Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Strukturen von unlöslichen und nichtkristallinen supermolekularen Proteinanordnungen mit atomarer Auflösung durch Festkörperspektroskopie mit magischem Winkel zu untersuchen. Wir stellen die wesentlichen methodischen Schritte zur Untersuchung atomarer Strukturen biomolekularer Proteinanordnungen mittels Festkörper-NMR vor. Die Untersuchung der atomaren Strukturen dieser Anordnungen ist eine große Herausforderung, da sie von Natur aus unlöslich und nichtkristallin sind.

Die Festkörper-NMR ist eine aufstrebende Technik, die in der Lage ist, die molekulare Struktur und Dynamik mit atomarer Auflösung zu untersuchen, ohne durch die Größe des zusammengesetzten Objekts oder seine Löslichkeit begrenzt zu sein. Wir veranschaulichen hier die wichtigsten Schritte zur Visualisierung atomarer Strukturen biomolekularer Proteinanordnungen mittels verkaufter NMR, einschließlich der Vorbereitung isotopenmarkierter Proben, der Sammlung und Analyse von Strukturdaten aus der Festkörper-NMR. Der erste Schritt in einem Festkörper-NMR-Workflow ist die Herstellung von C13-N15-markierten Proteinuntereinheiten und deren In-vitro-Assemblierung.

Beimpfen Sie eine 15 mil Vorkultur aus vorgewärmtem LB-Medium mit einer Kolonie transformierter E.coli-Zellen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min und schütteln Sie über Nacht. Um die Hauptkultur zu impfen, wird die gesamte Vorkultur in einen Liter vorgewärmtes N9-Medium überführt, das die erforderlichen isotopenmarkierten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält.

Dazu gehören N15-markiertes Ammoniumchlorid, einheitlich C13-markierte Glukose, selektiv C13-markierte Glukose oder selektiv C13-markiertes Glycerin Inkubieren bei 37 Grad und Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern, sobald die Kultur trüb wird. Wenn die OD einen Wert von 0,8 erreicht hat, induzieren Sie die Proteinexpression mit einem 0,75 minimolaren IPTG für vier Stunden. Beachten Sie, dass optimale Induktionsbedingungen von einem Protein zum anderen variieren können.

Die Zellen werden durch 30-minütige Zentrifugation bei 6.000 g und vier Grad zurückgewonnen. Nach der Aufreinigung der Proteinuntereinheiten werden sie in vitro zusammengesetzt. Konzentrieren Sie das Protein auf etwa ein Minimolar in einer Zentrifugalfiltereinheit.

Dazu wird die Probe in die Filtereinheit gegeben und 30 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert. Mischen Sie die Lösung zwischen den Zentrifugationsschritten vorsichtig mit einer Pipette in der Filtereinheit, um Proteinablagerungen an der Filtermembran zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.

Die Probe wird in ein Falkenröhrchen überführt und eine Woche lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. In der Regel geht die Polymerisation der Untereinheiten zu Filamenten mit einer Trübungen der Lösung einher. Fügen Sie 0,02 % Gewicht pro Volumen Natriumazid hinzu, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.

Um die Proteinassemblierung zu ernten, zentrifugieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 20.000 g und vier Grad. Saugen Sie den größten Teil des Überstands ab und lassen Sie nur so viel Flüssigkeit übrig, dass die Oberfläche bedeckt ist, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, und lagern Sie die Probe bis zur Messung bei vier Grad. Wir stellen die wesentlichen Experimente für eine Strukturanalyse mittels Festkörper-NMR vor.

Eindimensionale Kreuzpolarisation (CP) und ungeeignete Experimente, die an C13-Kernen nachgewiesen wurden, werden verwendet, um starre bzw. flexible Proteinsegmente in der Assemblierung zu detektieren. Und um den Grad der strukturellen Homogenität und des lokalen Polymorphismus abzuschätzen. Hier verwenden wir experimentelle Standardwerte.

Typische Parameterbereiche sind im Protokoll angegeben. Setzen Sie den Rota in den NMR-Magneten ein und starten Sie die Drehung des magischen Winkels, wie im Protokoll beschrieben. Stellen Sie die gewünschte Schleuderfrequenz ein und sorgen Sie für eine Stabilisierung von plus/minus 10 Hertz.

Nehmen Sie ein einzelnes gepulstes, eindimensionales Protonenspektrum mit 16 Scans auf. Richten Sie einen 1D-Protonenkohlenstoff-CP ein. CP-Experimente zeigen die Signale, die von Resten in einer starren Konformation ausgehen. Erste Versuchsparameter werden aus einem Standard-Optimierungsverfahren an einer Referenzverbindung entnommen.

Die Parameter für die Pulskalibrierung und -entkopplung können in der Probe optimiert werden, wenn die Empfindlichkeit hoch genug ist. Hier erfassen wir einen CP mit 16 Scans. Die CP-Kontaktzeit und die Leistungsstufen werden auf der Grundlage der maximalen Signalintensität ausgewählt, wie hier zur Optimierung der CP-Kontaktzeit gezeigt

Die maximale Intensität wird in diesem Beispiel bei 800 Millisekunden erreicht. Die Entkopplungsparameter sollten ebenfalls gegenüber den ursprünglich aus der Referenzverbindungskalibrierung eingestellten Parametern neu angepasst werden. Beobachten Sie abschließend sorgfältig die Lokalisierung der rotierenden Seitenbänder bei der gegebenen Drehfrequenz des magischen Winkels, die hier bei 18 Kilohertz gezeigt wird, um eine Überlappung mit dem Signal zu vermeiden.

Nehmen Sie ein Referenz-1D-Protonenkohlenstoff-CP-Spektrum auf, das als eindimensionaler spektraler Fingerabdruck dient. Hier akkumulieren wir 128 Scans mit 800 Millisekunden CP-Kontaktzeit, 100 Kilohertz Entkopplungsstärke, einer Recyclingverzögerung von drei Sekunden und einer Erfassungszeit von 20 Millisekunden. Führen Sie das CP-Experiment ohne Apathie durch.

Wählen Sie einen isolierten Peak, um den C39-Wert innerhalb der Probe zu schätzen, was auf die strukturelle Ordnung und Homogenität hinweist. Hier beträgt die Linienbreite, gemessen als volle Breite auf halber Höhe, etwa 60 bis 70 Hertz, was auf eine gut geordnete Proteinstruktur in der Assemblierung hinweist. Richten Sie ein eindimensionales Protonenkohlenstoff-Experiment ein, um nach hochmobilen Teilen der Proteinanordnung zu suchen.

Zeichnen Sie ein ungeeignetes Referenzexperiment auf, das als Fingerabdruck für die mobilen Proteinsegmente dient. Typische Parameter sind 128 Scans und eine Erfassungszeit von 25 Millisekunden. Verarbeiten Sie das Protonenkohlenstoff-Unfähigkeitsexperiment.

Die Anzahl der Signale und ihre Positionen sind ein Hinweis auf das Ausmaß der Restmobilität bzw. die Zusammensetzung der Aminosäuren. Hier wird nur das Signal des Twist-Puffers CH2 merit-y beobachtet, da sich das gesamte Protein in einem starren Regime in der Assemblierungsstruktur befindet. Die Konformationsanalyse der Proteinstruktur basiert auf den Festkörper-NMR-Resonanzzuordnungen für alle starren Reste der Assemblierung.

Dies ist möglich, weil chemische Verschiebungen hochempfindliche Sonden für die lokale chemische Umgebung sind und zur Vorhersage der Sekundärstruktur des Proteins verwendet werden können. Eine vollständige 3D-Strukturbestimmung basiert dann auf der Sammlung von Strukturdaten, wie z. B. Abstandsbeschränkungen, die sowohl intra- als auch intermolekulare Atomabstände von bis zu neun Ångström kodieren. Hier zeigen wir, wie die grundlegenden zweidimensionalen Experimente aufgezeichnet werden und geben ein Beispiel für eine sequentielle Zuordnung.

Anschließend werden wir eine kurze Demonstration geben, wie man Abstandsbeschränkungen aus Experimenten sammelt, die an selektiv C13-markierten Proben aufgezeichnet wurden. Richten Sie das zweidimensionale Kohlenstoff-Kohlenstoff-PDSD-Experiment mit kurzer Mischzeit ein, um die Korrelation zwischen Intra-Restkohlenstoff und Kohlenstoff zu ermitteln. Kopieren Sie die Werte für den ersten Schritt der Protonenkohlenstoff-Kreuzpolarisation aus dem eindimensionalen CP-Experiment.

Die Mischung kann auf 50 Millisekunden für einheitlich C13-markierte Proben eingestellt werden. Hier haben wir eine Erfassungszeit von 15 bzw. 20 Millisekunden in der indirekten bzw. direkten Dimension gewählt. Um das PDSD-Spektrum zu verarbeiten, verwenden wir eine QSINE-Fensterfunktion mit einer Sinus-Glocken-Verschiebung von 3,5.

Um eine rückstandsspezifische Zuordnung zu ermöglichen, verwenden Sie die Einstellungen der kurzen Mischzeit PDSD, um eine Zwischenmischzeit PDSD mit einer Mischzeit von 100 bis 200 Millisekunden aufzuzeichnen. Beachten Sie, dass zusätzliche Spektren, einschließlich stickstoffdetektierter Experimente, oft für eine vollständige Resonanzzuordnung erforderlich sind und im Protokoll detailliert beschrieben sind. Wählen Sie ein NMR-Analyseprogramm aus, z. B. CCPNMR-Analyse.

Laden Sie die 2D-Spektren in die Software und erstellen Sie ein molekulares Objekt mit der primären Proteinsequenz. Beginnen Sie mit der Identifizierung der Aminosäuretypen, die im kurzen Mischzeit-PDSD-Spektrum sichtbar sind. Die Verbindung der Kohlenstoffatome der Spinsysteme ermöglicht eine resttypspezifische Zuordnung.

Hier ordnen wir das Spin-System eines Theniumrests zu. Die Polarisationstransfers zwischen den C-alpha-, C-beta- und C-gamma-Kernen führen zu physikalischen Kreuzpeaks im PDSD-Spektrum. Versuchen Sie, mit diesem Verfahren so viele Rückstände wie möglich zu identifizieren.

Überlagern Sie sowohl das PDSD-Spektrum mit kurzer als auch mit mittlerer Mischzeit. Die in der Zwischenmischzeit PDSD sichtbaren ergänzenden Peaks entstehen häufig durch den Kontakt zwischen sequentiellen Resten. Markieren Sie die Resonanzspitzen eines Spinsystems und finden Sie Korrelationen in der Zwischenmischzeit PDSD mit Resonanzfrequenzen anderer Spinsysteme.

Wir zeigen die sequentielle Zuordnung von Thenium 33 zu Isolutan 32 in unserer filamentösen Proteinanordnung. Die Resonanzfrequenzen des Thenium-Spin-Systems sind auf einer Kohlenstofffrequenz der gelösten Stoffe in 32 sichtbar und umgekehrt. Die Verfahren zur Zuordnung mit Stickstoff-detektierten Spektren und zur Gewinnung der Protein-Sekundärstruktur aus den Zuordnungen sind im Protokoll beschrieben.

Nach einer gründlichen Resonanzzuordnung können wir mit der Identifizierung von Beschränkungen mit großer Reichweite fortfahren. Long Range Restraints sind intra- oder intermolekulare Kohlenstoff-Kohlenstoff-Nähen zwischen entfernten Resten, die sowohl die Tertiärfaltung der monomeren Untereinheiten als auch die Anordnung der Untereinheiten innerhalb der Assemblierung definieren. Hierbei sind selektiv C13-markierte Proben von besonderer Bedeutung.

Überlagern Sie eine PDSD mit mittlerer Mischzeit mit einer langen Mischzeit-Kohlenstoff-PDSD, die mit einer Mischzeit zwischen 400 Millisekunden und einer Sekunde auf einer selektiv C13-markierten Probe aufgezeichnet wurde. Wenn möglich, sollten beide PDSD an derselben selektiv markierten Probe aufgezeichnet worden sein. Supplementale Peaks ergeben sich aus Korrelationen zwischen weiter entfernten C13-Atomen.

Berücksichtigen Sie bei der Resonanzzuweisung das selektive Beschriftungsschema. In diesem Fall 1-3-Glycerin. Hier haben wir ein Beispiel für einen Long-Range-Kontaktpeak mit und eine eindeutige Zuordnung in beide Dimensionen hervorgehoben.

Thenium 33 C-beta mit Protein 45 C-alpha. Nach Abschluss der Identifizierung über große Entfernungen werden die Rückhaltesysteme als eindeutig oder mehrdeutig sowie als intra- oder intermolekular klassifiziert. Die für die Strukturmodellierung zu erstellenden Abhängigkeitslisten sind im Protokoll aufgeführt.

Tutorials zur Strukturmodellierung mit verschiedenen Programmen finden Sie online. Festkörper-NMR-Daten können, entweder allein oder in Verbindung mit komplementären Daten, die Bestimmung der Struktur auf atomarer Ebene von supermolekularen Anordnungen ermöglichen. Die Vorteile der Festkörper-NMR liegen einerseits in der Möglichkeit, sowohl Sekundärstrukturinformationen als auch atomare Abstandsbeschränkungen von intramolekularen Grenzflächen bereitzustellen, die in den Modellierungsprozess integriert werden können.

Auf der anderen Seite liegt das einzigartige Merkmal der Festkörper-NMR-Spektroskopie in ihrer Fähigkeit, atomare Abstandsbeschränkungen an intermolekularen Grenzflächen intakter supermolekularer Assemblierung zu erfassen. Der Nachweis und die Unterscheidung zwischen intra- und intermolekularen Restraint-Zuweisungen kann jedoch ein langwieriger Prozess sein und erfordert in der Regel eine Aufbereitung von selektiv C13-markierten Proben. Mit neuen Entwicklungen in den Bereichen selektive Markierungsstrategien, Spektrometer-Hardware-Design und Festkörper-NMR-Methoden erfüllt die Technik jedoch zunehmend ihr theoretisches Potenzial, molekulare Informationen auf atomarer Ebene ohne Einschränkungen der Objektgröße, der weitreichenden Ordnung oder der Kristallinität bereitzustellen.

Diese Methode ermöglicht es uns, die atomare Struktur biomolekularer Anordnungen zu untersuchen. Es ist sehr wichtig, die Probe sorgfältig vorzubereiten, um den NMR-Zustand zu optimieren und hochauflösende Daten zu erhalten. Mit diesem Protokoll können wir atomare Auflösungen erhalten, die Informationen über Proteinanordnungen sind.

Und diese Technik kann mit anderen Techniken der Strukturbiologie kombiniert werden, um dreidimensionale Modelle zu erhalten.