Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Diese Demonstration zielt darauf ab, fluoreszenzmarkierte Proteine in lebenden Zellen in einer 3D-Matrix abzubilden. Erzeugen Sie zunächst stabile Zelllinien, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren. Säen Sie diese Zellen in eine 3D-Kollagenmatrix und nehmen Sie dann mit einem konfokalen Mikroskop Zeitrafferbilder von wandernden Zellen auf.

Letztendlich beleuchten die Ergebnisse die Proteinlokalisierung und -dynamik innerhalb migrierender Zellen durch Zeitraffer-Bildgebung und FP-Analyse, wobei die Proteindynamik und -lokalisierung in 3D und in Echtzeit beobachtet wird. Bietet einen Weg, um grundlegende Fragen der Zellmigration zu beantworten. Wie werden zum Beispiel Adhäsivkontakte durch zytoplasmatische Proteine reguliert?

Und auch, wie diese Kontakte durch bestimmte Inhibitoren gestört werden. In einer P 35-Schale werden die Zellen in Kulturzellen mit 80 bis 90 % Co-Flüssigkeit mit dem gewünschten Plasmid unter Verwendung von Lipo 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Legen Sie die Zellen dann in einen Inkubator.

Am nächsten Tag die Zellen in zwei P 1 50 Petrischalen aufteilen und über Nacht inkubieren. Füllen Sie das Medium auf, um 50 Mikrogramm pro Milliliter G four 18 hinzuzufügen. Setzen Sie die Kultur unter Antibiotikaauswahl zwei Wochen lang fort.

Untersuchen Sie die Kultur auf G vier 18 resistente Kolonien. Dann mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Identifizieren und markieren Sie GFP-positive Kolonien.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Lassen Sie nach dem zweiten Waschen eine dünne Schicht Flüssigkeit übrig, um zu verhindern, dass die Zellen für jede markierte Kolonie austrocknen. Wischen Sie mit einem sterilisierten Wattestäbchen so nah wie möglich am Rand herum und pipettieren Sie 10 Mikroliter Trypsin auf die Kolonie.

Wiederholen Sie dies schnell für jedes Volk. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für die Zellablösung. Überprüfen Sie das runde Aussehen unter einem Mikroskop.

Geben Sie 10 Mikroliter Trypsin auf jede Kolonie und pipettieren Sie, um die Zellen vollständig von der Platte zu lösen. Übertragen Sie dann jede Zellkolonie in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Schalenkultur, um stabile Kolonien zu amplifizieren. Als nächstes wird die Proteinexpression der Kolonien mit Hilfe von Standard-Western-Blot und Immunfluoreszenz bewertet.

Erweitern Sie ausgewählte Zelllinien Oberflächenmodifikation des Glases. Die untere Schale sorgt für eine optimale Kollagenbindung. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Siloisierungslösung auf den Glasteil jeder P 35-Schale mit einer Öffnung von 10 Millimetern.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die Lösung ab und waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten mit gefiltertem Wasser. Nehmen Sie das Wasser heraus und stellen Sie das Geschirr für 1,5 Stunden auf eine 50 Grad heiße Platte.

Positionieren Sie die Oberseite des Geschirrs leicht von der Schüssel entfernt, damit es trocknen kann. Nachdem die trockenen Schalen abgekühlt sind, pipettieren Sie 300 Mikroliter 2%ige Glutaraldehydlösung auf den Glasteil jeder Schale. Eine Stunde inkubieren, dann mit PB S3 mal für jeweils 10 Minuten waschen.

Fahren Sie mit der Sterilisation des Geschirrs fort, indem Sie es eine Stunde lang UV-Licht aussetzen. Zuerst werden 100 Mikroliter fluoreszierende Tracerpartikel durch Zentrifugation pelletiert. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren Sie die Partikel in 500 Mikrolitern Medien.

Führen Sie fünf Wäschen durch und resuspendieren Sie die Partikel dann in 30 Mikrolitern Medien. Als nächstes ernten Sie die GFP-exprimierenden Zellen mit Trypsin und bereiten Sie eine Suspension von 2 Millionen Zellen pro Milliliter in ein Einorröhrchen vor. Pipettieren Sie 240 Mikroliter Wachstumsmedium. Fügen Sie 12,6 Mikroliter eines Molarenhaufens, 20 Mikroliter gefiltertes Wasser, 50 Mikroliter Zelllösung und 10 Mikroliter der fluoreszierenden Partikel hinzu.

Zum Schluss fügen Sie 167 Mikroliter Rinderdermiskollagen hinzu, eine Lösung mischen Sie die Lösung gründlich. Füllen Sie nun 80 Mikroliter auf den Glasteil des vorbereiteten siloisierten Gerichts um. Inkubieren Sie 50 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit das Gel polymerisiert.

Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu. Äquilibrieren Sie die Mikroskopkammer auf eine stationäre Temperatur von 37 Grad Celsius und füllen Sie das Zellmedium auf. Um einen neutralen pH-Wert für die DIC-Bildgebung aufrechtzuerhalten, tauschen Sie die Oberseite der Schale gegen eine Glasplatte mit einem dünnen Streifen Paraform aus.

Decken Sie die Seite der Schale ab, um eine Verdunstung für ein Ölimmersionsziel zu verhindern. Geben Sie einen Tropfen Tauchflüssigkeit auf die Zielposition. Das Kollagengel, das die Schale enthält, liegt auf dem Mikroskoptisch, so dass die Schale mit der Tauchflüssigkeit in Kontakt kommt.

Fokussieren Sie die Probe und suchen Sie nach Zellen, die für das Bild von Interesse sind, um die Stufendrift zu minimieren. Das Gericht ca. 45 Minuten ruhen lassen. Bevor Sie eine lange Aufzeichnung starten, legen Sie die Parameter der Bildaufnahme für Inhibitoradditionsexperimente fest.

Bereiten Sie das ergänzte Medium mit dem Arzneimittel in einer gewünschten Arbeitskonzentration vor. Füllen Sie das Zellmedium auf, um einen neutralen pH-Wert zu erhalten, aber versiegeln Sie es nicht mit Perfil. Übertragen Sie die Probe in das Mikroskop und fahren Sie zum Zeitpunkt der medikamentösen Behandlung mit der Bildgebung fort.

Halten Sie das Bild an, nehmen Sie es auf und entfernen Sie vorsichtig die Geschirrabdeckung, ohne die Schüssel zu stören. Aspirieren Sie das Medium und pipettieren Sie das Medikament, das das Medium enthält, in die Schale. Setze dann die Schüssel vorsichtig wieder ein.

Die Anordnung der Top-Fraps variiert je nach System. Konsultieren Sie also die Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie zunächst Parameter für die Bildgebung lebender Zellen ein.

Für das Photobleaching. Testen Sie diese Parameter an Übungszellen, um eine ausreichende Laserleistung zu erhalten, um das Fluoreszenzsignal zu photobleichen, ohne die Zelle zu beschädigen. Beginnen Sie als Nächstes mit der Bildaufnahme an einer Stichprobe, die mindestens fünf Bilder aufgenommen hat.

Dann den interessierenden Bereich photobleichen. Fahren Sie während der Wiederherstellungszeit mit der Erfassung fort. Messen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des lichtgebleichten Bereichs vor und nach dem Photobleichen im Laufe der Zeit mit einer statistischen Analysesoftware.

Passen Sie die Erholungskurve an die Exponentialgleichung an. Rufen Sie die Parameter für die Halbzeit- und Endintensität aus der exponentiellen Anpassungskurve ab. Berechnen Sie dann die mobile Fraktion, indem Sie das Verhältnis der endgültigen zur anfänglichen Fluoreszenzintensität nehmen.

Diese 3D-Lebendzellbilder zeigen gesunde Epithelzellen, die GFP-Aktin exprimieren. Nach viertägiger Kultivierung bildeten diese Zellen eine Zyste in einer 3D-Kollagenmatrix. Einige Zellen wanderten entlang der Oberfläche der Zyste, während andere in das Innere der Zyste wanderten.

Die Verformung der Matrix als Folge der Zugkräfte, die von migrierenden Zellen ausgeübt werden, wird durch die Verschiebung von Tracerpartikeln analysiert, die in die umgebende Matrix eingebettet sind. Hier wird gezeigt, wie sich die Hemmung der RO-Kinase auf die Zugkraft auswirkt. Die Bewegungen der Tracer-Partikel werden als maximales Projektionsbild verschiedener Zeitpunkte dargestellt und jeder Zeitpunkt ist pseudofarbig.

Alternativ werden die Bilder eines einzelnen Tracerpartikels als Montage angezeigt, um die Bewegung des Tracerpartikels zu zeigen. Im Laufe der Zeit bewegte sich dieses Tracerpartikel vor bzw. nach der Zugabe von Y 2 7 6 3 2 auf die Hinterkante der migrierenden Zelle zu und von ihr weg. Die Frap-Analyse verfolgt Zellen, die GFP-Aktin exprimieren, während sie in einer dreidimensionalen Matrix wandern, was auf eine typische Fluoreszenzerholung hinweist. Nach einem Photobleichexperiment in optimierten Lasereinstellungen ist die Fluoreszenzintensität der interessierenden Region im Vergleich zum Hintergrundniveau sichtbar verringert, während gesunde und unbeschädigte Zellen erhalten bleiben.

Dieses Diagramm zeigt die Anpassung der Erholungskurve mit einer Exponentialfunktion. Einmal gemeistert, kann das Aussäen der Zellen in der Matrix eine Stunde dauern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit drei Aminosäuren Propyltrimethyl äußerst gefährlich sein kann.

Treffen Sie also Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in der chemischen Haube. Denken Sie auch daran, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, wenn Sie mit Zellen in einer 3D-Matrix arbeiten.