Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in Arabidopsis Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Das übergeordnete Ziel dieser anatomischen Querschnittspräparation ist es, die relative Kristall- und Celluloseakkumulation mit zellulärer Auflösung zu quantifizieren, um direkte Vergleiche zwischen den verschiedenen Geweben in der primären Arabidopsis-Wurzel zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenphysiologie und -entwicklung zu beantworten, z. B. wie sich die zelluläre Zusammensetzung eines bestimmten Zelltyps auf das Wachstum eines ganzen Organs auswirkt. Nach der Sterilisation von Arabidopsis-Samen gemäß dem Textprotokoll verteilen Sie die sterilen Samen auf Platten mit 0,8 % Pflanzenagar und 0,5 XM Medium.

Mit Parafilm die Platten einwickeln und mit Alufolie abdecken. Lagern Sie die Platten ein bis vier Tage lang bei 4 Grad Celsius, um eine gleichmäßige Keimung zu fördern. Übertragen Sie dann die Platten in eine Wachstumskammer, die für die Züchtung von Arabidopsis-Sämlingen geeignet ist, und richten Sie die Platten vertikal aus, um das Wurzelwachstum auf dem Agarmedium aufrechtzuerhalten. Bereiten Sie die Richardson-Lösung gemäß dem Textprotokoll vor: Filtrieren Sie vor der Verwendung durch eine spritzengetriebene 0,22-Mikron-PVD-Filtereinheit.

Bereiten Sie anschließend unter einer chemischen Haube 50 Milliliter Fixiermittel vor, indem Sie 38 ml 0,5 M Natriumcacodylat mit 2,5 ml Glutaraldehyd kombinieren. Geben Sie dann 100 Mikroliter Richardson-Lösung in die Fixierlösung, um die endgültige Fixierungslösung zu erzeugen. Verwenden Sie eine vormarkierte Platte und geben Sie dann 2 bis 3 ml der endgültigen Fixierungslösung in die Vertiefungen, so dass die Lösung die Sämlinge vollständig bedeckt.

Übertragen Sie mit einer Kunststoffzange vorsichtig bis zu 10 Sämlinge in jede Vertiefung. Verwenden Sie Parafilm, um die Platten zu versiegeln, bevor Sie sie mindestens eine Nacht und bis zu einer Woche im Dunkeln bei 4 Grad Celsius lagern. Um die fixierten Sämlinge zu dehydrieren, nehmen Sie die Pflanzen mit einer Pinzette auf und bringen Sie sie in die Vertiefungen mit neu markierten Sechs-Well-Platten, die für die hier angegebenen Zeiten steigende Konzentrationen von Ethanol enthalten.

Bereiten Sie das Infiltrationsmedium in einer kleinen Glasflasche vor, indem Sie den Inhalt eines Beutels Historesin Activator mit 50 ml basischer Harzflüssigkeit mischen. Setzen Sie einen Magneten ein und rühren Sie die Lösung auf einer Rührplatte 20 Minuten lang um. Füllen Sie die beschrifteten Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 2 bis 3 ml Infiltrationsmedium.

Wenn die Sämlinge vollständig dehydriert sind, verwenden Sie eine Pinzette, um sie von der 95%igen Ethanollösung in das Infiltrationsmedium zu übertragen, um sicherzustellen, dass sie vollständig vom Medium bedeckt sind. Lagern Sie die Proben mindestens vier Tage lang bei 4 Grad Celsius, um ein maximales Eindringen in das Pflanzengewebe zu gewährleisten. Um die Blöcke vorzubereiten, legen Sie kleine Etiketten und einen Bleistift mit dem Namen der Probe in jede Vertiefung und betten Sie die Formen ein.

Bereiten Sie das Einbettmedium vor, indem Sie 1 ml Härter zu 15 ml Infiltrationsmedium hinzufügen. Füllen Sie mit etwa 200 Mikrolitern Einbettmedium die Hälfte jeder Vertiefung in die Form. Und verwenden Sie ein Stück Folie über Kopf, um die Form mit einem zusätzlichen 1 ml auf jeder Seite abzudecken.

Inkubieren Sie die Formen mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um eine partielle Polymerisation zu ermöglichen. Bereiten Sie als Nächstes eine zusätzliche Charge Einbettmedium vor und lassen Sie es gut einwirken, um eine Polymerisation zu vermeiden, während die Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden. Geben Sie das Einbettmedium in einen kleinen Teller und setzen Sie einen Sämling in ein Medium.

Schneiden Sie unter einem Präparierskop mit einem Skalpell jede Wurzelspitze ab und positionieren Sie sie dann sehr vorsichtig in der Form, etwa 2 bis 3 mm vom Formrand entfernt, entweder vertikal für Transferabschnitte oder horizontal für Längsschnitte. Verwenden Sie nach dem Anordnen des Gewebes das Einbettmedium, um die Form vollständig zu füllen, und bedecken Sie sie mit einer Überkopffolie. Dann mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren: Zum Trocknen der Blöcke legen Sie sie in einen Exsikkator mit trockenem Kieselgel und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen.

Bereiten Sie mit einem Messermacher, der mit einem Diamantritzwerkzeug ausgestattet ist, Glasmesser aus Glasstäben vor, indem Sie die Glasstraße in ein Quadrat schneiden und dann das Quadrat diagonal schneiden, um zwei Messer herzustellen. Vergewissern Sie sich, dass beide Messer scharfe Kanten haben. Montieren Sie einen Block in eine Halterung.

Entfernen Sie dann mit einer einschneidigen Industrieklinge das überschüssige Blockmaterial bis zu einem mm von der Wurzelspitze entfernt, um eine Pyramidenform zu erhalten. Schneiden Sie den geformten Block in 2 bis 3 Mikrometer breite Scheiben und übertragen Sie die Scheiben auf einen markierten Objektträger. Dann Wassertropfen auf die Scheiben geben.

Es ist wichtig, Abschnitte mit einheitlicher Breite vorzubereiten, um die Variabilität der analysierten Daten zu minimieren. Legen Sie die Objektträger auf die auf niedrige Hitze eingestellten Heizblöcke, bis das Wasser verdunstet ist. Um Objektträger für die Betrachtung unter einem polarisierten Mikroskop vorzubereiten, verdünnen Sie die Richardson-Lösung auf 2 % der ursprünglichen Lösung und verwenden Sie etwa 1 ml, um die Scheiben zu bedecken.

Legen Sie die Proben dann für 5 Sekunden auf den Heizblock und waschen Sie sie mit destilliertem Wasser. Betrachten Sie nach dem Trocknen der Objektträger auf der Heizplatte die Scheiben unter einem Präpariermikroskop und markieren Sie mit einem Marker die Rückseite eines Objektträgers, um die Position der interessierenden Scheiben anzuzeigen. Fügen Sie 100 Mikroliter Eindeckmedium hinzu, bevor Sie es mit dem Deckglas abdecken.

Abbildung und Analyse gemäß dem Textprotokoll. Hier ist ein Querschnitt durch die Arabidopsis-Primärwurzel mit radialer Organisation ihrer Zellen und Gewebe zu sehen, einschließlich Nicht-Haarzellen, Haarzellen und Kortex. Dieses konfokale Bild zeigt die BRI1-GFP-Expression in Nicht-Haarzellen in einem BRI1-mutierten Hintergrund, der die unidirektionale Expansion benachbarter Zellen und das Wachstum der gesamten Wurzel hemmt.

Wie hier zu sehen ist, zeigten Längsschnitte der Wurzeln, die aus dem Wildtyp und aus Linien gewonnen wurden, die BRI1 in Nicht-Haarzellen exprimieren, eine ähnliche Orientierung der Zellulose-Mikrofibrillen mit einer hohen Variabilität der Winkel, die in meristematischen Zellen vorhanden sind, im Vergleich zu Zellen in der Übergangszone. Dies ermöglicht einen Vergleich der relativen Akkumulation von Kristall in Cellulose in den entsprechenden meristematischen und länglichen Zellen der beiden genetischen Hintergründe, wie hier in Querschnitten gezeigt, und zeigt eine Korrelation zwischen der BRI1-Expression in Nicht-Haarzellen und einer hohen lokalen Akkumulation von Kristall in Cellulose. Im Allgemeinen werden in den Videos, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, während des Einbettungsvorgangs gut ausgerichtete Wurzeln zu erhalten.

Daher sollten mehrere Blöcke für das Trennen vorbereitet werden. Einmal gemeistert, kann ein einzelner Blockabschnitt in 2 bis 3 Stunden absolviert werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Akkumulation von Kristall in Zellulose zwischen Zellen vergleichbar ist, wenn sie eine ähnliche Ausrichtung ihrer Zellulose-Mikrofibrillen aufweisen, wie sie durch die Längsschnitte bestimmt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arabidopsis-Sämlinge fixiert und wie man sie in Blöcke einbettet und wie man dann Längs- und Querwurzelquerschnitte vorbereitet. Sie sollten auch einen guten Einblick in die Daten haben, die mit Hilfe der Polarisationslichtmikroskopie gewonnen werden können.