie die Helligkeit / Kontrast wie notwendig, um den Hintergrund zu reduzieren, und wählen Sie die &quot;Analyze / Surface Plot &#39;Option. Die Bilder in Abbildung 5 wurden, indem Sie die &quot;Schatten&quot;, &quot;Draw-Achse&quot;, &quot;Ein Polygon pro Zeile&quot; und &quot;Smooth&quot; Checkboxen generiert. </li><li> Alternativ nehmen Messungen mit dem Radius oder Durchmesser von der Brennzelle Ablagerung zum Zeitpunkt Null und im Vergleich zu den Zellen im äußersten Punkt zu unterschiedlichen Zeiten. Der Durchmesser der Teflon Vertiefungen beträgt 6,0 mm. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Tumorzellen in einem Einzelzellsuspension wurden in die Vertiefungen einer Teflon-maskiert Schieber pipettiert. Man ließ die Zellen anhaften und dann in einer befeuchteten 5% CO 2, 37 ° C-Inkubator (1A) gebildete Monoschichten. Etablierte Monoschichten oder ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht abgeleitet könnte für diese Assays (1B) geerntet werden. Effektor-T-Lymphozyten mit vitalen Farbstoffen markiert oder mit Vektoren für EMD Codierungs transduziert wurden in der Mitte des ...

Der Radial Monolayer-Zellmigrationsassay wurde ursprünglich entwickelt, um die Infiltrationseigenschaften von adhärenten Tumorzellen 1-4 auf Objektträger mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine ​​5-7 oder mit einzelnen ECM-Komponenten, wie Fibronectin oder Laminin 1,2 beschichtet messen. Die Technik involviert Animpfen einer Einzelzellsuspension von Tumorzellen in der Mitte der Vertiefungen unter Verwendung eines Edelstahl Zellsedimentation Verteiler (CSM). Nach Sedimentation würden die Tumorzellen an der Unterseite der Wanne und der Änderung des Durchmessers des anfänglichen Zellpopulation im Laufe der Zeit festhalten wurde verwendet, um eine Rate der horizontalen Beweglichkeit herzustellen. Die Radial Monolayer Zellmigration Test vorgesehen eine visuelle Vorteil gegenüber anderen existierenden Methoden, die Transwell-Platten, die in-vitro-Migrationsfunktionen von Zellen zu untersuchen beschäftigt; diese Tests sind nicht förderlich für die Bildgebung 8. Wie gut, sondern auch bei der Auswahl der vorgesehenen Zeitpunkt eine große Menge an Freiheits, wenn die Migration untersucht, ohne Begrenzung auf die Anzahl der Zeitpunkte ein Forscher könnte nach der Sedimentation zu Bild auszuwählen. Weil die Migrationsfähigkeit ist eine wichtige Funktion für die nicht-anhaftenden Zellen, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie oder wo sie als Abgabevehikel für virale Vektoren verwendet werden, geeignet ist der Einsatz der CSM, die Migration von nicht-adhärenten Zellen zu bewerten Typen auf Tumorzellschichten, zusätzlich zu den ECM-Proteine. Der zusätzliche Vorteil der mikroskopisch Visualisierung der Migration von nicht-adhärenten Zellen zu lebensfähigen Tumorzellschichten, auf komplexen ECM aus dem Tumor oder an einzelnen ECM Komponenten isoliert macht dieses Assay vielseitig. Assays, die Vertiefungen, die mit einem einzigen extrazellulären Protein beschichtet beschäftigen nicht genau weiß das ECM-Gewebesubstrat oder Tumor die Zellen würden durch in vivo zu migrieren. Hier haben wir alloreaktiven zytotoxische T-Lymphozyten (alloCTL), zu den wichtigsten histocomp sensibilisiertatibility Komplex (MHC) -Proteinen mit Einweg gemischten Lymphozytentumorzellreaktionen (MLTR) oder gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) 9, wie unsere repräsentative nicht-adhärenten Zelltyp. Wir testeten Zellen der menschlichen und murinen Ursprungs. Bei der Migration wurde auf Tumormonoschichten gemessen, waren die Tumorzellen eingesetzt entweder teilweise relevanten Ziele und zeigt einige der gleichen MHC-Proteinen auf der Zellpopulation verwendet, um die Effektoren oder vollständig relevanten Ziele, mit einem kompletten Satz von MHC-Molekülen zu sensibilisieren gestellt, dass die Effektoren hatte gegen sensibilisiert. In einigen Experimenten wurden fluoreszierende Celltracker Red CMPTX oder Zellproliferation Farbstoff eFluor 670 zwischen Effektor- und Zielzellen zu unterscheiden. Wir haben auch die Transduktion mit viralen Vektoren Codierung für fluoreszierende Proteine ​​als weitere Möglichkeit, um die Zellen zu visualisieren. Für bestimmte Tests, transduziert wir die alloCTL mit retroviralen Vektoren zu replizieren (RRV) für Emerald Green (EMD) fluoreszierendes Protein kodierende 10,11; für othten, wurden Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren für mStrawberry Codierungs transduziert. Die alloCTL wurden durch einen Kanal des Verteilers in die Mitte der beiden Tumorzellschichten oder ECM aus Tumorzellmonolayer geerntet ausgesät. Adhärenten und nicht-adhärenten Zell Wechselwirkungen wurden durch Licht und / oder durch Fluoreszenzmikroskopie im Laufe der Zeit sichtbar. Störung in der Tumorzellschicht mit geringer Leistung oder Tumorzellen mit fragmentierten Kernen mit hoher Leistung waren Indikatoren der Zellschädigung durch Lyse und Apoptose auf. Wir digital erstellt Oberfläche Intensität fluoreszierender Karten, auf denen die Migration von nicht-haftenden fluoreszierenden T-Zellen in den Monolayer-Kulturen. Wir haben auch darauf hingewiesen, die Zytotoxizität erzeugt, um die adhärenten Gliom-Zellmonolayer nach Clusterbildung der überlagerten nicht haft alloCTL. Wie gut, horizontal Transduktion RRV-EMD von der alloCTL auf die Gliom Monolage beobachtet.

<table><tbody><tr><td>Teflon-maskierte Objektträger</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM002</td><td></td></tr><tr><td>Zellsedimentationsverteiler</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 150 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Mediatech</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89003-060</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes, deionisiertes Wasser (steril)</td><td>Mediatech</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Mediatech</td><td>25-054-CL</td><td></td></tr><tr><td>Celltracker Red CMPTX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (optional)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Tumorzellkulturmedien (z.B. DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V serumfreie Medien</td><td>Invitrogen</td><td>12055-083</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPOT Advanced</td><td>Diagnostic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>31/2 x 51/4 Autoklavenbeutel</td><td>Crosstex</td><td>SCXS2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Mediatech</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Zellproliferation eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

radial mobilität und zytotoxische funktion der retroviralen replikation von vektor transduziert, nichthaft alloresponsive t-lymphozyten

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Wir berichten über einen neuartigen Anpassung des Radialmonolayer-Zellmigrationsassay ersten gemeldet, um die radiale Migration von adhärenten Tumorzellen an extrazellulären Matrixproteinen zu messen, zur Messung der Beweglichkeit der fluoreszierend markierten, nicht-adhärente humane oder murine Effektor Immunzellen. Diese Technik verwendet ein nichtrostender Stahl und vielfältigen 10-Well-Teflon-Folie, um fokal einzahlen nicht haftende T-Zellen in die Vertiefungen entweder konfluent Tumorzellmonoschichten oder extrazellulären Matrixproteinen vorbereitet. Licht und / oder Mehrkanal-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird, um die Bewegung und das Verhalten der Effektorzellen über die Zeit verfolgen. Fluoreszenzfarbstoffe und / oder virale Vektoren, die Code für fluoreszierende Transgenen verwendet werden, um differentiell zu markieren, die Zelltypen für die Bildgebung. Diese Methode unterscheidet sich von ähnlichen Typs in-vitro-Tests, die horizontale oder vertikale Migration / Invasion Verwendung Schiebekammern, Agar oder Transwell-Platten zu verfolgen. Der Test ermöglicht die detaillierte Bilddaten zu be mit verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Fluoreszenzmarkern unterschieden gesammelt; sogar spezifische Subpopulationen von Zellen (dh transduziert / transduzierten) überwacht werden kann. Oberflächen Intensität Fluoreszenz Grundstücke werden mit speziellen Fluoreszenzkanälen, die zu migrierenden Zelltyp entsprechen generiert. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der nichthaftImmunZellMobilität zu bestimmten Zeiten. Es ist auch möglich, Belege für andere Effektorzelle Funktionen wie Zytotoxizität oder der Übertragung von viralen Vektoren, die von Effektorzellen zu Zielzellen zu sammeln, als auch. Somit ermöglicht das Verfahren die Forscher mikroskopisch dokumentieren Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von differentiell markierten, nicht-haftend mit adhärenten Zellen verschiedener Typen. Solche Informationen können besonders relevant bei der Beurteilung von biologisch manipuliert oder aktivierten Immunzelltypen, wo visuelle Nachweis der Funktionsfähigkeit mit Tumorzielzellen vor ihrer Verwendung zur Krebstherapie erwünscht.

Virale Vektoren kodierend für fluoreszierende Proteine ​​können zusätzlich zu oder anstelle der Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Virale Transduktion sollte vor der Motilität Assay durchgeführt werden. Sowohl adhärenten und nicht-adhärenten Zelltypen kann differentiell markiert. Das Protokoll für die Weiterleitung von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Hier transduziert wir alloCTL in den 3, 5 und 6 mit RRV-EMD mindestens zwei Tage vor dem Test unter Verwendung des Protokoll...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung der radialen Beweglichkeit von nicht-adhärenten Immunzellen in vitro mit Hilfe eines Zellsedimentationsverteilers/Objektträgers. Die Zellmigration wird auf Monolayern von Tumorzellen oder auf extrazellulären Matrixproteinen verfolgt. Die Untersuchung mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Beobachtung der Zellbeweglichkeit und der zytotoxischen Funktionalität.

Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Migration nicht-ankernder Effektor-T-Lymphozyten über eine Monoschicht anhaftender Tumorzellen zu zeigen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Monoschicht anhaftender Tumorzellen in den Vertiefungen von poly-D-Lysin-beschichteten Teflon-maskierten Objektträgern etabliert wird. In einem zweiten Schritt werden fluoreszenzmarkierte Effektor-T-Lymphozyten mithilfe einer Zellsedimentationsvorrichtung in die Mitte der Monoschicht sedimentiert. Anschließend werden Licht- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Migration der nicht-ankerten Zellen über die Monoschicht zu visualisieren.Die Ergebnisse zeigen, dass die Migration und die Effektorfunktionen von nicht-anklebenden T-Lymphozyten in einer Co-Kultur mit einer anhaftenden Tumorzell-Monoschicht erhalten bleiben, nachdem die Lymphozyten mit einem retroviralen Vektor transduziert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die radiale Migration von nicht-anklebenden effektorischen T-Lymphozyten in einer Kultur gemeinsam mit anhaftenden Tumorzellen gemessen werden kann. Dies hat weitreichende Konsequenzen für Patienten mit primären oder metastatischen Hirntumoren, da allogene zytotoxische T-Lymphozyten, die so modifiziert sind, dass sie ein Prodrug-Aktivator-Gen wie Cytosin-Desaminase exprimieren, als multimodaler Ansatz zur Beseitigung von Tumoren im Gehirn getestet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, eine zusammenhängende Tumorzell-Monoschicht zu etablieren, da das Wachstum von Tumorzellen in Bezug auf ihre Anhaftungseigenschaften heterogen ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Erzeugung einer gleichmäßigen Tumorzell-Monoschicht und einer effektiven Sedimentation der nicht-anklebenden L-O-C-T-L ein erfahrenes Verständnis der Eigenschaften beider Zelltypen erfordern. Um zu beginnen, geben Sie bis zu vier sterilisierte.10er-Set Teflon-beschichteter Objektträger in einer sterilen Petrischale mit 150 Millimeter Durchmesser und 15 Millimeter Höhe. Stellen Sie eine Petrischale mit 35 Millimeter Durchmesser und 10 Millimeter Höhe, die zwei bis drei Milliliter sterilem Wasser enthält, neben die Objektträger, um Luftfeuchtigkeit bereitzustellen. Danach präkoatieren Sie die Objektträger, indem Sie jede Vertiefung mit einer Lösung von 100 Mikrogramm pro Milliliter entweder Poly-D-Lysin oder Poly-L-Lysin bedecken.Die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, dann die Lösung abpipettieren und die Oberfläche der Vertiefungen zweimal mit PBS spülen, nachdem die Probenvertiefungen vorbereitet wurden. Einen konfluenten Kolben mit anhaftenden Tumorzellen gewinnen. Die Anzahl der vitalen Zellen mittels Lichtmikroskopie bestimmen und die Zellen anschließend in einer Konzentration von fünf mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter suspendieren.In gepuffertem Wachstumsmedium je nach Tumorzelltyp fünf bis 10 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben, das Volumen der Vertiefung mit Medium auf 40 Mikroliter auffüllen und langsam mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Nach dem Ansäen der Vertiefungen die Tumorzellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur absinken lassen. Danach den Deckel auf die Petrischale setzen und diese vorsichtig in einen feuchten Brutschrank bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid überführen und mindestens 24 Stunden inkubieren.Wechseln Sie das Kulturmedium in den Vertiefungen täglich, indem Sie vorsichtig einen Teil des Mediums von der Monoschicht entfernen und durch ein größeres Volumen an frischem, komplettem T-Zell-Medium ersetzen. Die Zellen erreichen typischerweise innerhalb von ein bis drei Tagen Konfluenz, um sie für die Sedimentation auf die Tumorzell-Monoschicht vorzubereiten. Gewinnen Sie die nicht-anklebenden T-Zellen und markieren Sie sie mindestens eine Stunde vor dem Assay gemäß Herstellerprotokoll mit einem Zellproliferationsfarbstoff.Stellen Sie als Nächstes die befeuchtete Kammer mit den Tumorzellpräparaten in den biologischen Sicherheitswerkbank. Spülen Sie die Vertiefungen mit PBS durch Pipettieren aus und geben Sie anschließend 45 Mikroliter vollständiges Medium mit 10 % Serum zu den Vertiefungen hinzu. Setzen Sie einen sterilisierten Zellsedimentationsverteiler über die Vertiefungen, bis der Haken am Ende des Verteilers den Boden des Präparats berührt.Stellen Sie sicher, dass das Medium in den Verteilerkanälen sichtbar ist. Zählen Sie anschließend die nicht-angewachsenen Zellen und suspendieren Sie sie in einer Konzentration von ein- bis zweimal 10 hoch 5 Zellen pro Mikroliter Medium.Stören Sie die Zellen vorsichtig, um Zellklumpen zu beseitigen, die die Zellsedimentation stören könnten. Pipettieren Sie langsam ein Mikroliter der Zellsuspension in den Kanal des Verteilers für jedes Gefäß. Inkubieren Sie dann das Gerät bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten, um den Zellen im Kanal Zeit zu geben, sich auf der Monolayer abzusetzen.Nachdem sich die Zellen abgesetzt haben, heben Sie den Manifold vorsichtig gerade nach oben, ohne die Objektträger zu berühren. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellpellets innerhalb des Umfangs des Manifold-Kanals befinden. Mithilfe eines Mikroskops sollten die fixierten Zellen leicht an der Monoschicht haften, sodass sich das Pellet beim vorsichtigen Verschieben des Objektträgers nicht verteilt.Nachdem bestätigt wurde, dass sich die Zellen abgesetzt haben, überführen Sie den Objektträger auf ein umgekehrtes Mikroskop, das mit einer Kohlendioxid- und Feuchtigkeitskammer ausgestattet ist. Verwenden Sie das Vierfach-Objektiv für die Hellfeld- und Mehrkanal-Fluoreszenz-Aufnahme der Zellen. Nehmen Sie Bilder eines bestimmten Bereichs im Hellfeld und in den Fluoreszenzkanälen auf und fügen Sie anschließend Mikrometerbalken mit der Bildaufnahmesoftware hinzu.Bewahren Sie die Probe in einem befeuchteten Inkubator zwischen den Zeitpunkten auf, sobald alle Zeitpunkte erfasst wurden. Ziehen Sie die Bilddateien per Drag-and-Drop in das Bildbearbeitungsprogramm und wählen Sie die Option „Ebene hinzufügen“, um eine Bilddatei mit mehreren Ebenen zu erstellen. Fügen Sie das Lichtbild und das Fluoreszenzbild in einer Ebene zusammen.Verwenden Sie die Aufnahmesoftware, um Bilder eines acht Millimeter mal acht Millimeter großen Bereichs aufzunehmen. Die Software sollte so eingestellt sein, dass die aufgenommenen Bilder automatisch mithilfe des Kanals zusammengesetzt werden, der über die gesamte Vertiefung am besten dargestellt ist. Werden nur Fluoreszenzkanäle abgebildet, sollte dies der Kanal zur Abbildung der anhaftenden Zellen sein.Alternativ können die Bilder mithilfe einer Bildbearbeitungssoftware zusammengesetzt werden. Dies erfolgt, indem Bereiche der Bilder ausgerichtet werden, die von einem Bild zum nächsten erhalten bleiben, und die Bilder übereinander gelegt werden, bis ein vollständiges Bild entsteht. Setzen Sie die Bilder mithilfe der Bildbearbeitungssoftware zusammen.Verwenden Sie die kombinierten Bilder, um mit der Image-J-Software Fluoreszenzintensitäts-Oberflächenkarten anzufertigen, um die Aggregation oder Ausbreitung fluoreszierender T-Zellen im Zeitverlauf zu visualisieren. Menschliche alloreagierende zytotoxische T-Lymphozyten, sogenannte Allo-CTL, die mit einem replikationskompetenten retroviralen Vektor übertragen wurden, der ein Gen für das Emerald-Grün-Fluoreszenzprotein kodiert, wurden in der Mitte einer Monoschicht von Gliomzellen platziert. Nach vier Stunden hatten die Allo-CTL innerhalb von 24 Stunden sichtbare Aggregate gebildet.Leere Stellen erschienen in der anhaftenden Zellmonoschicht, was auf eine Lyse der Tumorzellen hindeutet, und einige allogene CTL hatten sich über den vorderen Rand hinaus bewegt. Fluoreszenzmarkierte murine allo-CTL wurden im Zentrum einer Monoschicht fluoreszenzmarkierter Gliomzellen nach einer Stunde platziert. Nach 48 Stunden standen die allo-CTL in enger Verbindung mit den Gliomzellen, wobei sich die allo-CTL von der Mitte der Monoschichtoberfläche wegbewegt hatten. Fluoreszenzbilder wurden aus diesen Aufnahmen mit der Software ImageJ erstellt und zeigen eine erhebliche Migration von der Mitte weg nach 48 Stunden.Es ist wichtig, das Kulturmedium täglich zu wechseln, um gesunde Kulturbedingungen für die Tumorzell-Monoschicht aufrechtzuerhalten. Außerdem sollte die Sedimentation nicht-ankernder Zellen nach Beherrschung des Verfahrens etwa 20 Minuten dauern. Andere Methoden wie die Verfolgung des Zellwegs können verwendet werden, um Fragen bezüglich der Geschwindigkeit zu beantworten, mit der alloreaktive CTL über die Monoschicht migrieren, oder bezüglich der Zeitdauer, in der sie in Kontakt mit Tumorzellen stehen, während sie ihre zytotoxischen Funktionen ausüben.Dieses Protokoll hilft Forschern auf dem Gebiet der immungenetischen Therapie, die Migration genveränderter T-Lymphozyten in einer Kokultur mit Tumorzellen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man nicht-anklebende und anklebende Zellen pro Kokultur vorbereitet und wie man die Zellsedimentationsvorrichtung verwendet, um die horizontale radiale Migration nicht-anklebender Zellen über eine Tumorzell-Monoschicht zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

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Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

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Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten (Video) | JoVE Journal

Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten

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