Name: Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in Arabidopsis Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Quantifizierung kristalliner Cellulose in Arabidopsis-Wurzeln mit polarisiertem Licht. Diese Methode ermöglicht gewebespezifische Analysen der Zellwandzusammensetzung für Pflanzenphysiologie.

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Wir danken Dr. M. Rosenberg für ihren Rat und ihre Hilfe bei der anatomischen Schnittgestaltung. Wir danken auch D. Eisler für seine technische Unterstützung. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse aus dem RP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09) und der Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Pflanzenwachstum <ol><li> Oberflächen sterilisieren Samen. <ol><li> Sterilisieren Samen (bis zu 30 mg) durch Nass- oder Trockenverfahren. Als Beispiel für die Trockensterilisationsverfahren, 1 ml glazialen HCl 37% in 50 ml Bleichmittel, in einem Becherglas in einem geschlossenen Exsikkator für mindestens 4 Stunden und bis über Nacht. Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube. </li></ol></li><li> Verbreiten Sie die sterilen Samen auf Platten mit 0,8% Plant Agar in 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) Medium. Wrap-Platten mit Parafilm oder porösen Band und mit Alufolie abdecken. </li><li> Lagern Sie die Platten bei 4 ° C für 1 - 4 days einheitliche Keimung zu fördern. </li><li> Übertragen , um die Platten in eine Wachstumskammer geeignet für den Anbau Arabidopsis Keimlingen. Legen Sie die Platten vertikal Wurzelwachstum auf dem Agar-Medium zu erhalten und das Eindringen zu verhindern. </li><li> Transfer-Setzlinge zu Fixiermittel 7 Tage nach der Keimung (DAG). </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Richardson Solution von gleichen Volumina von 1% Borax (Puffermittel), 1% Methylenblau und 1% Azure (histologische Farbstoffe) in doppelt destilliertem Wasser kombiniert. Filter durch eine Spritze Driven 0,22 um PVDF-Filtereinheit vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 50 ml Fixierlösung: 1,25% Glutaraldehyd in 0,05 M Natriumcacodylat (Puffermittel). Anmerkung: Diese Materialien sind toxisch und müssen in einer chemischen Haube verarbeitet werden. </li><li> 100 l Richardson Lösung (siehe 2.1) auf die Fixierungslösung (siehe 2.2), um die endgültige Fixierung Lösung zu erhalten. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen. </li><li> Platz 2 - 3 ml endgültige Fixierung Lösung (siehe 2.3) in die Vertiefungen, so dass die Sämlinge, einmal übertragen, wird vollständig in Flüssigkeit bedeckt sein. </li><li> Sorgfältig übertragen, Pinzette, zu jeder Vertiefung bis zu 10 Sämlinge. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm. Lagerung bei 4 ° C, in der Finsternis, für mindestens eine Nacht, und bis zu einer Woche. </li></ol> 3. Dehydration <ol> &lt;li&gt; Entwässern Sämlinge. Übertragen sie zwischen Vertiefungen neue Platten mit 6 Vertiefungen, enthaltend Konzentrationen von Ethanol zu, wie hier aufgeführt: 10% Ethanol für 15 min; 30% Ethanol für 15 min; 50% Ethanol für 15 min; 70% Ethanol für 15 min; 85% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol bei 4 ° C, über Nacht bei Minimum. Griff Sämlinge indem man sie vorsichtig in ihren Kotyledonen, bevorzugt mit Kunststoff-Pinzette greifen. </li></ol> 4. Infiltrations <ol><li> Bereiten Sie Infiltrationsmedium. Mischen Sie den Inhalt von 1 Beutel des Historesin Kit-Aktivator mit 50 ml Basisharzflüssigkeit Kit in einer kleinen Glasflasche. Rühren mit Magnet für 20 min. Infiltrationsmedium kann bei 4 ° C für ein paar Wochen aufbewahrt werden. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen und füllen mit 2 - 3 ml Infiltrationsmedium. </li><li> Übertragen Sie die Sämlinge aus der 95% igen Ethanollösung zu dem Infiltrationsmedium mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, die Sämlinge sind fully vom Medium bedeckt. </li><li> Lagerung bei 4 ° C für mindestens 4 Tage, maximales Eindringen in die Pflanzengewebe zu gewährleisten. </li></ol> 5. Satzvorbereitung <ol><li> Legen Sie kleine Etiketten, Bleistift-markiert mit Beispielnamen, innerhalb jeder Vertiefung Einbettschälchen. </li><li> Bereiten Sie Einbettmedium durch Zugabe von 1 ml Härter 15 ml Infiltrationsmedium (siehe 4.1). Versuchen Sie nicht, ein Volumen von weniger als 15 ml herzustellen, Polymerisation Probleme zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie die Hälfte jeder Vertiefung in der Form mit 200 ul Einbettungsmedium und Abdeckung mit einem Overhead-Folienstück auf die Form Form geschnitten, sondern zu einer Größe von 1 mm größer auf jeder Seite. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 2 h für die Polymerisation zu ermöglichen. Nicht 5 Stunden nicht überschreiten. </li><li> Bereiten Sie eine zusätzliche Charge von Einbettmedium (siehe 5.2) und auf Eis halten, Polymerisation zu vermeiden, während der Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden. </li><li> Schneiden Sie jede Wurzelspitze unter einem Binokular Skalpell und sehr sorgfältig positionieren it: senkrecht zur Querschnitte oder horizontal für Längsschnitt, bei etwa 2 - 3 mm von der Formperipherie. Füllen Sie die Form vollständig mit Blocking-Lösung und die Abdeckung mit einem Overhead-Folie. Beachten Sie, dass die Blockierungslösung leicht schrumpfen wird, wenn es polymerisiert wird. </li><li> Halten Sie bei Raumtemperatur für 2 Stunden, bei Minimum. </li><li> Um die Blöcke trocknen, legen Sie in einem Kasten mit trockenem Kieselgel und lassen bei Raumtemperatur bei mindestens über Nacht. </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Bereiten Glasmesser aus Glasstäben mit einem Messer ausgestattet. Verwenden Sie die Glasmesser für Gewebe Schnitte. Schneiden Sie den Glasstab in ein Quadrat und dann schneiden Sie das Quadrat diagonal zwei Messer zu produzieren, ein Diamant-Scoring-Tool. </li><li> Die Sperrung der Abschnitte in 2 - 3 &amp; mgr; m Breite Scheiben, mit schneidender Maschine. Die Scheiben auf einem Glasträger, auf destilliertes Wassertröpfchen und den Objektträger auf einem Wärmeblock zu geringe Wärme gesetzt (50 - 60 ° C), bis das Wasser verdunstet. </li></ol><ol><li> Verdünnte Richardson-Lösung (siehe 2.1) auf 0,2% der ursprünglichen Lösung und mit 1 ml davon die Scheiben zu bedecken. Legen Sie auf dem Wärmeblock für 5 Sekunden und dann mit destilliertem Wasser waschen. </li><li> Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte. Beachten Sie unter einem Binokular und die Rückseite der Folie mit einer Markierung zu markieren, um die Position der Scheiben von Interesse zeigen, ihre spätere Identifizierung unter dem Mikroskop zu erleichtern. </li><li> 100 l Eindeckmediums und Abdeckung mit einem Deckglas. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol><li> Legen Sie die bedeckte Schlitten die Wurzelabschnitte unter einem Lichtmikroskop ausgestattet mit PolScope System , das geeignet ist, um Retardierung Informationen und einen Polarisator / Interferenzoptikfilter (Abbildung 1 AD) erhalten. </li><li> Wählen Sie Vergrößerung , die klare Visualisierung der gesamten Probe erlaubt (zB 40X in dieser Studie) und konzentrieren sich die microscope auf einem leeren Feld, das Blockabschnitt aber keine Wurzel Abschnitt enthält. Versuchen Sie, eine saubere Region ohne Makel zu finden. Verwenden Sie diese Region den Hintergrund zu setzen. </li><li> Stellen Sie die Abbildungssystem und Software-Parameter: Stellen Sie Bereich bis 17 nm. Übernehmen &quot;Auto Exposure&quot; und Hintergrundbild aus dem leeren Feld erhalten (siehe 8.2). Einem Hintergrundbild wird pro Experiment verwendet. </li></ol> 9. PolScope Analyse von Cellulose Mikrofibrillen Orientierung <ol><li> Analyse von Längsschnitten. <ol><li> Legen Sie eine Folie mit Längsschnitten unter dem Mikroskop und erhalten eine Retardierung Bild davon. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem Wurzelabschnitt von Interesse. Geben Sie einen neuen Dateinamen. </li><li> Aufnehmen eines Abrio Bild (Bild mit Verzögerung Informationen) durch die &quot;Live Abrio&quot; Fenster. Sicher sein , einen Abschnitt zu erfassen , die die Zellwand enthält, die von der gefärbten Cellulose identifiziert werden können , die entlang des Umfangs der Zelle ausgeführt wird , wie in 2C gezeigt.</li></ol></li><li> Die Bildanalyse. <ol><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Ausrichtung Pseudo Farbe&quot; im &quot;Display Settings&quot;. </li><li> Um die Zellulose microfibril Winkel abschätzen zu können, passen Sie die entsprechenden Schatten der Zellwand, das dem in dem Farbrad. HINWEIS: Das Farbrad in Figur 2C zeigt die langsame Achse des Lichts entlang der Mikrofibrillen liegen , die der Richtung entlang der langen Achse der Mikrofibrillen zeigt. Der Winkel der Cellulose-Mikrofibrillen ist der Winkel zwischen der Farbe und der langen Achse der Zelle angezeigt. Zum Beispiel zeigt die elongating Zelle in der eingesetzten Farbe Zyan, um etwa 90 ° zur langen Achse der Zellen verkippt. </li><li> Um die durchschnittliche microfibril Winkel in der Zellwand zu quantifizieren, verwenden Sie &quot;Hemmung und Azimuth Stamp&quot; aus der Werkzeugleiste der Software. Während das Werkzeug, Punkt auswählen und in dem erhaltenen Bild auf dem Gebiet von Interesse klicken. HINWEIS: Diese will Ergebnis in der Anzeige der Winkel (Azimut) in Grad (Figur 2C). </li><li> In einer alternativen Open-Access-polarisierten Lichtbildanalyse-Software, Mittagessen &quot;Pol-Analyzer&quot; Plugin aus dem Plugin-Menü. Im neu geöffneten Fenster wählen Sie die &quot;Doppelbrechungs&quot; und öffnen Sie dann die Hintergrunddatei und die Bilddatei speichern. </li><li> Im Bildfenster, wählen Sie &quot;Specs.&quot; und stellen Sie die &quot;ROI Pixelgröße&quot; (Einsatz 5 Pixel für diese Studie). Im &quot;Specs.&quot; Wählen Sie im Fenster &quot;zeigen Werte in Ergebnistabelle&quot;. </li><li> Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um die Region von Interesse im Bildfenster zu markieren. Wählen Sie &quot;Orientierungslinien&quot;, um die Ausrichtung der Cellulose Mikrofibrillen erhalten. ANMERKUNG: Diese in der Anzeige der Winkel führen (Azimut) in Grad. HINWEIS: Der Durchschnittswinkel berechnet, indem einer der beiden Methoden, dann entlang der Rutsche zur Positionierung des Fußabschnitts normalisiert werden sollte. Zur Korrektur für die Abweichung vondie horizontale Positionierung des gesamten Wurzelabschnitt entlang der Rutsche, quantifizieren die durchschnittliche microfibril Winkel der Zellwand der Zelle entlang ihrer langen Achse flankieren (dh, senkrecht zu dem Abschnitt und entlang der Achse des Wurzelwachstums, 2C). Dieser Winkel 180 ° beträgt, wenn der Wurzelabschnitt genau entlang der Rutsche positioniert ist. Für den microfibril Winkel zu berechnen, subtrahieren den Mittelwert gemessen microfibril Winkel der flankierenden Zellwand von 180 °. Fügen Sie den ergab Unterschied zu den durchschnittlichen gemessenen microfibril Winkel der Zellwand, die auf der Folie flach liegt. </li></ol></li></ol> 10. PolScope Analyse der kristallinen Cellulose Accumulation <ol><li> Verwenden Sie die Quer (Kreuz) Abschnitte. Man beachte, dass kristalline Cellulose Akkumulation kann nur zwischen den Zellen verglichen werden, wenn die Cellulose-Mikrofibrillen in einem ähnlichen Winkel ausgerichtet sind (wie in 9 bestimmt). </li><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Pseudonym Farbe &quot;im&quot; Display Settings &quot;. </li><li> Zur Messung der Retardierung. Zoom-in auf das Bild. Wählen Sie &quot;Region&quot; und alle Regionen von Interesse zu markieren. Umzug in die &quot;Messungen&quot; klicken und alle Werte &quot;In Zwischenablage kopieren&quot;. <ol><li> Übertragen Sie die Daten in Excel und extrahieren erforderlichen Informationen (mittlere Region Retardierung). Normalisieren der Daten. HINWEIS: Um Unterschiede in der Dicke zwischen den Schichten ausmachen, drücken die Werte relativ zu einer bestimmten Zellwandkante in der Folie. Zu normalisieren, teilen die durchschnittliche Verzögerung an die Zellwand von Interesse durch die durchschnittliche Verzögerung von einer anderen Zellenwand in der gleichen Bild entspricht. So wurde beispielsweise die äußere epidermale Zellwand zu der inneren kortikalen Zellwand in unserer Studie normalisiert. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Messungen für mindestens 3 Abschnitte pro Wurzel, mit einem Minimum von 3 Wurzeln pro Probe. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von kristalliner Cellulose in den verschiedenen Geweben , die Arabidopsis Wurzeln Komponieren, während anatomische Information erhalten bleibt. Als solches bietet es einen zusätzlichen Schritt in Richtung Wachstum zu verstehen Prozesse in Pflanzen auf zellulärer Auflösung. Dieses Verfahren kann auch für die Untersuchung der zusätzlichen Pflanzenarten und Organe angewendet werden. Eine Reihe von Punkten berücksichtigt wer...

Die Pflanzenzellwand ist eine dynamische Struktur. Wachsende Zellen werden durch eine primäre Zellwand umgeben ist, zu erweitern die Organisation, der ermöglicht Zellen. Zellen, die Kaution zu wachsen, um eine steifere Sekundärwand aufhören, die die mechanische Unterstützung der Anlage verbessert. Beide Zellwände bestehen aus Cellulose - Mikrofibrillen zusammengesetzt in einer Matrix aus Polysacchariden verschiedener Strukturen eingebettet (beispielsweise Hemicellulose und Pektin), die über die verschiedenen Entwicklungsstadien variieren und Geweben 1,2. Cellulose wird synthetisiert, wie Ketten (1,4) -β-D-Glucan, die eng ausgerichtet sind, die Mikrofibrillen einer kristallinen Struktur zu bilden. Amorpher Cellulose bezieht sich auf die Regionen, in denen die Glucan-Ketten weniger geordnet. Das Verhältnis zwischen dem kristallinen und dem amorphen Domänen ist ein Parameter gedacht , um die mechanischen Eigenschaften der Zellwand beeinflussen, durch die mechanische Festigkeit und viskoelastische Eigenschaft Bereitstellen bzw. 3. Verschiedene Verfahren wurdenentwickelt , um die zwei Formen von Cellulose Anordnung zu detektieren und zu quantifizieren, darunter Röntgenbeugung und Kreuzpolarisation / Magic Angle NMR Solid-State - Spinnen 4. Röntgenbeugung kann verwendet werden , um den Anteil an kristallinen gegenüber amorpher Cellulose Domänen in der Probe 5 zu bestimmen. Eine alternative Methode verwendet Fraktionierung von Zellwand-Gehalt in säureunlösliche und säurelösliches Material, zwischen dem kristallinen und amorphen Cellulose oder anderen Polymeren zu unterscheiden, respectively. Bei diesem Ansatz Einbau markierter Glukose ([14 C] Glucose) wird verwendet , um die Cellulose 6,7 zu quantifizieren. Diese Verfahren erfordern große Mengen von Pflanzenmaterial für ganze Organ Analysen allenfalls und daher sind unzureichend empfindlich auf gewebespezifische Variation in der Zellwandstruktur. Visualisierung von Zellulosemikrofibrillen auf zellulärer Auflösung kann in Live - Imaging - Studien mit Fluoreszenzfarbstoffen 8,9 kombiniert erreicht werden, dass Änderungen erkennen können,die Orientierung der Cellulosemikrofasern. Jedoch werden diese Farbstoffe nicht zur Quantifizierung verwendet, sie sind nicht spezifisch Cellulose kristallin und kann mit der normalen Struktur der Zellwand 8 stören. PolScope ist ein bildgebendes Verfahren , das auf der Fähigkeit von kristalliner Cellulose beruht Lichtstrahlen zu teilen und einen Teil des Lichts 10 zu verzögern. Licht Retardierung ist am stärksten für Mikrofibrillen, die senkrecht zur Richtung der Lichtausbreitung liegen. Für Mikrofibrillen mit ähnlicher Orientierung, desto höher ist der Grad der Kristallinität ist , desto größer der Lichtverzögerung 11. Daher wird PolScope verwendet zu untersuchen, sowohl die relativen Niveaus und der Orientierung der Cellulosemikrofasern. Wurzeln aufweisen lineares Wachstum, bei der Zellen an der Stammzellnische Ursprung an der Spitze der Wurzel, durchlaufen eine Reihe von Zellteilungen, bevor sie schnell 12 erweitern. Die Zellen, die das Wurzel erweitern in einer unidirektionalen (anisotroper)Art und Weise, wie durch kleine Molekül Signalisierungs Hormone diktiert, die die Eigenschaften der Zellwand 13 auswirken. Differential Reaktionen auf Hormone, in Zeit und Raum, ein Mittel zur Gewährleistung einer ausgewogenen Organwachstum 14. Daher können hochauflösende Analyse der Zellwandstruktur wichtige Informationen, die notwendig sind, um besser die Verbindung zwischen Zelltyp-spezifische Antworten auf ganze Organwachstum zu verstehen. Hier berichten wir über die Umsetzung der PolScope gewebespezifische Anreicherung von kristalliner Cellulose in Arabidopsis Wurzeln zu untersuchen, wie es in hoher Qualität anatomischen Abschnitten beobachtet. Dieses Verfahren kürzlich zelltypspezifischen Anhäufung von kristalliner Cellulose in Reaktion auf räumliche Störung der hormonellen Aktivität 15 freigelegt.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>spritzengetriebener 0,22 mm PVDF-Filter&nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica Bausatz Historesin</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>Einbettformen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>Film 100 & Mikro; P.P.C.&nbsp;</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>Überkopffolie</td></tr><tr><td>Messersägemaschine</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td></td><td>Thermo-9990402-Einbettmikroskop</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio Bildgebungssystem</td><td>CRI</td><td>Abrio Bildgebungssystem</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 Software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 Software</td><td></td></tr><tr><td>Frei zugängliche Bildanalysesoftware für polarisiertes Licht &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

hohe auflösung quantifizierung kristalliner cellulose akkumulation in<em&gt; arabidopsis</em&gt; roots gewebespezifische zellwand Änderungen überwachen

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Pflanzenzellen sind von einer Zellwand umgeben, deren Zusammensetzung ihre endgültige Größe und Form bestimmt. Die Zellwand besteht aus einer komplexen Matrix, die Polysaccharide enthält, zu denen Cellulose-Mikrofibrillen gehören, die sowohl kristalline Strukturen als auch Celluloseketten mit amorpher Organisation bilden. Die Ausrichtung der Zellulosefasern und ihre Konzentrationen bestimmen die mechanischen Eigenschaften der Zelle. Zur Bestimmung des Gehalts an kristalliner Cellulose werden mehrere Methoden verwendet, die jeweils sowohl Vorteile als auch Einschränkungen mit sich bringen. Einige können den Anteil der kristallinen Bereiche an der Gesamtcellulose unterscheiden. Sie beschränken sich jedoch auf Ganzorgananalysen, denen es an raumzeitlichen Informationen mangelt. Andere, die sich auf Live-Imaging verlassen, sind durch die Verwendung ungenauer Farbstoffe eingeschränkt. In dieser Arbeit berichten wir über ein empfindliches polarisiertes lichtbasiertes System zur spezifischen Quantifizierung der relativen Lichtverzögerung, das die akkumulation von kristalliner Cellulose in Querschnitten von Arabidopsis thaliana-Wurzeln darstellt. Bei dieser Methode bleiben die zelluläre Auflösung und die anatomischen Daten erhalten, was direkte Vergleiche zwischen den verschiedenen Geweben ermöglicht, aus denen die wachsende Wurzel besteht. Dieser Ansatz eröffnet eine neue analytische Dimension und beleuchtet den Zusammenhang zwischen Zellwandzusammensetzung, zellulärem Verhalten und dem Wachstum ganzer Organe.

Wir untersuchen die Auswirkungen der zelltypspezifische Reaktionen auf Brassinosteroiden (BRS), mit der Arabidopsis Wurzel als Modellorgan 15-17. Wenn der BR - Rezeptor BRI1 richtet, in dem Hintergrund BRI1 mutant, zu einer Untergruppe von Epidermiszellen nicht-Haarzellen (2A, B) genannt, es unidirektionalen Zellexpansion benachbarter Zellen hemmt und Vollwurzelwachstum 15. PolScope Analyse wurde durchgeführt, um den Mechanismus zu...

Kristalline Cellulose ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Die Quantifizierung mit zellulärer Auflösung ist jedoch eine technische Herausforderung. Hier berichten wir über den Einsatz von Polarisationslichttechnologie und Wurzelquerschnitten, um Informationen über die Zusammensetzung der Zellwände mit raumzeitlicher Auflösung zu erhalten.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Das übergeordnete Ziel dieser anatomischen Querschnittspräparation besteht darin, die relative Kristall- und Celluloseakkumulation auf zellulärer Ebene zu quantifizieren, wodurch direkte Vergleiche zwischen den verschiedenen Geweben der primären Arabidopsis-Wurzel ermöglicht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenphysiologie und -entwicklung zu beantworten, beispielsweise wie die zelluläre Zusammensetzung eines bestimmten Zelltyps das Wachstum eines gesamten Organs beeinflusst. Nachdem die Arabidopsis-Samen gemäß dem Textprotokoll sterilisiert wurden, verteilen Sie die sterilen Samen auf Platten, die 0,8 % Pflanzenagar und 0,5×M-Medium enthalten. Die Platten mit Parafilm umwickeln und mit Aluminiumfolie abdecken. Die Platten bei 4 Grad Celsius für ein bis vier Tage lagern, um eine gleichmäßige Keimung zu fördern. Anschließend die Platten in eine Wachstumskammer transferieren, die für das Kultivieren von Arabidopsis-Keimlingen geeignet ist, wobei die Platten vertikal ausgerichtet werden, um das Wurzelwachstum auf der Oberfläche des Agar-Mediums aufrechtzuerhalten. Bereiten Sie die Richardson-Lösung gemäß dem Textprotokoll zu. Filtern Sie vor der Verwendung durch eine spritzenbetriebene 0,22-Mikron-PVDF-Filtereinheit.Bereiten Sie anschließend unter einem chemischen Abzug 50 Milliliter Fixansatz vor, indem Sie 38 ml 0,5 M Natriumcacydylat mit 2,5 ml Glutaraldehyd mischen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Richardsons Lösung zur Fixierungslösung hinzu, um die endgültige Fixierungslösung zu erhalten. Verwenden Sie eine vormarkierte Platte und geben Sie 2 bis 3 ml der endgültigen Fixierungslösung in die Vertiefungen, sodass die Lösung die Keimlinge vollständig bedeckt.Übertragen Sie mit Hilfe von Plastikspitzen vorsichtig bis zu 10 Sämlinge in jede Vertiefung. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm, bevor Sie sie mindestens eine Nacht lang und bis zu einer Woche im Dunkeln bei 4 Grad Celsius lagern. Um die fixierten Sämlinge zu entwässern, nehmen Sie die Pflanzen mit der Pinzette am an und überführen Sie sie in die Vertiefungen neuer, beschrifteter Sechs-Loch-Platten, die aufsteigende Konzentrationen von Ethanol für die hier aufgeführten Zeiträume enthalten.Bereiten Sie das Infiltrationsmedium in einer kleinen Glasflasche vor, indem Sie den Inhalt eines Beutels Historesin-Aktivator mit 50 ml Basisharzflüssigkeit mischen. Geben Sie ein Magnetröhrchen hinzu und rühren Sie die Lösung 20 Minuten lang auf einem Rührgerät um. Füllen Sie die beschrifteten Vertiefungen einer 6-Loch-Platte mit 2 bis 3 ml Infiltrationsmedium.Danach, wenn die Sämlinge vollständig dehydriert sind, mit einer Pinzette in das Infiltrationsmedium überführen, wobei sicherzustellen ist, dass sie vollständig vom Medium bedeckt sind. Die Proben mindestens vier Tage bei 4 Grad Celsius lagern, um eine maximale Penetration in das Pflanzengewebe zu gewährleisten. Zum Vorbereiten der Blocke kleine Etiketten aus Bleistift mit dem Probennamen beschriftet in jede Vertiefung der Einbettungsformen legen.Bereiten Sie das Einbettmedium vor, indem Sie 1 ml Härter zu 15 ml Infiltrationsmedium hinzufügen. Füllen Sie mit etwa 200 Mikrolitern Einbettmedium die Hälfte jedes Wells in der Form. Decken Sie die Form mit einer überstehenden Folie ab und geben Sie auf jeder Seite zusätzlich 1 ml hinzu.Die Formen für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um eine teilweise Polymerisation zu ermöglichen. Danach eine zusätzliche Portion Einbettmedium herstellen und auf Eis halten, um die Polymerisation zu verhindern, während die Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden. Einbettmedium in eine kleine Platte geben und ein Sämling in das Medium legen.Unter einem Stereomikroskop verwenden Sie ein Skalpell, um jede Wurzelspitze abzuschneiden, und positionieren diese dann sehr vorsichtig etwa 2 bis 3 mm vom Rand der Form entfernt entweder vertikal für Querschnitte oder horizontal für Längsschnitte in der Form. Nachdem das Gewebe angeordnet wurde, füllen Sie die Form vollständig mit Einbettmedium und bedecken sie mit einer Abdeckfolie. Anschließend mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Trocknen stellen Sie die Blöcke in einen Exsikkator mit trockenem Silikagel und lassen sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen.Unter Verwendung eines Messerherstellers, der mit einem Diamantschneidwerkzeug ausgestattet ist, bereiten Sie Glasscheren aus Glasstäben vor, indem Sie den Glasstab in ein Quadrat schneiden und anschließend das Quadrat diagonal teilen, um zwei Scheren zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass beide Scheren scharfe Kanten aufweisen. Montieren Sie einen Block in eine Halterung.Danach mit einer industriellen Einwegklinge das überschüssige Blockmaterial bis auf einen Millimeter an der Wurzelspitze entfernen, um eine pyramidenförmige Struktur zu erhalten. Schneiden Sie den geformten Block in Scheiben mit einer Dicke von 2 bis 3 µm und übertragen Sie die Scheiben auf einen markierten Objektträger. Geben Sie anschließend Wassertropfen auf die Scheiben.Es ist wichtig, Schnitte mit einheitlicher Breite herzustellen, um die Variabilität der analysierten Daten zu minimieren. Legen Sie die Objektträger auf Heizblöcke, die auf niedrige Temperatur eingestellt sind, bis das Wasser verdunstet ist. Um die Objektträger für die Betrachtung unter einem polarisierten Mikroskop vorzubereiten, verdünnen Sie die Richardson-Lösung auf 2 % der ursprünglichen Konzentration und verwenden Sie etwa 1 ml, um die Schnitte zu bedecken.Legen Sie die Proben anschließend für 5 Sekunden auf den Heizblock und waschen Sie sie mit destilliertem Wasser. Nach dem Trocknen der Objektträger auf dem Heizblock untersuchen Sie die Schnitte unter einem Stereomikroskop und markieren Sie mit einem Stift die Rückseite eines Objektträgers, um die Position der interessierenden Schnitte anzugeben. Geben Sie 100 µL Einbettmedium hinzu, bevor Sie mit dem Deckglas abdecken.Bild aufnehmen und gemäß dem Textprotokoll analysieren. Gezeigt ist ein Querschnitt der primären Wurzel von Arabidopsis mit radialer Organisation ihrer Bestandteile aus Zellen und Geweben, einschließlich Nicht-Haarspitzenzellen, Haarspitzenzellen und Cortex. Dieses konfokale Bild zeigt die BRI1-GFP-Expression in Nicht-Haarspitzenzellen in einem BRI1-Mutanten-Hintergrund, der die unidirektionale Expansion benachbarter Zellen und das gesamte Wurzelwachstum hemmt.Wie hier zu sehen, wiesen Längsschnitte der Wurzeln, die aus dem Wildtyp sowie aus Linien stammten, die BRI1 in Nicht-Haarspitzenzellen exprimieren, eine ähnliche Orientierung der Cellulose-Mikrofibrillen auf, wobei in den meristematischen Zellen eine hohe Variabilität der Winkel im Vergleich zu den Zellen der Übergangszone vorhanden war. Dies ermöglicht einen Vergleich der relativen Anreicherung von Kristallen in der Cellulose in den entsprechenden meristematischen und elongierenden Zellen der beiden genetischen Hintergründe, wie hier in Querschnitten gezeigt, und zeigt eine Korrelation zwischen der Expression von BRI1 in Nicht-Haarspitzenzellen und einer hohen lokalen Anreicherung von Kristallen in der Cellulose auf. Im Allgemeinen werden sich Anwender, die mit dieser Methode neu in den Videos sind, schwer tun, da es schwierig ist, während des Einbettungsverfahrens gut orientierte Wurzeln zu erhalten.Daher sollten mehrere Blöcke zur Schnittführung vorbereitet werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann ein einzelner Blockschnitt in 2 bis 3 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Kristallakkumulation in der Cellulose zwischen Zellen vergleichbar ist, sofern sie eine ähnliche Ausrichtung ihrer Cellulose-Mikrofibrillen aufweisen, wie durch Längsschnitte bestimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arabidopsis-Keimlinge fixiert, in Blöcke einbettet und anschließend longitudinale und transversale Wurzelquerschnitte herstellt. Außerdem sollten Sie einen guten Einblick in die Daten erhalten haben, die mittels polarisierter Lichtmikroskopie gewonnen werden können.

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Biology

Biologie

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Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in Arabidopsis Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen (Video) | JoVE Journal

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