Name: Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D 1h NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Strukturbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Kupfer-bindenden Metallochaperon-Modellpeptiden.

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Wir danken dem Human Frontier Science Program (Young investigator grant (RGY)0068-2006) für die finanzielle Unterstützung.

1. Probenvorbereitung
<ol>
	<li>Apo-Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids in 450-500 μl deuteriertem Lösungsmittel in NMR-Qualität (die bevorzugten Lösungen für biologische Proben sind 10 % D2O in Wasser oder d6-DMSO 11-12, wenn sich die Probe nicht in Wasser auflöst oder mit Wasser reagiert).</li>
	<li>Kupfer-reagierte Probe: Lösen Sie etwa 1-2 mg des Peptids mit einer äquimolaren Menge Metallsalz in 450-500 μl des NMR-Lösungsmittels.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Lösung mit einem Sinterglas, Filterpapier oder einer anderen Technik, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und diese nicht adsorbiert. Dies ist wichtig, um metallische Partikel zu entfernen, die die Homogenität beeinträchtigen.</li>
	<li>Füllen Sie die Lösung in ein NMR-Röhrchen und verschließen Sie es. Achten Sie darauf, dass die Rohrqualität zur verwendeten Magnetstärke passt (weitere Details siehe Gerätetabelle).</li>
	<li>Wenn die Probe sauerstoffempfindlich ist, müssen diese Schritte in einer inerten Umgebung durchgeführt und das Röhrchen verschlossen werden, um eine Oxidation zu verhindern.</li>
</ol>
2. NMR-Datenerfassung und -verarbeitung13
<ol>
	<li>Aufzeichnung von 1D 1HSpektren der apo- und kupferreagierten Proben und Vergleich. Das kupferhaltige Peptidspektrum sollte eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung im Amidbereich aufweisen und die Peaks wurden aufgelöst, da das Apo-Peptid flexibel ist und einen Durchschnitt an Konformationen aufweist, aber bei der Reaktion mit Kupfer haben die gebundenen Peptidamide eine einzige Struktur (Abbildung 2).
	<ol>
		<li>Wenn das Spektrum unverändert ist, wird davon ausgegangen, dass die Reaktion fehlgeschlagen ist.</li>
		<li>Wenn sich die Probe grün färbt, ist das Kupfer in der Atmosphäre oxidiert, was seine Bindungseigenschaften verändern kann.</li>
		<li>In beiden Fällen muss die Probe neu erstellt werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Finden Sie optimale Temperaturbedingungen für die NMR-Messungen, die eine minimale Überlappung der Amidrückstände bei schmalen Linienbreiten ermöglichen.</li>
	<li>Richten Sie die NMR-Experimente COSY14, TOCSY15 und NOESY16 oder ROESY17 unter identischen Bedingungen (Temperatur, pH-Wert usw.) ein und laufen Sie nacheinander ab.
	<ol>
		<li>Die Experimente COSY (Abbildung 3) und TOCSY (Abbildung 4) werden Durchgangsbindungswechselwirkungen benachbarter bzw. benachbarter Proton-Proton-Wechselwirkungen mit größerer Reichweite nachweisen. Das COSY-Spektrum gibt Auskunft über HN-Hα-Korrelationen, während das TOCSY-Spektrum zusätzlich Informationen über HN und andere aliphatische H-Protonen korrelierter Reste liefert.</li>
		<li>NOESY- und ROESY-Experimente (Abbildung 5) weisen die räumliche Nähe ohne Abhängigkeit von Bindungen nach, um strukturelle Informationen zu erhalten. Die Wahl zwischen den beiden hängt von der effektiven Größe der Verbindung und der Feldstärke ab. Einige dieser Kombinationen liefern theoretische Nullsignale (Abbildung 6), und es muss ein ROESY-Experiment durchgeführt werden, um NOE-Wechselwirkungenzu erkennen 10,18.</li>
		<li>Wenn sich die Probe in Wasser befindet, müssen die Experimente eine Komponente der Wasserunterdrückung enthalten. Dies wird am effizientesten mit Hilfe der Farbverläufe19 erreicht. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Probe nach der Zuweisung in reinem D2O erneut laufen zu lassen, um Wechselwirkungen zu und zwischen den Hα-Wasserstoffatomen zu erhalten.</li>
		<li>Optimieren Sie die Dauer der TOCSY- und NOESY- oder ROESY-Mischzeiten, indem Sie eine Reihe kurzer Experimente durchführen, um einen maximalen Signalaufbau mit minimalem Verlust der Spindiffusion zu finden. Stellen Sie sicher, dass dies der lineare Bereich der Aufbaukurve ist. Zu den üblichen Werten für Peptide bei 600 MHz Feldern gehören Mischzeiten von etwa 100 ms für TOCSY und 150 ms für NOESY- oder ROESY-Experimente.</li>
		<li>Führen Sie zwischen den einzelnen Experimenten 1D-Experimente durch, um sicherzustellen, dass die Probenzusammensetzung während der gesamten Datenerfassung konstant bleibt (Abbildung 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Spektren mit geeigneten Apodisierungsfunktionen, um eine maximale Auflösung bei minimalem Verlust der Signalstärke zu erhalten, indem Sie die Nullfüllung in der t1-Dimension hinzufügen.
	<ol>
		<li>Korrigieren Sie die Grundlinie in der Dimension F2 und dann F1 mit einer quadratischen Polynomfunktion.</li>
		<li>Kalibrieren Sie die chemische Verschiebung der Spektren sorgfältig entsprechend der Restwasser- bzw. DMSO-Peaks in den jeweiligen Lösungsmitteln entsprechend ihrer Verschiebung zu bekannten Standards (TMSP bzw. TMS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Peakzuweisung und Integration mit SPARKY20
<ol>
	<li>Bereiten Sie einen Satz von COSY- und TOCSY-Spektren vor, die das NOESY- oder ROESY-Spektrum überlagern (Abbildung 8).</li>
	<li>Ordnen Sie alle NOE-Peaks im Spektrum gemäß der von Wüthrich entwickelten sequentiellen Zuordnungsmethodezu 21.
	<ol>
		<li>Beginnen Sie mit der Zuweisung von Peaks, die TOCSY-Signale im Fingerabdruckbereich überlappen, da dies die spätere Eingabe der Peak-Zuweisung mit dem SPARKY-Programm erleichtert (Abbildung 9). Registrieren Sie die Zuordnung der chemischen Verschiebung (Abbildung 10) und 3JHNHα-Werte (Abbildung 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Übersetzen Sie Peaks in Entfernungsbeschränkungen und 3JHNHα-Werte in Flächenwinkel.
	<ol>
		<li>Dies kann erreicht werden, indem die Peaks aus dem Programm integriert und in Entfernungsbeschränkungen übersetzt werden, indem eine Wechselwirkung aus bekannter Entfernung (z. B. der Abstand zwischen zwei Protonen der Methylengruppe oder aromatischen Wasserstoffatomen einer aromatischen Aminosäure)</li> verwendet wird.
		<li>Wenn sich die Peaks überlappen und Integrationsmethoden nicht verwendet werden können, können sie durch visuelle Schätzung als stark-mittel-schwach-sehr schwach gekennzeichnet werden, und diese Bezeichnungen können in Entfernungen von bis zu 2,5, 3,5, 4,5 bzw. 5,5 Å übersetzt werden. Dies ist am effektivsten bei der Arbeit mit Peptiden.</li>
		<li>3JHNHα-Werte sind Richtwerte für Flächenwinkel gemäß der Karplus-Gleichung, wobei die meisten gegebenen Kopplungswerte aus mehr als einem Flächenwinkel resultieren können. Diese können auf die Sekundärstruktur (Helices oder Bleche), die zufällige Spirale oder deren Konformationsdurchschnitte hinweisen. Daher ist es wichtig, die Randbedingungen vorsichtig zu verwenden oder sie als Bestätigung von Konformationsergebnissen zu verwenden.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Molekularmechanische Berechnungen zur Generierung eines Strukturensembles mit XPLOR22
<ol>
	<li>Importieren Sie die Abstandsbeschränkungen und Flächenwinkel mit dem richtigen Format für XPLOR. (Abbildung 12, nur Intersidual-Constraints). XPLOR wird den Konformationsraum durchsuchen, um Strukturen zu finden, die zusätzlich zu den experimentell gefundenen Abstandsbedingungen kanonischen geometrischen chemischen Nebenbedingungen wie Bindungslängen, Winkeln, Chiralität usw. entsprechen, um ein Ensemble zu erzeugen, in dem keiner der oben genannten Parameter verletzt wird. Dieses bildet das Ausgangsensemble.</li>
	<li>Der erste Lauf zur Strukturbestimmung erfolgt ohne Abhängigkeiten für das Metall. So kann ohne Bias gezeigt werden, welche Rückstände an der Metallbindung beteiligt sind. Fahren Sie mit Schritt 4.4 fort.</li>
	<li>Zusätzlich zu den NMR-abgeleiteten Abstandsbeschränkungen fügen Sie den ermittelten Resten Metallbindungsbeschränkungen hinzu.
	<ol>
		<li>Fügen Sie geeignete Parameter hinzu, um das Metallion und seine Topologie zu beschreiben.</li>
		<li>Die entsprechenden physikalischen Informationen (Masse, Bindungslängen mit anderen Atomen, Winkel und nicht bindende Abstoßungsparameter) müssen in die Parameterdatei eingegeben werden.</li>
		<li>Fügen Sie der Topologiedatei die Bindungsinformationen hinzu: Welche Bindungen gebildet und unterbrochen werden und welche formalen Ladungen als Ergebnis der Bindung geändert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Erstellen Sie ein kleines Ensemble von in der Regel 10 Mitgliedern.
	<ol>
		<li>Führen Sie die Einschränkungen schrittweise ein, beginnend mit Backbone-zu-Backbone-Interaktionen, dann Backbone-zu-Sidechain-Interaktionen, dann Sidechain-zu-Sidechain-Interaktionen und von intraresidualen, sequenziellen zu zunehmend weitreichenden Interaktionen. Dies erleichtert das Erkennen von Fehlern bei der Zuordnung.</li>
		<li>Die NOE-Energie wird als Rechteckpotential mit einer konstanten Kraftkonstante von 50 kcal/mol•Å2 eingeführt. Das simulierte Glühen sollte mit 1.500 3-fsec-Schritten bei 1.500 K und 3.000 1-fsec-Schritten während des Abkühlens auf 500 K durchgeführt werden. Minimieren Sie schließlich die Strukturen mit Hilfe der Energieminimierung des konjugierten Gradienten für 4.000 Iterationen. Dies sind Variablen, die innerhalb von XPLOR geändert werden können.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Erstellen Sie ein endgültiges Ensemble von in der Regel 50 Mitgliedern. Führen Sie die Schritte aus Schritt 4.4 für das gesamte Ensemble aus.
	<ol>
		<li>Geben Sie die Anzahl der einzelnen Arten von NOE-Wechselwirkungen an, die gefunden wurden, wie in Abbildung 13 dargestellt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Erstellen Sie ein Ensemble von Strukturen, die sich an die kanonische chemische Geometrie und die empirischen NMR-abgeleiteten Einschränkungen halten.
	<ol>
		<li>Geben Sie die Gesamtzahl der Konformationen, die Anzahl dieser Konformationen mit Verletzungen der NMR-abgeleiteten Einschränkungen und den RMSD des gesamten Ensembles, sowohl des Rückgrats als auch aller RMSD-Werte für schwere Atome an.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Strukturanalyse
<ol>
	<li>Das gelöste Ensemble stellt den Konformationsraum dar, den das Peptid während der NMR-Messung einnimmt. Die lokale Flexibilität kann sich in verschiedenen Regionen des Moleküls ändern, was auf strukturelle oder funktionelle Gründe zurückgeführt werden kann (der Zweck der Strukturanalyse besteht darin, die strukturelle Basis für die Stabilität und den Wirkmechanismus zu bestimmen).
	<ol>
		<li>Importieren Sie alle Konformationen der Struktur in das MolMol-Programm23, um ein Startensemble zu erstellen (Abbildung 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Untersuchen Sie das Ensemble, um die lokale Stabilität des Moleküls zu bestimmen.
	<ol>
		<li>Bestimmen Sie die RMSD-Werte für das Backbone und die Sidechain, indem Sie nachfolgende Bereiche mit vier Resten entlang der Sequenz auswählen und das Programm den RMSD auf die niedrigste Energiestruktur oder den Mittelwert berechnen lassen.</li>
		<li>Bestimmen Sie, welche Regionen des Moleküls lokale Stabilität aufweisen (Abbildung 15), indem Sie den lokalen RMSD als Funktion der Sequenz darstellen.</li>
		<li>Überlagern Sie das Ensemble entlang dieser Region des Moleküls und verwenden Sie dieses Ensemble für die weitere Analyse (Abbildung 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wählen Sie Konformationen mit niedriger Energie, die den NMR-abgeleiteten Einschränkungen entsprechen (nicht verletzt). Diese bilden das "Niedrigenergie-Ensemble".
	<ol>
		<li>Anzugeben sind die Anzahl der Konformationen im Ensemble, die Kriterien für deren Auswahl und die RMSD-Werte, wie in Schritt 4.6.1 definiert.</li>
		<li>Wenn der Metallbindungsmodus bereits bestimmt wurde, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Ansonsten: Analysieren Sie das niederenergetische Ensemble und bestimmen Sie, welche Restseitenketten in korrekter Nähe zueinander stehen, um das Metallion binden zu können. Sobald diese bestimmt wurden, gehen Sie zurück zu Schritt 3.3 und wiederholen Sie die Analyse einschließlich der Kupferbindungsdaten (Abbildung 17 für das Ensemble und Abbildung 18 für das Konformer mit niedriger Energie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Untersuchen Sie das Ensemble und bestimmen Sie die lokale Sekundärstruktur innerhalb des Moleküls mit den Standardsuchparametern des MolMol-Programms. Sekundärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen gehalten und weisen auf stabile Bereiche des Moleküls hin.
	<ol>
		<li>Bestimmen Sie die Sekundärstruktur jedes Konformers (Abbildung 19).
		<ol>
			<li>Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformeren des Ensembles, die die einzelnen Sekundärstrukturen anzeigen.</li>
			<li>Bestimmen Sie, ob die Bereiche der Sekundärstruktur die Bereiche überlappen, die durch local-RMSD als stabile Bereiche bestimmt wurden. Dies ist häufig der Fall.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bestimmen Sie Abstände und Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb des Moleküls.
	<ol>
		<li>Importieren Sie das Ensemble in Chimera24.</li>
		<li>Verwenden Sie Chimera, um intramolekulare Abstände zwischen Atomen zu bestimmen, bei denen der Verdacht auf Metallbindung besteht. Berechnen Sie die durchschnittlichen Entfernungen im Ensemble.</li>
		<li>Verwenden Sie Chimera, um intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen in jedem Konformer des Ensembles zu bestimmen (Abbildung 20), wobei die standardmäßigen gelockerten Wasserstoffbrückenbrückenparameter (um 20%) des Programms verwendet werden.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformere des Ensembles, die jede Wasserstoffbrückenbindung anzeigen. Wasserstoffbrückenbindungen, die in einem Großteil der Konformationen wiederkehren, deuten auf eine stabile Bindung hin, die zur Stabilität der Struktur beiträgt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bestimmen Sie elektrostatische Wechselwirkungen innerhalb des Moleküls.
	<ol>
		<li>Identifizieren Sie Wechselwirkungen zwischen geladenen Sidechains.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz der Konformere des Ensembles, die jede elektrostatische Wechselwirkung anzeigen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Berechnen Sie die elektrostatische Potentialverteilung mit dem Kraftfeld Amber25 innerhalb des Programms Delphi26.
	<ol>
		<li>Wählen Sie eine einzelne repräsentative Konformation aus dem Ensemble aus, an der die Berechnungen des elektrostatischen Potentials durchgeführt werden sollen.</li>
		<li>Leiten Sie das elektrostatische Potential unter Verwendung der Poisson-Boltzman-Gleichung und einer vollständigen Coulomb-Berechnung ab. Zu den erforderlichen Parametern gehören die Ionenstärke der Lösung, die dielektrischen Werte der Lösung (80 für Wasser; 40 für DMSO); das interne Peptid (normalerweise um 5,0); die Grösse des Rasters (in der Regel 65'65'65 Punkte); und der minimale Abstand zwischen dem Peptid und dem Rand des Gitters (10 Å). Die Ergebnisse sind in Bezug auf diese Werte in der Regel recht robust, da das Hauptergebnis vom Peptid selbst bestimmt wird (Abbildung 21).</li>
		<li>Untersuchen Sie das elektrostatische Potential, das auf der Van-der-Waals-Oberfläche des Peptids abgebildet ist (Abbildung 22).</li>
		<li>Untersuchen Sie die elektrostatischen Potential-Iso-Oberflächen, die Positionen mit gleichem Potential beschreiben. Finden Sie Isooberflächen, die auf biologische Relevanz hindeuten, wie z. B. ausgedehnte positive oder negative Oberflächen, die andere Proteine oder Liganden anziehen oder abstoßen könnten, oder Verteilungen, die auf Signifikanz hinweisen, wie z. B. amphipathische Verteilung oder Flecken mit unterschiedlichen Eigenschaften (Abbildung 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fassen Sie alle strukturellen Erkenntnisse zusammen, um zu sehen, wie sie sich gegenseitig verstärken.</li>
	<li>Wiederholen Sie gegebenenfalls die Schritte 4.3 bis 5.7.4.</li>
</ol>

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<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Beitrag struktureller Informationen zum Verständnis von Bindungsmechanismen ist allgemein anerkannt. Peptide sind nützlich als Modelle für Proteinbindungen und -interaktionen; Sie sind jedoch nicht für die Hauptmethode zur Strukturbestimmung, die Röntgenkristallographie, zugänglich. Die NMR ist für diese Systeme besonders nützlich, da sich die Strukturen leicht in Lösung lösen lassen. Dies gilt insbesondere für den Fall von Metallochaperon-Mimetika, die zusätzlich eine Strukturbestimmung in einer inerten Umgebung erf...

Peptide werden häufig als Proteinmodelle, potenzielle Wirkstoffe und eigenständige Therapeutika verwendet. Ihre geringe Größe und ihr hohes Maß an Flexibilität schließen jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kristallisation oft eine Strukturbestimmung durch Röntgenstrahlen aus.
Kernspinresonanz (NMR) kann verwendet werden, um Peptidstrukturen und Wechselwirkungen zu bestimmen. Die Methode kann Informationen über die lokale und Gesamtstruktur, die Bindung und die Wechselwirkungen mit niedrigerer Affinität liefern und ist auf schwierige Proben anwendbar, da sie im Lösungszustand durchgeführt werden kann.
Der Kupfertransport in biologischen Systemen wird durch intrazelluläre Kupfer-Metallochaperon-Proteine erreicht, die spezifisch Cu (I)-Ionen binden und sie durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen an ihre Zielproteine abgeben, um die Ionen vor Oxidation zu schützen und die Freisetzung von giftigem Kupfer2-5 zu verhindern. Die Bindungsstelle ist durch die konservierte Sequenz MXH/TCXanyXanyC gekennzeichnet, von der sowohl durch NMR als auch durch Kristallographie gezeigt wurde, dass sie das Cu(I) durch die weichen Thiolato-Liganden der beiden Cysteinreste bindet, obwohl auch ein zusätzlicher externer Ligand vorgeschlagen wurde6-8. Die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Proteine ist Gegenstand intensiver Forschung9.
In der hier vorgestellten Studie wurde ein Peptidmodell, das die konservierte Sequenz von Kupfer-Metallochaperonen enthält, synthetisiert und mit Cu (I) in einer inerten Umgebung umgesetzt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Schritte der Strukturbestimmung mittels NMR, einschließlich Probenvorbereitung, Datenerhebung, Datenverarbeitung, Strukturgenerierung und Strukturanalyse. Die Analyse erfolgte in zwei Schritten: Es wurden erste Strukturen erzeugt, die keine Informationen über die Art und Weise der Bindung des Peptids an das Kupferion enthielten. Nachdem der Bindungsmodus empirisch etabliert war, wurden diese Einschränkungen eingeführt, um eine hochauflösende Struktur bereitzustellen. Die Art der Bindung ist der wesentliche Punkt im Modell und wurde daher unvoreingenommen bestimmt.
Die NMR-Strukturbestimmung von Modellpeptiden ist eine äußerst wertvolle Technik, die häufig von Chemikern und Biologen verwendet wird. Es kann relativ einfach auf verschiedene Peptide unter verschiedenen Bedingungen angewendet werden und kann somit Licht auf relevante Mechanismen werfen10. Das Verständnis des Prozesses der Strukturaufklärung ermöglicht ein besseres Verständnis der Stärken und Schwächen der vorgeschlagenen Strukturen.

<table><tbody><tr><td>Avance DMX 600 MHz Spektrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR-Probenröhrchen&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhfach</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>TischgerätK</td><td></td></tr><tr><td>Peptid</td><td>BioChemia</td><td>Sonderanfertigung</td><td>>95% Reinheit</td></tr><tr><td>Kupfer (1)-chlorid</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimethylsulfoxid</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

struktur- und koordinationsbestimmung von peptid-metall-komplexen mittels 1d und 2d 1h nmr

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Die Bindung von Kupfer (I) durch Metalllochaperon-Transportproteine verhindert die Kupferoxidation und die Freisetzung von toxischen Ionen, die an schädlichen Redoxreaktionen teilnehmen können. Der Cu(I)-Komplex des Peptidmodells eines Cu(I)-bindenden Metallochaporon-Proteins, das die Sequenz MTCSGCSRPG (unterstrichen ist konserviert) enthält, wurde in Lösung unter inerten Bedingungen mittels NMR-Spektroskopie bestimmt.
NMR ist eine weithin akzeptierte Technik zur Bestimmung von Lösungsstrukturen von Proteinen und Peptiden. Aufgrund der Schwierigkeit bei der Kristallisation, Einkristalle bereitzustellen, die für die Röntgenkristallographie geeignet sind, ist die NMR-Technik äußerst wertvoll, zumal sie Informationen über den Lösungszustand und nicht über den Festkörper liefert. Darin beschreiben wir alle Schritte, die für eine vollständige dreidimensionale Strukturbestimmung mittels NMR erforderlich sind. Das Protokoll umfasst die Probenvorbereitung in einem NMR-Röhrchen, die Erfassung und Verarbeitung von 1D- und 2D-Daten, die Zuweisung und Integration von Peaks, molekularmechanische Berechnungen und die Strukturanalyse. Wichtig ist, dass die Analyse zunächst ohne voreingestellte Metall-Liganden-Bindungen durchgeführt wurde, um eine zuverlässige Strukturbestimmung auf unvoreingenommene Weise zu gewährleisten.

Im Rahmen einer laufenden Studie zu Modellen von Kupfer-bindenden Proteinen wurde die Struktur der konservierten Sequenz MT/HCXXC innerhalb des linearen Peptids MTCSGCSRPG mittels NMR in Lösung bestimmt. Das Peptid wurde unter inertem Milieu mit CuCl umgesetzt, und der pH-Wert wurde mit einem Universalindikatorstab auf etwa 3,0 gemessen. Der Amidbereich des Peptids zeigte nach der Umsetzung mit Kupfer eine Erweiterung von 6,7–8,5 auf 6,6–9,0 ppm (Abbildung 2). Eine Linienverbreiterung aufgrund leichter K...

Die NMR-Lösungsstruktur eines Metallochaperon-Modellpeptids mit Cu (I) wurde bestimmt, und ein detailliertes Protokoll von der Probenvorbereitung über die 1D- und 2D-Datenerfassung bis hin zu einer dreidimensionalen Struktur beschrieben.

Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D 1h NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Struktur eines metallhaltigen Chaperon-Protein-Mimetikums in Komplex mit Kupfer zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Probe in einer sauerstofffreien Umgebung vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kernresonanzspektroskopie- oder NMR-Spektroskopiedaten zu erfassen, die Wechselwirkungen zwischen Wasserstoffatomen zeigen. Als Nächstes werden die räumlichen Wechselwirkungen auf eine lineare Peptidvorlage abgebildet. Der letzte Schritt besteht darin, eine repräsentative Struktur mit niedriger Energie zu finden, die zu den Daten passt. Letztendlich werden mittels NMR bestimmte Strukturen verwendet, um den Bindungsmodus zu ermitteln und eine strukturelle Analyse des kupfergebundenen Komplexes durchzuführen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Techniken wie der Röntgenkristallographie besteht darin, dass sie zur Untersuchung schwach bindender Komplexe sowie von Molekülen und Komplexen verwendet werden kann, die nicht kristallisieren. Obwohl diese Methode Einblicke in kupferbindende Proteine ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie andere Metallchaperone angewendet werden, um zu untersuchen, wie Proteine die sichere Zufuhr essentieller, aber potenziell toxischer Metallionen in der Zelllinienumgebung ermöglichen.Zur Vorbereitung bereiten Sie die Proben in einer sauerstofffreien Umgebung vor, um eine Oxidation des Kupfers zu verhindern. Für die APO-Probe lösen Sie etwa ein bis zwei Milligramm des Peptids in 450 bis 500 Mikrolitern deuteriertem NMR-Reinheitsgrad-Solvens. Für die kupferreaktierte Probe lösen Sie die gleiche Menge wie beim APO-Peptid mit einer äquimolaren Menge Metallsalz in 450 bis 500 Mikrolitern des NMR-Solvens. Filtern Sie jede Lösung mithilfe eines zentralen Glasfilterpapiers oder einer anderen geeigneten Methode, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und diese nicht absorbiert. Dies ist entscheidend, um metallische Partikel zu entfernen, die die Homogenität beeinträchtigen würden.Überführen Sie die Lösungen in NMR-Röhrchen und verschließen Sie die Proben in den Röhrchen. Nehmen Sie die Proben vor Verlassen der Handschuhbox aus dieser heraus und verschließen Sie sie. Nehmen Sie die eindimensionalen Protonenspektren der APO- und der mit Kupfer umgesetzten Proben im NMR-Gerät auf und vergleichen Sie diese.Das APO-Peptid ist flexibel und zeigt eine durchschnittliche Anzahl an Konformationen, nimmt jedoch bei Reaktion mit Kupfer eine starrere Struktur an, wobei die gebundenen Peptidamide eine rigide Anordnung einnehmen. Daher sollte das Spektrum des kupferhaltigen Peptids eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung im Amidbereich zeigen, und die Signale können schärfer auflösbar werden. Richten Sie optimierte COSY-, TOCSY-, NOESY- oder ROESY-NMR-Experimente unter identischen Bedingungen wie im Textprotokoll beschrieben ein und führen Sie diese nacheinander durch.Führen Sie eindimensionale Experimente zwischen den einzelnen Experimenten durch, um sicherzustellen, dass die Probenzusammensetzung während der gesamten Datenaufnahme konstant bleibt. Nach der Datenverarbeitung gemäß dem schriftlichen Protokoll erstellen Sie eine Reihe von cosy- und to-Spektren, die überlagert auf dem noea- und rosy-Spektrum dargestellt sind. Zur Zuordnung aller NOE-Peaks im Spektrum.Beginnen Sie mit der Zuordnung von Signalen, die sich im Fingerabdruckbereich mit toxischen Signalen überlappen. Da dies die anschließenden Zuordnungsschritte in dem Programm Sparky erleichtert, notieren Sie die zugeordneten Signale, indem Sie H-alpha- zu Amide-Protein-Kopplungswerte in Diederwinkel umrechnen. Übersetzen Sie außerdem die Signale in Abstandsrестriktionen, indem Sie die Signale innerhalb des Programms integrieren und mithilfe einer Wechselwirkung mit bekanntem Abstand umrechnen.Wenn sich die Signale überlappen oder automatische Integrationsmethoden nicht verwendet werden können, können die Signale durch visuelle Schätzung als stark, mittel, schwach oder sehr schwach gekennzeichnet werden, und diese Einstufungen können entsprechend in Abstände von bis zu 2,5, 3,5, 4,5 und 5,5 Å übersetzt werden. Importieren Sie die Abstandsrestriktionen und dedal-Winkel im korrekten Format für Explore. Explore durchsucht den Konformationsraum, um Strukturen zu finden, die der kanonischen chemischen Geometrie entsprechen.Zusätzlich zu den experimentell ermittelten Abstandseinschränkungen wird ein Ensemble generiert, bei dem keine dieser Parameter verletzt werden. Dies bildet das Startensemble. Führen Sie den ersten Strukturbestimmungs-Lauf ohne Verwendung von Einschränkungen bezüglich des Metalls durch, um festzustellen, welche Reste an der Metallbindung beteiligt sind, und zwar ohne jede Voreingenommenheit.Führen Sie die Restriktionen schrittweise ein, um Fehler in der Zuordnung sowie NOE-Energie- und simulierte Kniebeuge-Parameter, wie im Textprotokoll beschrieben, leichter identifizieren zu können, bevor die Strukturen mittels konjugierter Gradienten-Energiefreisetzung über 4.000 Iterationen minimiert werden. Erstellen Sie ein endgültiges Ensemble, das üblicherweise aus 50 Mitgliedern besteht, wobei die Einführung der Restriktionen iterativ auf das gesamte Ensemble angewandt wird, und geben Sie die Anzahl der jeweiligen Typen von NOE-Wechselwirkungen an, die gefunden wurden. Erstellen Sie abschließend ein Ensemble von Strukturen, die der kanonischen chemischen Geometrie sowie den empirisch aus NMR-Daten abgeleiteten Restriktionen entsprechen. Berichten Sie die Gesamtanzahl der Konformationen, die Anzahl jener, bei denen Verstöße gegen die NMR-abgeleiteten Restriktionen auftreten, sowie den RMSD des gesamten Ensembles, einschließlich Backbone- und aller Heavy-Atom-RMSD-Werte.Analysieren Sie das Ensemble mit niedriger Energie und bestimmen Sie, welche Seitenketten der Aminosäuren in korrekter räumlicher Nähe zueinander liegen, um das Metallion binden zu können. Sobald diese identifiziert sind, wiederholen Sie die Analyse unter Einbeziehung der Kupferbindungsdaten. Zusätzlich zu den aus der NMR-Spektroskopie gewonnenen Abstandsrestriktionen werden nun Metallbindungsrestriktionen für die betroffenen Reste hinzugefügt.Fügen Sie geeignete Parameter hinzu, um das Metallion und seine Topologie zu beschreiben. Geben Sie die entsprechenden physikalischen Informationen wie Masse, Bindungslängen zu anderen Atomen, Winkel und Parameter für nichtbindende Abstoßung in die Parameterdatei ein. Fügen Sie die Bindungsinformationen der Topologiedatei hinzu.Diese Informationen umfassen, welche Bindungen gebildet und gespalten werden und welche formalen Ladungen sich infolge der Bindung verändern. Abschließend wird ein Ensemble von Strukturen erfasst, da das gelöste Ensemble den konformationellen Raum darstellt, den das Peptid einnimmt. Während der NMR-Messung importieren Sie alle Konformationen der Struktur in das Mal Mall-Programm, um ein Startensemble zu erstellen.Untersuchen Sie das Ensemble, um die lokale Stabilität des Moleküls zu bestimmen. Ermitteln Sie die Backbone- und Seitenketten-RMSD-Werte, indem Sie nacheinander vier Reste umfassende Bereiche entlang der Sequenz auswählen und das Programm den RMSD-Wert zur Struktur mit der niedrigsten Energie oder zum Mittelwert berechnen lassen. Bestimmen Sie durch Auftragen des lokalen RMSD als Funktion der Sequenz, welche Bereiche des Moleküls lokale Stabilität aufweisen, überlagern Sie das Ensemble entlang dieses Bereichs des Moleküls und verwenden Sie dieses Ensemble für weitere Analysen. Wählen Sie Konformationen mit niedriger Energie aus, die den aus NMR-Daten abgeleiteten Restriktionen entsprechen.Diese bilden den Ensemblemesswert mit niedriger Energie und geben die Anzahl der Bestätigungen im Ensemble, die Kriterien für ihre Auswahl sowie die RMSD-Werte an. Falls der Metallbindungsmodus noch nicht bestimmt wurde, analysieren Sie das Ensemble mit niedriger Energie und ermitteln Sie, welche Seitenketten der Aminosäuren nicht korrekt sind. Diese müssen einander räumlich nahe liegen, um das Metallion binden zu können.Verwenden Sie KYMERA, um intramolekulare Abstände zwischen Atomen zu bestimmen, die für die Metallbindung in Frage kommen. Berechnen Sie die durchschnittlichen Abstände im Ensemble, sobald diese bestimmt wurden. Wiederholen Sie die Analyse unter Einbeziehung der Kupferbindungsdaten.Untersuchen Sie das Ensemble und bestimmen Sie die lokale Sekundärstruktur innerhalb des Moleküls mithilfe der Standard-Suchparameter des MAL mall-Programms. Importieren Sie anschließend das Ensemble in kymera. Sekundärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert und weisen auf stabile Bereiche des Moleküls hin.Bestimmen Sie die Wasserstoffbindung unter Verwendung des Kymera-Tools. Setzen Sie die strukturelle Analyse wie im Textprotokoll beschrieben fort. Anschließend werden alle strukturellen Befunde zusammengefasst, um aufzuzeigen, wie sie sich gegenseitig unterstützen. Um Kupfer-bindende Proteinmodelle zu untersuchen, wurde die Struktur der konservierten Bindungssequenz eines Proteins innerhalb des abgeleiteten linearen Peptids mittels NMR in Lösung bestimmt, und zwar der Amidbereich des Peptids von 6,7 bis 8,5.PP M zeigte eine Ausdehnung während der Reaktion mit Kupfer von 6,6 auf 9,0 PP M. Eine Linienverbreiterung aufgrund leichter Kupferoxidation ist in der Basislinie erkennbar. Dargestellt ist hier eine Überlagerung der Fingerabdruckbereiche der Roy-Toxi- und Cozy-Spektren des kupfergebundenen Peptids. Die Probe war zeitlich stabil, und die Spektren waren gut aufgelöst und ergaben 81 NOE-Wechselwirkungen, die mittels eines Rosy-Experiments erfasst wurden.Da das Molekül nahezu keine NOE-Wechselwirkungen im NOESY-Experiment zeigte, ergab das Ensembel des Peptids, das für die umgesetzte Probe abgeleitet wurde, jedoch ohne Restriktionen bezüglich des Metalls, 47 von 50 Strukturen mit einem RMSD-Wert von 1,44 und 2,07 Å am Backbone bzw. an den schweren Atomen. Von diesen wurden 13 Konformationen mit niedriger Energie für eine weitere Analyse ausgewählt, die RMSD-Werte von 0,25 und 0,61 Å am Backbone bzw. an den schweren Atomen aufwiesen. Die lokale RMSD-Darstellung zeigte einen stabilen Bereich zwischen den Resten drei und sieben. Zusätzlich zu der starren C-terminalen Region, die einen Prolin-Rest umfasst, befindet sich dieser Bereich in allen Konformationen in einer Bogenstruktur zwischen den Resten vier und sieben.Die Biegebestätigung wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Backbone-Donatoren und -Akzeptoren Glycin fünf und Alanin zwei sowie Cystein sechs und Cystein drei stabilisiert. Diese Biegung zeigt sich ebenfalls bei Cystin drei und Serin sieben anhand der verminderten Kopplungswerte in diesem Bereich. Die Konformationen wurden in diesem Bereich überlagert und hinsichtlich möglicher Bindungsreste analysiert, wobei Cystin drei, Cystin sechs und Methionin eins als potenzielle Bindungsreste betrachtet wurden.Der kürzeste Abstand zwischen zwei Schwefelatomen war der zwischen den Folatgruppen von Cystein drei und Cystein sechs; anschließend wurde Kupferbindung eingeführt, und die Berechnung wurde erneut durchgeführt, um das für die Analyse verwendete Ensemble zu erhalten. Das Ensemble mit niedriger Energie des kupfergebundenen Peptids zeigt, dass das endständige Amin nahe dem gebundenen Kupfer liegt. Dargestellt ist hier die Isofläche der elektrostatischen Potentialverteilung, wobei positives Potential in Blau und negatives Potential in Rot dargestellt ist.Das Arginin-Rest erstreckt sich vom Peptid-Backbone und bildet einen positiven Bereich des elektrostatischen Potentials, während die Ausbeuten der Backbone-Kohlenstoffe in einer Linie angeordnet sind und ein weniger ausgeprägtes negatives elektrostatisches Potential ergeben. Sobald die Methode beherrscht ist, kann eine Strukturbestimmung innerhalb von etwa einer Woche NMR-Zeit sowie einigen weiteren Tagen Auswertung durchgeführt werden, um ein Ensemble von Konformationen zu erhalten, das für die strukturelle Analyse verwendet werden kann. Mit dieser Vorgehensweise können andere Peptid-Mutanten und unterschiedliche Bedingungen untersucht werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, die die für verschiedene Bindungs- und Freisetzungsgrade des Kupferions erforderlichen Bedingungen betreffen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D- und 2D 1H NMR

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Linienformanalyse dynamischer NMR-Spektren zur Charakterisierung von Koordinationskugelumlagerungen an einem chiralen Rheniumpolyhydridkomplex

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Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D ¹h NMR

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