Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hefeproteine zu extrahieren und gleichzeitig die native Struktur, die Funktionsinteraktionen und posttranslationale Modifikationen zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen gezüchtet werden, um die Expression des interessierenden Proteins zu induzieren. Anschließend werden die geernteten Hefezellen in einem geeigneten Puffer homogenisiert, um die Proteine zu extrahieren.

Dann werden die Proteine von Interesse aus dem geklärten Ganzzellextrakt mit einer Affinität von Harz gereinigt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigten Proteine aus dem Affinitätsharz für die weitere Analyse oder nachgelagerte Anwendungen zu entfernen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Modifikationen und Wechselwirkungen bei der Proteinreinigung auf der Grundlage der Western-Blot-Analyse zeigen.

Das Verfahren wird von Eva's Ky demonstriert, einer Absolventin von William und Mary, die die letzten Jahre als Forscherin in meinem Labor verbracht hat. Der Hauptvorteil des Bead-Beading gegenüber anderen bestehenden Methoden ist die schnelle Verarbeitung und Lyse mehrerer Proben unter Bedingungen, die Wechselwirkungen zwischen Proteinfunktionen und posttranslationalen Modifikationen erhalten. Um zu beginnen, Zellen eines gal positiven Hefestammes mit einem Plasmid zu transformieren, das für eine Galactose-induzierbare sechs kodiert, inokulieren Sie das markierte Protein der Wahl Transformanten in fünf Millilitern eines geeigneten selektiven Mediums wie SD Uracil, das 2%Saccharose enthält, und inkubieren bei 30 Grad Celsius über Nacht mit Rotation am folgenden Tag, verdünnen Sie die Übernachtkultur in selektivem Medium mit 2%Saccharose auf ein Endvolumen von 33 Millilitern, so dass die optische Dichte bei 600 Millilitern Nanometer messen 0,3 und wachsen in einem Schüttelbrutkasten bei 30 Grad Celsius und 150 U/min.

Wenn die Kultur einen OD 600 von 0,8 bis 1,5 erreicht hat, induzieren Sie die Expression des gewünschten Proteins, indem Sie 17 Milliliter von drei XYEP mit 6 % Galaktose für eine Endkonzentration von einem XYEP mit 2 % Galaktose hinzufügen und für weitere fünf bis sechs Stunden in einen Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius geben. Nach der Messung des OD 600 der induzierten Kulturzentrifuge etwa 150 bis 200 OD 600 Einheiten Zellen für fünf Minuten bei 5.000 U/min bei vier Grad Celsius, dann verwenden Sie einen Milliliter eiskaltes XPBS mit einem x Proteaseinhibitor-Cocktail, um den Zellgaumen wieder zu suspendieren und in ein zwei Milliliter Schraubverschlussröhrchen zu überführen, zentrifugieren Sie die Zellen für eine Minute bei 15, 000 U/min und vier Grad Celsius. Nach dem Umfüllen des Überstands frieren Sie das Zellpellet in flüssigem Stickstoff zu dem gefrorenen Zellpellet ein.

Fügen Sie 200 Mikroliter säuregewaschene Glasperlen und 500 Mikroliter eiskalten Lysepuffer hinzu. Halten Sie die Schläuche immer auf Eis. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit dem abgeschnittenen Ende, um kurz bei vier Grad Celsius auf und ab zu pipettieren.

Legen Sie die Zellenröhrchen in die Gleichgewichtssperre der Kugelmühle und lassen Sie die Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers 20 Sekunden lang mit 5,5 Metern pro Sekunde laufen. Lege die Röhren dann für eine Minute auf matschiges Eis. Wiederholen Sie dies insgesamt sechsmal, um die extrahierten Proteine zu reinigen, zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius.

Anschließend wird eine Probe des ganzen Zellextrakts oder WCE für Western Blot und WCE vorbereitet, die zwei OD 600 Einheiten Zellen auf 800 Mikroliter 20%ige Trichloressigsäure oder TCA-Wirbel zum Mischen bringt. Um eine Probe von klarem WCE bei 50 bis 100 Mikrolitern Affinitätsharz zu reinigen, waschen Sie das neue Mikrozentrifugenröhrchen und äquilibrieren Sie das Harz durch Zugabe von einem Milliliter Waschpuffer und invertieren Sie von oben nach unten, bis das Harz resuspendiert ist. Nachdem Sie eine Minute lang bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius geschleudert haben, aspirieren Sie den Überstand, um das Protein für die Affinitätsreinigung bei 100 bis 200 Mikrolitern klarem Lysat an die gewaschenen Kügelchen zu binden, und verwenden Sie Lysepuffer, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen.

Inkubieren Sie mit Mutation oder Schaukeln bei vier Grad Celsius für zwei bis fünf Stunden. Die Aliquots des verbleibenden klaren WCE werden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert, während die Lysat-Rübenlösung für die WCE-Western-Blot-Probe auf Eis inkubiert. Nachdem Sie zweieinhalb Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius geschleudert haben, dekantieren Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass das Pellet zurückgehalten wird, fügen Sie dem Pellet 800 Mikroliter 2 % TCA hinzu und wirbeln Sie das Rohr ein, bevor Sie das zweieinhalbminütige Schleudern wiederholen.

Nach vorsichtigem Dekantieren des Überstands 100 Mikroliter TCA-Probenpuffer hinzufügen und vortexen, um das Pellet aufzulösen, bevor die Probe inkubiert wird. In einem 100 Grad Celsius heißen Block dauert es zwei bis fünf Minuten lang, bis sich alle Reste des Pellets vollständig aufgelöst haben, die sich nur schwer auflösen und bei minus 80 Grad Celsius lagern lassen, bis es verwendet werden kann. Sobald die Lysatbead-Probe inkubiert ist, wird das Harz nach einer Minute bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius eine Minute lang mit Waschpuffer fünfmal gewaschen, um die Proteine zu eluieren.

Geben Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in das Harz mu tat. Schleudern Sie eine Minute lang bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius und bewahren Sie den Überstand in einer neuen Röhre auf. Schließlich zur Vorbereitung einer Probe für den Western Blot bei 25 Mikrolitern von zwei x Lithium-Docalsulfat-Probenpuffer mit zwei Mikrolitern BME zu 25 Mikrolitern UD-Proteinprobe.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, kann eine Vielzahl von Proteinen reproduzierbar aus Hefezellen extrahiert werden. Diskrete Banden über einen Bereich von Molekulargewichten sind ein Hinweis auf qualitativ hochwertige Proteinextrakte. Die Qualität der Extrakte kann durch Western Blotting für spezifische Epitop-markierte Proteine bestätigt werden.

Hier ist ein repräsentatives Ergebnis für die Galaktose-überexprimierte V-Fünf-markierte Sumo-Ligase, die bei etwa 120 Kilodalton migriert. Im Allgemeinen würden teilweise abgebaute Proteine als mehrere Fragmente unter dem erwarteten Gewicht verlaufen, aber hier wird nur Protein in voller Länge beobachtet. Darüber hinaus können Zusätze mit hohem Molekulargewicht eines bestimmten Proteins auf posttranslationale Modifikationen hinweisen.

Zum Beispiel können Sie hier Laktose über exprimiertem Sumo-bezogenem S sehen, eins, Delta, vier, 40 und SIS in voller Länge. Wie in diesem Western Blot gezeigt, können Modifikationen auch auf endogen exprimiertem S erhalten bleiben. Diese Abbildung zeigt, dass zwei nukleär angereicherte Proteine, SLX five und CS one delta four 40, erfolgreich aus unserem ws aufgereinigt wurden.

Bemerkenswert ist, dass ein sechs-hiss-markiertes Protein affinitätsgereinigt von W'S sein kann, sowohl unter nativen als auch unter denaturierenden Bedingungen. Im Gegensatz dazu fehlt SLX 5G ST und CS one delta four 40 ha ein Sechs-Hiss-Epitop, interagieren aber unter nativen Bedingungen immer noch sehr empfindlich mit dem Metall-Affinitätsharz. Wir schlagen vor, dass CIS one und in geringerem Maße SLX five in der Lage sind, das Metall-Affinitätsharz über ihre metallkoordinierende Ringdomäne zu binden.

Während unseres Wissens über dieses spezielle Phänomen noch nicht berichtet wurde, wurde eine ähnliche Situation beschrieben, in der die Untereinheit Choletoxin B das Nicola-Affinitätsharz auf eine Weise bindet, die durch seine natürlichen Histaminreste vermittelt wird. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass Proteine im WCER, zumindest teilweise, nativ gefaltet sind, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Es ist wichtig zu zeigen, dass Proteinkomplexe in Ganzzellextrakten intakt bleiben.

Repräsentative Daten zeigten, dass CS eins, Delta vier, 40 SLX fünf und P GK eins, ein zytosolisches Protein, das als Belastungskontrolle dient, in WS cis eins vorhanden waren. Delta four 40 wurde aus diesen Extrakten aufgrund seiner inhärenten Fähigkeit, an metallaffine Harze zu binden, gereinigt. Wenn SLX five und SIS one in Hefezellen koexprimiert wurden, waren die SLX 5-Spiegel in den EITs erhöht, was die Möglichkeit erhöht, dass SLX five mit SIS one interagiert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hefezellen gezüchtet und verarbeitet werden, um Hefeproteine unter nativen Bedingungen zu extrahieren, zu reinigen und zu visualisieren.