Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D ¹h NMR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Struktur eines metallhaltigen Chaperon-Protein-Mimetikums in Komplex mit Kupfer zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Probe in einer sauerstofffreien Umgebung vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kernresonanzspektroskopie- oder NMR-Spektroskopiedaten zu erfassen, die Wechselwirkungen zwischen Wasserstoffatomen zeigen.

Als Nächstes werden die räumlichen Wechselwirkungen auf eine lineare Peptidvorlage abgebildet. Der letzte Schritt besteht darin, eine repräsentative Struktur mit niedriger Energie zu finden, die zu den Daten passt. Letztendlich werden mittels NMR bestimmte Strukturen verwendet, um den Bindungsmodus zu ermitteln und eine strukturelle Analyse des kupfergebundenen Komplexes durchzuführen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Techniken wie der Röntgenkristallographie besteht darin, dass sie zur Untersuchung schwach bindender Komplexe sowie von Molekülen und Komplexen verwendet werden kann, die nicht kristallisieren. Obwohl diese Methode Einblicke in kupferbindende Proteine ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie andere Metallchaperone angewendet werden, um zu untersuchen, wie Proteine die sichere Zufuhr essentieller, aber potenziell toxischer Metallionen in der Zelllinienumgebung ermöglichen.

Zur Vorbereitung bereiten Sie die Proben in einer sauerstofffreien Umgebung vor, um eine Oxidation des Kupfers zu verhindern. Für die APO-Probe lösen Sie etwa ein bis zwei Milligramm des Peptids in 450 bis 500 Mikrolitern deuteriertem NMR-Reinheitsgrad-Solvens. Für die kupferreaktierte Probe lösen Sie die gleiche Menge wie beim APO-Peptid mit einer äquimolaren Menge Metallsalz in 450 bis 500 Mikrolitern des NMR-Solvens. Filtern Sie jede Lösung mithilfe eines zentralen Glasfilterpapiers oder einer anderen geeigneten Methode, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und diese nicht absorbiert. Dies ist entscheidend, um metallische Partikel zu entfernen, die die Homogenität beeinträchtigen würden.

Überführen Sie die Lösungen in NMR-Röhrchen und verschließen Sie die Proben in den Röhrchen. Nehmen Sie die Proben vor Verlassen der Handschuhbox aus dieser heraus und verschließen Sie sie. Nehmen Sie die eindimensionalen Protonenspektren der APO- und der mit Kupfer umgesetzten Proben im NMR-Gerät auf und vergleichen Sie diese.

Das APO-Peptid ist flexibel und zeigt eine durchschnittliche Anzahl an Konformationen, nimmt jedoch bei Reaktion mit Kupfer eine starrere Struktur an, wobei die gebundenen Peptidamide eine rigide Anordnung einnehmen. Daher sollte das Spektrum des kupferhaltigen Peptids eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung im Amidbereich zeigen, und die Signale können schärfer auflösbar werden. Richten Sie optimierte COSY-, TOCSY-, NOESY- oder ROESY-NMR-Experimente unter identischen Bedingungen wie im Textprotokoll beschrieben ein und führen Sie diese nacheinander durch.

Führen Sie eindimensionale Experimente zwischen den einzelnen Experimenten durch, um sicherzustellen, dass die Probenzusammensetzung während der gesamten Datenaufnahme konstant bleibt. Nach der Datenverarbeitung gemäß dem schriftlichen Protokoll erstellen Sie eine Reihe von cosy- und to-Spektren, die überlagert auf dem noea- und rosy-Spektrum dargestellt sind. Zur Zuordnung aller NOE-Peaks im Spektrum.

Beginnen Sie mit der Zuordnung von Signalen, die sich im Fingerabdruckbereich mit toxischen Signalen überlappen. Da dies die anschließenden Zuordnungsschritte in dem Programm Sparky erleichtert, notieren Sie die zugeordneten Signale, indem Sie H-alpha- zu Amide-Protein-Kopplungswerte in Diederwinkel umrechnen. Übersetzen Sie außerdem die Signale in Abstandsrестriktionen, indem Sie die Signale innerhalb des Programms integrieren und mithilfe einer Wechselwirkung mit bekanntem Abstand umrechnen.

Wenn sich die Signale überlappen oder automatische Integrationsmethoden nicht verwendet werden können, können die Signale durch visuelle Schätzung als stark, mittel, schwach oder sehr schwach gekennzeichnet werden, und diese Einstufungen können entsprechend in Abstände von bis zu 2,5, 3,5, 4,5 und 5,5 Å übersetzt werden. Importieren Sie die Abstandsrestriktionen und dedal-Winkel im korrekten Format für Explore. Explore durchsucht den Konformationsraum, um Strukturen zu finden, die der kanonischen chemischen Geometrie entsprechen.

Zusätzlich zu den experimentell ermittelten Abstandseinschränkungen wird ein Ensemble generiert, bei dem keine dieser Parameter verletzt werden. Dies bildet das Startensemble. Führen Sie den ersten Strukturbestimmungs-Lauf ohne Verwendung von Einschränkungen bezüglich des Metalls durch, um festzustellen, welche Reste an der Metallbindung beteiligt sind, und zwar ohne jede Voreingenommenheit.

Führen Sie die Restriktionen schrittweise ein, um Fehler in der Zuordnung sowie NOE-Energie- und simulierte Kniebeuge-Parameter, wie im Textprotokoll beschrieben, leichter identifizieren zu können, bevor die Strukturen mittels konjugierter Gradienten-Energiefreisetzung über 4.000 Iterationen minimiert werden. Erstellen Sie ein endgültiges Ensemble, das üblicherweise aus 50 Mitgliedern besteht, wobei die Einführung der Restriktionen iterativ auf das gesamte Ensemble angewandt wird, und geben Sie die Anzahl der jeweiligen Typen von NOE-Wechselwirkungen an, die gefunden wurden. Erstellen Sie abschließend ein Ensemble von Strukturen, die der kanonischen chemischen Geometrie sowie den empirisch aus NMR-Daten abgeleiteten Restriktionen entsprechen. Berichten Sie die Gesamtanzahl der Konformationen, die Anzahl jener, bei denen Verstöße gegen die NMR-abgeleiteten Restriktionen auftreten, sowie den RMSD des gesamten Ensembles, einschließlich Backbone- und aller Heavy-Atom-RMSD-Werte.

Analysieren Sie das Ensemble mit niedriger Energie und bestimmen Sie, welche Seitenketten der Aminosäuren in korrekter räumlicher Nähe zueinander liegen, um das Metallion binden zu können. Sobald diese identifiziert sind, wiederholen Sie die Analyse unter Einbeziehung der Kupferbindungsdaten. Zusätzlich zu den aus der NMR-Spektroskopie gewonnenen Abstandsrestriktionen werden nun Metallbindungsrestriktionen für die betroffenen Reste hinzugefügt.

Fügen Sie geeignete Parameter hinzu, um das Metallion und seine Topologie zu beschreiben. Geben Sie die entsprechenden physikalischen Informationen wie Masse, Bindungslängen zu anderen Atomen, Winkel und Parameter für nichtbindende Abstoßung in die Parameterdatei ein. Fügen Sie die Bindungsinformationen der Topologiedatei hinzu.

Diese Informationen umfassen, welche Bindungen gebildet und gespalten werden und welche formalen Ladungen sich infolge der Bindung verändern. Abschließend wird ein Ensemble von Strukturen erfasst, da das gelöste Ensemble den konformationellen Raum darstellt, den das Peptid einnimmt. Während der NMR-Messung importieren Sie alle Konformationen der Struktur in das Mal Mall-Programm, um ein Startensemble zu erstellen.

Untersuchen Sie das Ensemble, um die lokale Stabilität des Moleküls zu bestimmen. Ermitteln Sie die Backbone- und Seitenketten-RMSD-Werte, indem Sie nacheinander vier Reste umfassende Bereiche entlang der Sequenz auswählen und das Programm den RMSD-Wert zur Struktur mit der niedrigsten Energie oder zum Mittelwert berechnen lassen. Bestimmen Sie durch Auftragen des lokalen RMSD als Funktion der Sequenz, welche Bereiche des Moleküls lokale Stabilität aufweisen, überlagern Sie das Ensemble entlang dieses Bereichs des Moleküls und verwenden Sie dieses Ensemble für weitere Analysen. Wählen Sie Konformationen mit niedriger Energie aus, die den aus NMR-Daten abgeleiteten Restriktionen entsprechen.

Diese bilden den Ensemblemesswert mit niedriger Energie und geben die Anzahl der Bestätigungen im Ensemble, die Kriterien für ihre Auswahl sowie die RMSD-Werte an. Falls der Metallbindungsmodus noch nicht bestimmt wurde, analysieren Sie das Ensemble mit niedriger Energie und ermitteln Sie, welche Seitenketten der Aminosäuren nicht korrekt sind. Diese müssen einander räumlich nahe liegen, um das Metallion binden zu können.

Verwenden Sie KYMERA, um intramolekulare Abstände zwischen Atomen zu bestimmen, die für die Metallbindung in Frage kommen. Berechnen Sie die durchschnittlichen Abstände im Ensemble, sobald diese bestimmt wurden. Wiederholen Sie die Analyse unter Einbeziehung der Kupferbindungsdaten.

Untersuchen Sie das Ensemble und bestimmen Sie die lokale Sekundärstruktur innerhalb des Moleküls mithilfe der Standard-Suchparameter des MAL mall-Programms. Importieren Sie anschließend das Ensemble in kymera. Sekundärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert und weisen auf stabile Bereiche des Moleküls hin.

Bestimmen Sie die Wasserstoffbindung unter Verwendung des Kymera-Tools. Setzen Sie die strukturelle Analyse wie im Textprotokoll beschrieben fort. Anschließend werden alle strukturellen Befunde zusammengefasst, um aufzuzeigen, wie sie sich gegenseitig unterstützen. Um Kupfer-bindende Proteinmodelle zu untersuchen, wurde die Struktur der konservierten Bindungssequenz eines Proteins innerhalb des abgeleiteten linearen Peptids mittels NMR in Lösung bestimmt, und zwar der Amidbereich des Peptids von 6,7 bis 8,5.

PP M zeigte eine Ausdehnung während der Reaktion mit Kupfer von 6,6 auf 9,0 PP M. Eine Linienverbreiterung aufgrund leichter Kupferoxidation ist in der Basislinie erkennbar. Dargestellt ist hier eine Überlagerung der Fingerabdruckbereiche der Roy-Toxi- und Cozy-Spektren des kupfergebundenen Peptids. Die Probe war zeitlich stabil, und die Spektren waren gut aufgelöst und ergaben 81 NOE-Wechselwirkungen, die mittels eines Rosy-Experiments erfasst wurden.

Da das Molekül nahezu keine NOE-Wechselwirkungen im NOESY-Experiment zeigte, ergab das Ensembel des Peptids, das für die umgesetzte Probe abgeleitet wurde, jedoch ohne Restriktionen bezüglich des Metalls, 47 von 50 Strukturen mit einem RMSD-Wert von 1,44 und 2,07 Å am Backbone bzw. an den schweren Atomen. Von diesen wurden 13 Konformationen mit niedriger Energie für eine weitere Analyse ausgewählt, die RMSD-Werte von 0,25 und 0,61 Å am Backbone bzw. an den schweren Atomen aufwiesen. Die lokale RMSD-Darstellung zeigte einen stabilen Bereich zwischen den Resten drei und sieben. Zusätzlich zu der starren C-terminalen Region, die einen Prolin-Rest umfasst, befindet sich dieser Bereich in allen Konformationen in einer Bogenstruktur zwischen den Resten vier und sieben.

Die Biegebestätigung wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Backbone-Donatoren und -Akzeptoren Glycin fünf und Alanin zwei sowie Cystein sechs und Cystein drei stabilisiert. Diese Biegung zeigt sich ebenfalls bei Cystin drei und Serin sieben anhand der verminderten Kopplungswerte in diesem Bereich. Die Konformationen wurden in diesem Bereich überlagert und hinsichtlich möglicher Bindungsreste analysiert, wobei Cystin drei, Cystin sechs und Methionin eins als potenzielle Bindungsreste betrachtet wurden.

Der kürzeste Abstand zwischen zwei Schwefelatomen war der zwischen den Folatgruppen von Cystein drei und Cystein sechs; anschließend wurde Kupferbindung eingeführt, und die Berechnung wurde erneut durchgeführt, um das für die Analyse verwendete Ensemble zu erhalten. Das Ensemble mit niedriger Energie des kupfergebundenen Peptids zeigt, dass das endständige Amin nahe dem gebundenen Kupfer liegt. Dargestellt ist hier die Isofläche der elektrostatischen Potentialverteilung, wobei positives Potential in Blau und negatives Potential in Rot dargestellt ist.

Das Arginin-Rest erstreckt sich vom Peptid-Backbone und bildet einen positiven Bereich des elektrostatischen Potentials, während die Ausbeuten der Backbone-Kohlenstoffe in einer Linie angeordnet sind und ein weniger ausgeprägtes negatives elektrostatisches Potential ergeben. Sobald die Methode beherrscht ist, kann eine Strukturbestimmung innerhalb von etwa einer Woche NMR-Zeit sowie einigen weiteren Tagen Auswertung durchgeführt werden, um ein Ensemble von Konformationen zu erhalten, das für die strukturelle Analyse verwendet werden kann. Mit dieser Vorgehensweise können andere Peptid-Mutanten und unterschiedliche Bedingungen untersucht werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, die die für verschiedene Bindungs- und Freisetzungsgrade des Kupferions erforderlichen Bedingungen betreffen.