Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefe-Proteine zu isolieren, wobei die native Struktur, Funktionsinteraktionen und posttranslationale Modifikationen erhalten bleiben sollen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst angezüchtet werden, um die Expression des Proteins von Interesse zu induzieren. Anschließend werden die geernteten Hefezellen in einem geeigneten Puffer homogenisiert, um die Proteine zu extrahieren.

Anschließend werden die Proteine von Interesse aus dem geklärten Gesamtzelllysat mithilfe eines Affinitätsharzes gereinigt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigten Proteine vom Affinitätsharz zu eluieren, um sie weiteren Analysen oder nachgeschalteten Anwendungen zuzuführen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Proteinreinigungsmodifikationen und -interaktionen anhand einer Western-Blot-Analyse zeigen.

Den Ablauf demonstriert Eva Ky, eine Absolventin der William and Mary, die die letzten Jahre als Doktorandin in meinem Labor tätig war. Der Hauptvorteil der Perlen-basierten Zelllyse gegenüber anderen etablierten Methoden liegt in der schnellen Aufarbeitung und Lyse mehrerer Proben unter Bedingungen, die Protein-Funktionen, Wechselwirkungen sowie posttranslationale Modifikationen erhalten. Zunächst werden Zellen eines gal-positiven Hefe-Stamms mit einem Plasmid transformiert, das ein galaktose-induzierbares, sechsfach his-markiertes Protein Ihrer Wahl kodiert; die transformierten Zellen werden in fünf Milliliter geeignetem selektivem Medium, beispielsweise SD-Uracil, das 2 % Saccharose enthält, angesetzt und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Rotation inkubiert. Am folgenden Tag wird die Übernachtkultur in selektivem Medium mit 2 % Saccharose auf ein Endvolumen von 33 Milliliter verdünnt, sodass die optische Dichte bei 600 Nanometern einen Wert von 0,3 erreicht; anschließend wird in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 150 U/min weiter kultiviert.

Wenn die Kultur einen OD 600 von 0,8 bis 1,5 erreicht hat, induzieren Sie die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe von 17 Milliliter dreifacher XYEP mit 6 % Galactose, um eine Endkonzentration von einwertigem XYEP mit 2 % Galactose zu erreichen, und inkubieren Sie die Probe fünf bis sechs Stunden lang in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius. Nach der Bestimmung des OD 600 der induzierten Kultur zentrifugieren Sie etwa 150 bis 200 OD 600-Einheiten der Zellen fünf Minuten bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius. Suspendieren Sie das Zellpellet anschließend in einem Milliliter eiskaltem einwertigem XPBS mit einer x-Proteaseinhibitorcocktail und überführen Sie es in eine 2-Milliliter-Schraubkappengefäß. Zentrifugieren Sie die Zellen eine Minute bei 15.000 U/min und vier Grad Celsius. Nach dem Abgießen des Überstandes gefrieren Sie das Zellpellet sofort in flüssigem Stickstoff ein, um das gefrorene Zellpellet zu erhalten.

Fügen Sie 200 Mikroliter sauregewaschene Glaskügelchen und 500 Mikroliter eiskaltes Lysepuffer hinzu. Halten Sie die Röhrchen stets auf Eis. Benutzen Sie eine Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende, um kurz bei vier Grad Celsius auf- und abzupipettieren.

Stellen Sie die Röhrchen mit den Zellen in die Kugelmühle-Balance-Schleuse und betreiben Sie das Gerät gemäß den Herstelleranweisungen 20 Sekunden lang mit 5,5 Metern pro Sekunde. Anschließend stellen Sie die Röhrchen für eine Minute auf scharfes Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt sechsmal, um die extrahierten Proteine abzuklären; zentrifugieren Sie dann 15 Minuten bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius.

Dann zur Herstellung einer Probe des gesamten Zellextrakts oder WCE für die Westernblot-Analyse: WCE entsprechend zwei OD-600-Einheiten Zellen mit 800 Mikrolitern 20 % Trichloressigsäure (TCA) versetzen und vortexen, um eine homogene Mischung zu erhalten. Zur Reinigung einer Probe des klaren WCE: 50 bis 100 Mikroliter Affinitätsmatrix in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben, die Matrix waschen und äquilibrieren, indem man ein Milliliter Waschpuffer hinzufügt und das Röhrchen mehrmals umgedreht, bis die Matrix resuspendiert ist. Nach einer Zentrifugation für eine Minute bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius den Überstand abpipettieren. Um das Protein für die Affinitätsreinigung zu binden, 100 bis 200 Mikroliter des geklärten Lysats zu den gewaschenen Kügelchen geben und den Gesamtvolumen mit Lysispuffer auf ein Milliliter ergänzen.

Inkubieren Sie mit Mutation oder Schütteln bei vier Grad Celsius für zwei bis fünf Stunden. Verwenden Sie flüssigen Stickstoff, um Aliquote des verbleibenden klaren WCE schnell einzufrieren, und lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung, während die Lysat-Rübenlösung für die WCE-Western-Blot-Probe auf Eis inkubiert wird. Nach einer Zentrifugation für zweieinhalb Minuten bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, wobei Sie das Pellet zurückbehalten; geben Sie 800 Mikroliter 2 %iger TCA zum Pellet hinzu und wirbeln Sie das Gefäß, bevor Sie die zweieinhalbminütige Zentrifugation wiederholen.

Nach sorgfältigem Abgießen des Überstandes 100 Mikroliter TCA-Probenpuffer hinzufügen und vortexen, um das Pellet aufzulösen, bevor die Probe inkubiert wird. In einem Wärmepufferblock bei 100 Grad Celsius zwei bis fünf Minuten lang erneut erhitzen, um eventuelle Reste des Pellets vollständig aufzulösen, die schwer löslich sein können, und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die Probe verwendet wird. Sobald die Lyseperlenprobe inkubiert wurde, nach einer Zentrifugation bei 5.000 U/min und 4 Grad Celsius für eine Minute den Harz mit Waschpuffer fünfmal waschen, um die Proteine eluieren zu können.

Geben Sie 150 µL Elutionspuffer zur Harzmutante bei vier Grad Celsius für fünf Minuten hinzu. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Röhrchen. Zum Schluss bereiten Sie eine Probe für die Westernblot-Analyse vor, indem Sie 25 µL 2x Lithiumdodecylsulfat-Probenpuffer mit zwei µL BME zu 25 µL UD-Probe hinzufügen.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, können eine breite Palette von Proteinen reproduzierbar aus Hefezellen gewonnen werden. Diskrete Banden über einen Bereich von Molekulargewichten hinweg deuten auf hochwertige Proteinextrakte hin. Die Qualität der Extrakte kann durch Western Blotting für spezifische Epitop-markierte Proteine bestätigt werden.

Hier ist ein repräsentatives Ergebnis für die überexprimierte Galactose-V5-markierte Sumo-Ligase 1, die bei etwa 120 Kilodalton wandert. Im Allgemeinen würden partiell abgebaute Proteine als mehrere Fragmente unterhalb des erwarteten Gewichts laufen, hier wird jedoch nur das vollständige Protein beobachtet. Zusätzlich können hohe molekulare Gewichte eines bestimmten Proteins auf posttranslationale Modifikationen hinweisen.

Beispielsweise können hier Lactose überexprimierte, mit Sumo assoziierte S-eins-Delta-vier-40- und vollständige SIS-eins-Proteine gesehen werden. Wie in diesem Western-Blot gezeigt, können auch Modifikationen an endogen exprimiertem S-eins erhalten bleiben. Diese Abbildung zeigt, dass zwei kernangereicherte Proteine, SLX-fünf und CS-eins-Delta-vier-40, erfolgreich aus unserem ws gereinigt wurden.

Bemerkenswerterweise kann ein mit sechs Hissen markiertes Protein aus W'S sowohl unter nativen als auch unter denaturierenden Bedingungen affinitätsgereinigt werden. Im Gegensatz dazu fehlt SLX 5G ST und CS ein Delta vier 40 ha ein sechs-His-Epitop, interagieren jedoch unter nativen Bedingungen dennoch auf eine ole-sensible Weise mit dem Metallaffinitäts-Resin. Wir schlagen vor, dass CIS eins und in geringerem Maße SLX fünf in der Lage sind, das Metallaffinitäts-Resin über ihre metallkoordinierende Ring-Domäne zu binden.

Obwohl nach unserem Wissen dieses spezielle Phänomen bisher noch nicht beschrieben wurde, ist eine ähnliche Situation bereits dokumentiert, bei der das Choleratoxin-B-Subunit über seine natürlichen Histidinreste an ein Nicola-Affinitätsresin bindet. Diese Beobachtung legt nahe, dass Proteine in den WCER zumindest teilweise in ihrer nativen Faltung vorliegen, was für die Untersuchung der Proteinfunktion von Bedeutung ist. Es ist wichtig nachzuweisen, dass Protein-Komplexe in Gesamtzell-Extrakten intakt bleiben.

Eine repräsentative Datenauswertung zeigte, dass CS one delta four 40 SLX five und P GK one a, ein zytoplasmatisches Protein, das als Ladekontrolle dient, in WS cis one vorhanden waren. Delta four 40 wurde aus diesen Extraktaten basierend auf seiner inhärenten Fähigkeit, an Metallaffinitätsresins zu binden, gereinigt. Außerdem stiegen die SLX five-Mengen in den EITs an, wenn SLX five und SIS one gemeinsam in Hefezellen exprimiert wurden, was die Möglichkeit nahelegt, dass SLX five mit SIS one interagieren könnte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hefezellen kultiviert und verarbeitet, um Hefe-Proteine unter nativen Bedingungen zu extrahieren, zu reinigen und sichtbar zu machen.