Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Techniken zur Bestimmung der Struktur und Mechanismen der Metallionenerkennung und Redox-Aktivität von Metallbindungsoligopeptiden

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie, oder IM-MS, identifizieren die verschiedenen Produkte Ionen aus der pH-abhängigen Redox- und Methylbindungsreaktion von Peptiden. Mit der molekularen Modellierung ihrer tertiären Struktur kann die Metallkorrelation bestimmt werden. IM-MS kann jede der Produktionen auflösen und ihre molekulare Zusammensetzung identifizieren, indem sie gleichzeitig ihre Massen-Zu-Ladungund-Ankunftszeiten messen und sich auf ihre Stoiichiometrie, protonationszustandund Konformationsstruktur beziehen.

Die Entwicklung von Klassen von Metallchelat-Peptiden wird dazu beitragen, Therapeutika für Krankheiten im Zusammenhang mit Metallionen-Misbalance, wie Menkes und Wilson-Krankheit, Krebs, und Alzheimer-Krankheit. Reinigen Sie zunächst die ESI-Eingangsschläuche und Nadelkapillare gründlich mit ca. 500 Mikrolitern 0,1 Molar-Gletscheressigsäure, 0,1 Molaren-Ammoniumhydroxid und schließlich entionisiertem Wasser. Verwenden Sie native ESI-IM-MS-Bedingungen, wie im Textprotokoll beschrieben, um die negativen und positiven Ionen-IM-MS-Spektren der 10 ppm Poly-DL-Alanin-Lösung für jeweils 10 Minuten zu sammeln.

Pipette 200,0 Mikroliter der 0,125 Millimolaren alternative Methanobactin, oder Amb-Lösung, in eine 1,7 Milliliter Durchstechflasche. Mit 500 Mikroliter entionisiertem Wasser verdünnen und die Lösung gründlich vermischen. Stellen Sie den pH-Wert der Probe auf 3,0 ein, indem Sie 50 Mikroliter 1,0 Molessigsäurelösung hinzufügen.

Fügen Sie der pH-angepassten Probe 200,0 Mikroliter des 0,125 Millimolaren Metallionen hinzu. Fügen Sie dann entionisiertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1,00 Milliliter der Probe zu ergeben. Mischen Sie gründlich, und lassen Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur ausdemieren.

Mit einer stumpfen Nasenspritze nehmen Sie 500 Mikroliter der Probe und sammeln die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie die restlichen 500 Mikroliter der Probe, um ihren endgültigen pH-Wert mit einer kalibrierten Mikro-pH-Elektrode aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diese Schritte, außer um den pH-Wert auf pH vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn anzupassen, indem Sie neue Mengen an Essigsäure- oder Ammoniumhydroxidlösungen hinzufügen.

Sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren der resultierenden Lösungen jeweils 10 Minuten lang. Anhand der IM-MS-Spektren können Sie ermitteln, welche geladenen Arten des alternativen Methanobactin vorhanden sind, indem Sie sie mit ihren theoretischen Massen-zu-Ladungs-Isotopenmustern abgleichen. Um dies zu tun, öffnen Sie MassLynx und klicken Sie auf Chromatogramm, um das Chromatogramm-Fenster zu öffnen.

Gehen Sie zum Menü Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen. Extrahieren Sie das IM-MS-Spektrum, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, das Chromatogramm ziehen und loslassen. Das Spektrumfenster wird geöffnet und zeigt das IM-MS-Spektrum an.

Klicken Sie im Spektrumfenster auf Werkzeuge und Isotope-Modell. Geben Sie im Fenster Isotope-Modellierung die Molekularformel der amb-Art ein, aktivieren Sie das Feld Geladenes Ionen anzeigen, und geben Sie den Ladezustand ein. Klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle Arten im IM-MS-Spektrum zu identifizieren, und zeichnen Sie deren Massen-zu-Lade-Isotopenbereich auf.

Trennen Sie für jede Amb-Art alle zufälligen Massen-zu-Ladungs-Arten und extrahieren Sie ihre Ankunftszeitverteilungen oder ATDs, indem Sie ihre Massen-zu-Lade-Isotopenmuster verwenden, um sie zu identifizieren. Öffnen Sie DriftScope und klicken Sie auf Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen. Mit der Maus und dem Linksklick zoomen Sie das Massen-zu-Lade-Isotopenmuster der amb-Arten.

Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um das Isotopenmuster auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren. Um zufällige Massen-zu-Ladungsarten zu trennen, verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um die ATD-Zeit auszuwählen, die an dem Isotopenmuster der amb-Art ausgerichtet ist.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren. Um die ATD zu exportieren, gehen Sie zu Datei, Exportieren nach MassLynx. Wählen Sie dann Drift Time beibehalten aus, und speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner.

Öffnen Sie im Chromatogramm-Fenster von MassLynx die gespeicherte exportierte Datei. Klicken Sie auf Prozess, Integrieren aus dem Menü, aktivieren Sie das Kontrollkästchen ApexTrack Peak Integration, und klicken Sie auf OK. Zeichnen Sie den Schwerpunkt und den integrierten Bereich des ATD auf. Nachdem Sie diesen Prozess für alle gespeicherten AMb- und Poly-DL-Alanin-IM-MS-Datendateien wiederholt haben, verwenden Sie die integrierte ATD für alle extrahierten Amb-Arten der positiven oder negativen Ionen an jedem Titrationspunkt, um sich auf eine relative prozentuale Skala zu normalisieren.

Geben Sie dazu die Identitäten der amb-Arten und deren integrierte ATD bei jedem pH-Wert in eine Kalkulationstabelle ein. Verwenden Sie für jeden pH-Wert die Summe der integrierten ATDs, um die atD der einzelnen Amb-Arten auf eine prozentuale Skala zu normalisieren. Plotten Sie die prozentualen Intensitäten jeder Amb-Art im Vergleich zum pH-Wert, um zu zeigen, wie die Population jeder Art je nach pH-Wert variiert.

Konvertieren Sie mithilfe einer Kalkulationstabelle die Kollisionsquerschnitte von Poly-DL-Alanin-negativen und positiven Ionen, die in Heliumpuffergas gemessen werden, in die korrigierten Kollisionsquerschnitte um. Konvertieren Sie dann die durchschnittlichen Ankunftszeiten der Poly-DL-Alanin-Kalibrame und amb-Arten in Driftzeiten. Stecken Sie die Driftzeiten der Poly-DL-Alanin-Kalibratoren im Vergleich zu ihren korrigierten Kollisionsquerschnitten.

Bestimmen Sie dann mit einer Regressionsanpassung mit den kleinsten Quadraten die A-Primierung s. und B-Werte, wobei A prime die Korrektur der Temperatur-, Druck- und elektrischen Feldparameter ist und B den nichtlinearen Effekt des IM-Geräts kompensiert. Anhand dieser A-Prim- und B-Werte mit dem Wert für die Zentroiddriftzeiten bestimmen Sie deren korrigierte Kollisionsquerschnitte und ihre Kollisionsquerschnitte. Diese Methode bietet Kollisionsquerschnitte für die Peptidarten mit geschätzten absoluten Fehlern von etwa 2%Mit Gaußian mit GaußView und der B3LYP LanL2DZ Theorieebene, lokalisieren Geometrie-optimierte Konformer für alle möglichen Arten von Koordinationen der beobachteten Masse-zu-Ladung-Amb-Arten.

Die Theorieebene B3LYP LanL2DZ besteht aus den drei Perimeter-Hybrid-Funktionen Becke, dem Dunning-Basissatz und elektronenkernigen Potentialen. Extrahieren Sie die thermochemischen Analysen der einzelnen optimierten Konformer aus der Gaußschen Ausgabedatei und berechnen Sie deren theoretische Kollisionsquerschnitte mit der ionenskalierten Lennard-Jones-Methode aus dem Sigma-Programm. Bestimmen Sie anhand der niedrigsten freien Energiekonformer, welcher Conformer den Lennard-Jones Kollisionsquerschnitt aufweist, der mit dem im-MS gemessenen Kollisionsquerschnitt übereinstimmt.

Bei diesem Prozess werden die tertiäre Struktur und die Art der Koordination für die im Experiment beobachteten Konformatoren identifiziert. Die molekulare Modellierung erfordert den Vergleich der freien Energie- und Kollisionsquerschnitte von Konformatoren mit verschiedenen Metallchelatisierungsstellen, cis- und Transpeptidbindungen, Salzbrücken, Wasserstoffbindung und Pi-Kation-Wechselwirkungen. Die IM-MS-Studie des alternativen Methanobactinzeigte, dass es sowohl Kupfer- als auch Zinkionen in pH-abhängiger Weise chelatierte, jedoch durch unterschiedliche Reaktionsmechanismen und Koordinationsstellen.

Zink(II)-Bindung wurde bei einem pH-Wert von mehr als sechs beobachtet, was in erster Linie einen einzigen negativ geladenen Komplex bildete, was darauf hindeutet, dass Zink(II) durch die beiden Imidazole und zwei Thiolate tetrahedrisch koordiniert wurde. Kupfer(II)Bindung wurde von den Thiolen begleitet, die eine Disulfidbrücke bildeten. Bei einem pH-Wert von mehr als sechs wurde der einzelne negativ geladene Kupfer(II)-Komplex gebildet, was darauf hindeutet, dass Imidazol und zwei deprotonierte Amidstickstoffe Kupfer(II) koordinierten.

IM-MS-Studien an amb two und amb four zeigen auch, dass die Kupferreaktionen Produkte lieferten, die sich in der Anzahl der inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken, der Anzahl der Kupfer(I)- oder Kupfer(II)ionen und der Anzahl der Deprotonationsstellen unterschieden, die sich in Abhängigkeit vom pH-Wert änderten. Das IM-MS-Ergebnis mit molekularer Modellierung zeigte, dass die alternativen Methanobactine bis zu drei Kupfer(I)ionen über die Thiolate-, Imidazole- und Carboxylatgruppen koordinieren konnten. Die IM-MS-Instrumentatoren müssen sorgfältig ausgewählt werden, um die im Text beschriebene Stoichiometrie, Ladungsverteilungen und Konformationsstrukturen der Peptide zu erhalten.

Die Kombination eines größeren Größenspektrums, das die Metallkoordination beeinflussen wird, wie z. B. das Tyrosin bei Assigsäure, ermöglicht ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. IM-MS mit molekularer Modellierung sind zu alternativen Techniken zur Beschleunigung der Kristallographie und NMR-Spektroskopie zur Bestimmung der Konformationsstrukturen von Proteinen, DNA, Lipiden und deren Komplexen geworden.