Struktur- und Koordinationsbestimmung von Peptid-Metall-Komplexen mittels 1D und 2D ¹h NMR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Struktur eines mit Kupfer komplexierten Metallo-Chaperon-Protein-Peptids zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem die Probe zunächst in einer sauerstofffreien Umgebung vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Daten der Kernspinresonanz oder NMR-Spektroskopie zu erfassen, die Wechselwirkungen zwischen Wasserstoffatomen zeigen.

Als nächstes werden die räumlichen Wechselwirkungen auf ein lineares Peptid-Template abgebildet. Der letzte Schritt besteht darin, eine repräsentative Niedrigenergiestruktur zu finden, die zu den Daten passt. Letztendlich werden NMR-abgeleitete Strukturen verwendet, um die Art der Bindung zu bestimmen und eine Strukturanalyse des kupfergebundenen Komplexes durchzuführen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Röntgenkristallographie besteht darin, dass Sie damit wöchentliche Bindungskomplexe und auch Moleküle und Komplexe betrachten können, die nicht kristallisieren. Diese Methode kann jedoch Einblicke in kupferbindende Proteine geben. Es kann auch auf andere Systeme wie andere Metallchaps angewendet werden, um zu untersuchen, wie Proteine eine sichere Abgabe von essentiellen, aber potenziell toxischen Metallionen in der Umgebung der Zelllinien ermöglichen.

Zu Beginn der Probenvorbereitung in einer sauerstofffreien Umgebung, um zu verhindern, dass das Kupfer oxidiert, lösen Sie zur Vorbereitung der APO-Probe etwa ein bis zwei Milligramm des Peptids in 450 bis 500 Mikrolitern deuteriertem Lösungsmittel in NMR-Qualität, für die kupferumgesetzte Probe lösen Sie die gleiche Menge wie das APO-Peptid mit einer EQU-molaren Menge an Metallsalz in 450 bis 500 auf. Mikroliter des NMR-Lösungsmittels filtrieren jede Lösung mit einem Mittelglas, Filterpapier oder einer anderen Technik, die für die zu untersuchenden Verbindungen geeignet ist und sie nicht absorbiert. Dies ist wichtig, um metallische Partikel zu entfernen, die die Homogenität beeinträchtigen.

Übertragen Sie die Lösungen in NMR-Röhrchen und verschließen Sie die Proben in den Röhrchen. Bevor Sie das Handschuhfach verlassen, nehmen Sie die Proben aus dem Handschuhfach und verschließen Sie sie. Zeichnen Sie die eindimensionalen Protonenspektren der APO- und Kupfer-Reaktionsproben in der NMR-Maschine auf und vergleichen Sie sie.

Das APO-Peptid ist flexibel und zeigt durchschnittlich viele Bestätigungen, aber bei der Reaktion mit Kupfer haben die gebundenen Peptidamide eine steifere Struktur. Daher sollte das kupferhaltige Peptidspektrum eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung im Amidbereich aufweisen, und die Peaks können aufgelöst werden. Richten Sie optimierte, gemütliche tox-, neugierige oder rosige NMR-Experimente unter identischen Bedingungen ein, wie im Textprotokoll beschrieben, und laufen Sie nacheinander ab.

Führen Sie zwischen den einzelnen Experimenten eindimensionale Experimente durch, um sicherzustellen, dass die Probenzusammensetzung während der gesamten Datenerfassung konstant bleibt. Nach der Verarbeitung der Daten, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie eine Reihe von gemütlichen und zu spektren vor, die das noea- und rosige Spektrum überlagern. Zuweisen aller NOE-Peaks im Spektrum.

Beginnen Sie mit der Zuweisung von Peaks, die Toxis-Signale im Fingerabdruckbereich überlappen. Da dies spätere Eingaben in der Peak-Zuweisung mit dem Sparky-Programmdatensatz erleichtert, übersetzen die zugewiesenen Peaks die Kopplungswerte von H alpha in Amidprotein-Kopplungswinkel in Dedalwinkel. Übersetzen Sie auch Peaks in Entfernungsbeschränkungen, indem Sie die Peaks aus dem Programm integrieren und sie mithilfe einer Interaktion bekannter Entfernungen übersetzen.

Wenn sich die Peaks überlappen oder automatische Integrationsmethoden nicht verwendet werden können, können die Peaks durch visuelle Schätzung als stark, mittel, schwach oder sehr schwach gekennzeichnet werden, und diese Bezeichnungen können in Entfernungen von bis zu 2,5, 3,5, 4,5 bzw. 5,5 Ångström übersetzt werden. Beim Import werden die Entfernungsbeschränkungen und Abwärtswinkel mit dem richtigen Format für die Erkundung angezeigt. Explore durchsucht den Bestätigungsraum, um Strukturen zu finden, die der kanonischen chemischen Geometrie entsprechen.

Zusätzlich zu den experimentell gefundenen Abstandsbedingungen können Sie ein Ensemble erzeugen, in dem keiner dieser Parameter verletzt wird. Dieses bildet das Ausgangsensemble. Führen Sie den ersten Strukturbestimmungslauf ohne Einschränkungen für das Metall durch, um zu ermitteln, welche Rückstände an der Metallbindung ohne Verzerrung beteiligt sind.

Führen Sie die Nebenbedingungen schrittweise ein, um die Identifizierung von Fehlern in der Zuweisung sowie der NOE-Energie und der simulierten Knieparameter zu erleichtern, wie im Textprotokoll beschrieben, bevor Sie die Strukturen mit der Minimierung der konjugierten Gradientenenergie für 4.000 Iterationen minimieren, erstellen Sie ein endgültiges Ensemble von normalerweise 50 Mitgliedern, führen Sie die Einführung von Nebenbedingungen iterativ auf das gesamte Ensemble durch und geben Sie die Anzahl jeder Art von gefundener NOE-Wechselwirkung an. Erstellen Sie schließlich ein Ensemble von Strukturen, die der kanonischen chemischen Geometrie und dem empirischen NMR-Bericht über abgeleitete Einschränkungen entsprechen. Die Gesamtzahl der Bestätigungen, die Anzahl dieser Bestätigungen, die Verletzungen der NM-Rived-Constraints aufweisen, und der RMSD des gesamten Ensembles, einschließlich der RMSD-Werte des Rückgrats und aller schweren Atome.

Analysieren Sie das niederenergetische Ensemble und bestimmen Sie, welche Restseitenketten in korrekter Nähe zueinander stehen, um das Metallion binden zu können. Sobald diese bestimmt wurden, wiederholen Sie die Analyse, einschließlich der Kupferbindungsdaten. Zusätzlich zu den NMR-abgeleiteten Abstandsbedingungen fügen Sie nun den ermittelten Resten Metallbindungsbeschränkungen hinzu.

Fügen Sie geeignete Parameter hinzu, um das Metallion und seine Topologie zu beschreiben. Geben Sie die entsprechenden physikalischen Informationen wie Massenbindungslängen mit anderen Atomen, Winkel und nicht bindende Abstoßungsparameter in die Parameterdatei ein. Fügen Sie der Topologiedatei die Bindungsinformationen hinzu.

Zu diesen Informationen gehört, welche Anleihen gebildet und gebrochen werden und welche formellen Gebühren sich infolge der Bindung ändern. Erwerben Sie schließlich ein Ensemble von Strukturen, wie zuvor das gelöste Ensemble den Bestätigungsraum darstellt, den das Peptid einnimmt. Importieren Sie während der NMR-Messung alle Bestätigungen der Struktur in das Mal Mall-Programm, um ein Startensemble zu erstellen.

Untersuchen Sie das Ensemble, um die lokale Stabilität des Moleküls zu bestimmen. Bestimmen Sie die RMSD-Werte des Rückgrats und der Seitenkette, indem Sie die folgenden vier Restbereiche entlang der Sequenz auswählen und das Programm den RMSD auf die niedrigste Energiestruktur oder den Mittelwert berechnen lassen, bestimmen Sie, welche Bereiche des Moleküls lokale Stabilität aufweisen, indem Sie den lokalen RMSD als Funktion der Sequenz darstellen, überlagern Sie das Ensemble entlang dieser Region des Moleküls und verwenden Sie dieses Ensemble für die weitere Analyse. Wählen Sie Bestätigungen mit niedriger Energie, die den von NMR abgeleiteten Einschränkungen entsprechen.

Diese bilden den Niedrigenergie-Ensemble-Datensatz und geben die Anzahl der Bestätigungen im Ensemble, die Kriterien für deren Auswahl und die RMSD-Werte an. Wenn die Metallbindungsart noch nicht bestimmt wurde, analysieren Sie das Niedrigenergie-Ensemble und bestimmen Sie, welche Restseitenketten falsch sind. Nähe zueinander, um das Metallion binden zu können.

Verwenden Sie KYMERA, um intramolekulare Abstände zwischen Atomen zu bestimmen, bei denen der Verdacht auf Metallbindung besteht. Berechnen Sie die durchschnittlichen Entfernungen im Ensemble, sobald diese ermittelt wurden. Wiederholen Sie die Analyse einschließlich der Kupferbindungsdaten.

Untersuchen Sie das Ensemble und bestimmen Sie die lokale Sekundärstruktur innerhalb des Moleküls mit den Standardsuchparametern des MAL-Mall-Programms. Importieren Sie als Nächstes das Ensemble in kymera. Sekundärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen gehalten und weisen auf stabile Bereiche des Moleküls hin.

Bestimmen Sie die Wasserstoffbindung mit dem kymera Tool. Fahren Sie mit der Strukturanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Fassen Sie dann alle strukturellen Befunde zusammen, um zu zeigen, wie sie sich gegenseitig verstärken Um Kupferbindungsproteinmodelle zu untersuchen, wurde die Struktur der konservierten Bindungssequenz eines Proteins innerhalb des abgeleiteten linearen Peptids durch die NMR im Lösungszustand bestimmt, die Amidregion des Peptids von 6,7 bis 8,5.

PP M zeigte eine Ausdehnung nach Reaktion mit Kupfer auf 6,6 bis 9,0 pp M. Eine Verbreiterung der Linie aufgrund leichter Kupferoxidation ist in der Basislinie erkennbar. Hier ist eine Überlagerung der Fingerabdruckregionen von Roy Toxi und der gemütlichen Spektren des kupfergebundenen Peptids zu sehen. Die Probe war zeitlich stabil und die Spektren waren gut aufgelöst und ergaben 81 NOE-Wechselwirkungen, die durch ein rosiges Experiment erfasst wurden.

Da das Molekül im NO-C-Experiment nahezu keine NOE-Wechselwirkungen aufwies, ergab das Ensemble des Peptids, das für die umgesetzte Probe abgeleitet wurde, jedoch keine Einschränkungen für das Metall verwendete, 47 von 50 Nicht-Strukturen mit einem RMSD-Wert von 1,44 bzw. 2,07 Angström auf dem Rückgrat bzw. schweren Atomen. Von diesen wurden 13 niederenergetische Konformere mit RMSD-Werten von 0,25 bzw. 0,61 Angström auf dem Rückgrat bzw. schweren Atomen für die weitere Analyse ausgewählt. Das lokale RMSD-Diagramm zeigte einen Stabilitätsbereich zwischen den Resten drei und sieben. Neben dem starren C-terminalen Bereich, der einen Prolene-Rest enthält, findet sich dieser Bereich in einer Biegebestätigung zwischen den Resten vier und sieben in allen Bestätigungen.

Die Biegebestätigung wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Rückgratdonatoren und -akzeptoren Glycin fünf und drei und zwei sowie Cystein sechs und Cystein drei stabilisiert. Diese Biegung zeigt sich auch in Cystin drei und Sinus sieben durch die reduzierten Kopplungswerte in diesem Bereich. Die Bestätigungen wurden über diese Region gelegt und auf mögliche Bindungsreste analysiert, wenn Cystin drei, Cystin sechs und Methionin eins als mögliche Bindungsreste berücksichtigt wurden.

Der kürzeste Abstand zwischen Schwefel und Schwefelatom bestand darin, dass zwischen den Folatgruppen von Cystein drei und Cystein sechs eine Kupferbindung eingeführt und die Berechnung wiederholt wurde, um das für die Analyse verwendete Ensemble zu erhalten. Das niederenergetische Ensemble des kupfergebundenen Peptids zeigt, dass das endterminale Amin in der Nähe des gebundenen Kupfers liegt. Hier ist die Isofläche der elektrostatischen Potentialverteilung dargestellt, wobei das positive Potential in blau und das negative Potential rot dargestellt ist.

Der Argininrest erstreckt sich vom Rückgrat des Peptids und bildet einen positiven Lappen des elektrostatischen Potentials, während die Rückgratkohlenstoffausbeuten in einer Linie angeordnet sind, die ein weniger ausgeprägtes negatives elektrostatisches Potential bildet. Sobald die Beherrschung erfolgt, kann eine Strukturbestimmung in etwa einer Woche NMR-Zeit und einigen weiteren Tagen der Aufarbeitung durchgeführt werden, um ein Ensemble von Bestätigungen zu erhalten, die für die Strukturanalyse verwendet werden können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Peptidmutane und andere Bedingungen analysiert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die sich mit den Bedingungen befassen, die für unterschiedliche Bindungs- und Freisetzungsgrade des Kupferions erforderlich sind.