Name: Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Lernen Sie die effiziente Proteinextraktion aus Bäckerhefe unter Erhaltung nativer Strukturen, Interaktionen und post-translationaler Modifikationen. Diese Methode ermöglicht präzise biochemische Analysen.

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Wir danken allen Mitgliedern der Kerscher Labor für ihre Unterstützung. Wir danken Mark für Hochstrasser Hefestamm MHY3765. Diese Arbeit wurde von der NSF 1051970 (OK) und Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reisestipendium und Monroe Scholars Program Grant (ES) unterstützt.

Reinigung von 6xHis-markierte Proteine ​​in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt 1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression (Geändert von 2) Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben. <ol><li> Verwandeln Zellen eines Gal + Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-markierten Protein der Wahl. Siehe zum Beispiel Reagenzien Liste. </li><li> Impfen Transformanten in 5 ml geeigneten selektiven Medien (z. B. SD-Uracil) mit 2% Saccharose. Inkubation bei 30 ° CO / N, rotierend. </li><li> Verdünnen O / N-Kultur, so dass die optische Dichte bei 600 nm 0,3 (OD 600 = 0,3) misst in 33 ml selektivem Medium mit 2% Saccharose. Wachsen bei 30 ° C, Zittern (Δ150 rpm). </li><li> Wenn die Kultur hat OD 600 = 0,8 erreichte-1.5, Induzieren die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe von 17 ml YEP 3x mit 6% Galactose (in der nachfolgenden Tabelle 1) bei einer endgültigen Konzentration von 1x YEP mit 2% Galaktose. Insgesamt Kultur Volumen ist nun 50 ml. Inkubieren, Schütteln, bei 30 ° C für weitere 5-6 Stunden. Hinweis: das Kulturvolumen variiert werden kann. In Schritt 1.3, verdünnt in zwei Drittel der gewünschte Endvolumen. In Schritt 1.4, fügen Sie ein Drittel der endgültigen Volumen von 3x YEP / 6% Galaktose. </li><li> Messen der OD 600 der induzierten Kultur und Zentrifuge Δ150-200 OD 600 Einheiten von Zellen für 5 min bei 5000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Zellpellet mit 1 ml eiskaltem 1x PBS mit 1x Proteaseinhibitorcocktail und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr. </li><li> Zentrifuge Zellen für 1 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Überstand dekantieren. </li><li> Schnellfrostmedium Zellpellet in flüssigem Stickstoff gefolgt von unmittelbarer Zelllyse oder Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol><ol><li> Um dem gefrorenen Zellpellets aus dem vorherigen Schritt, 200 ul acid-washed Glasperlen und 500 ul eiskaltem Lysepuffer (Rezept in Tabelle 1 oder verwenden Zelllysepuffer der Wahl). </li><li> Kurz und Abpipettieren. Es ist nicht erforderlich, um vollständig Zellpellet. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten. Hinweis: Das Ende der Pipettenspitze kann, bevor und Abpipettieren geschnitten werden. </li><li> Bei 4 ° C, statt die Röhre (n) mit Zellen in der Kugelmühle, Balance, Schloss, und führen Sie die Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie die Kugelmühle mit der Röhre (n) für 20 Sekunden bei 5,5 m / sec, dann auf matschigen Eis legen für 1 min. Wiederholen 6x insgesamt. </li><li> Löschen der extrahierten Proteine ​​durch Zentrifugation für 15 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. OPTIONAL: entfernen kleine Partikel durch Zentrifugation durch ein SpinX Filter. </li><li> Vorbereiten einer Probe der gesamten Zelle eXtract (WCE), um die Anwesenheit des Proteins von Interesse durch Western Blot bestätigen: <ol><li> In WCE entsprechenden OD 600 mit 2 Einheiten von Zellen (zB 5 ul Extrakt gelöscht, wenn 200 OD 600 Einheiten von Zellen wurden geerntet) bis 800 ul 20% Trichloressigsäure (TCA). Vortex mischen. </li><li> Zentrifuge für 2,5 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten. </li><li> In 800 ul 2% TCA dem Pellet und Wirbel der Röhre, durch Zentrifugation für 2,5 min bei 15.000 Upm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten. </li><li> In 100 ul TCA Sample Buffer (Rezept in Tabelle 1), Vortex zu Pellets aufzulösen. Hinweis: Wenn die Probenpuffer sauer wird (wird gelb) nach Zugabe zu dem Pellet, fügen Aliquots Δ10 ul Tris base [1M], bis die Probe wieder blau. </li><li> Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2-5 min. </li><li> Vortex again vollständig auflösen, wenn Reste von Pellet noch vorhanden sind. Pellets nach dieser Methode hergestellt werden, sind bekanntlich schwer vollständig zu lösen. Es kann Δ10 min Vortexen vollständig auflösen Pellets. </li><li> Shop Probe bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Schnellfrostmedium Aliquots restlichen gelöscht WCE in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 3. Batch Reinigung von Proteinen aus Hefe Zellhomogenaten Hinweis: Dieses Reinigungsverfahren wurde zur Reinigung von 6xHis-markierten Proteine ​​auf Co 2 + Metall Affinitätsharz optimiert. <ol><li> Resin Equilibration <ol><li> Für eine Probe geräumte WCE von Δ20-40 OD 600 Einheiten von Zellen hergestellt, fügen 50-100 ul Affinitätsharz in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Proteine ​​aus Zellen, die nicht zum Ausdruck hat das gewünschte Protein oder eine unspezifische Harz wie Amylose, extrahiert kann als Kontrolle verwendet werden,s für unspezifische Bindung. </li><li> Waschen Harz 5x mit 1 ml Waschpuffer: invertieren top-over-Boden bis Harz wird suspendiert, und dann drehen für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand. Hinweis: Wenn die Durchführung Extraktion und Reinigung am selben Tag, Harz Äquilibrierung kann vor der Extraktion durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Protein Binding für Affinity Purification <ol><li> 100-200 ul geklärte Lysat (Δ20-40 OD 600 Einheiten), 50-100 ul gewaschenen Perlen, und bringen das Gesamtvolumen auf 1 ml mit Lysepuffer. </li><li> Inkubation mit Nutation oder rocking bei 4 ° C für 2-5 Stunden. </li><li> Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Falls gewünscht, Speichern einer Probe der verbliebenen Überstand für die nachfolgende Analyse von ungebundenen Proteinen. TCA ausgefällt wie oben für die WCE (Schritt 2.6). </li><li> Waschen mit Harz gebundenen Proteine ​​5x mit 1 ml Waschpuffer durch einen Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei gefolgt4 ° C. Die Proben Kälte während Wäschen. </li></ol></li><li> Elution der gebundenen Proteine <ol><li> In 150 ul Elutionspuffer zum Harz, nutieren bei 4 ° C für 5 min, Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. OPTIONAL: Wiederholen 2x und Pool Elutionen. </li><li> Bereiten eluierten Probe für Western-Blot: Um 25 ul eluierten Proteine, fügen Sie 25 ul 2x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer mit 2 ul β-Mercaptoethanol (BME) und Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2 min. Hinweis: Standard-2X Laemmli Probenpuffer können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Schnellfrostmedium überschüssige eluierte Protein in flüssigem Stickstoff. OPTIONAL: strip restlichen Proteine ​​aus Harz mit dem gleichen Volumen 2x LDS-Probenpuffer bei 65 ° C für 5 min, entfernen Sie die LDS-eluierten Proteine ​​in ein neues Röhrchen, dann fügen Sie 2 ul BME zu den eluierten Proteine, nicht an das Harz. Dieser Auftrag ist auf das Entfernen von Ionen oder Antikörper, die Konjugation sind zu vermeidented zu den Perlen. </li><li> Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Western Blot und Sonde mit entsprechenden Antikörpern Proteine ​​zu visualisieren. <ol><li> Legen 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 Einheiten) jeder Probe und 3-10 ul eines Proteins Leiter in einem SDS-PAGE-Gel der Wahl. Gels routinemäßig für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen 4-12% Bis-Tris und 8% Tris-Glycin. </li><li> Führen Gel bei 200 V für 50 min. </li><li> Übertragen Proteine ​​aus Gel auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenen Transfer bei 19 V für 20-30 min (Rezept in Tabelle 1). </li><li> Blockieren Membran in 4% milk/1x Tris gepufferte Kochsalzlösung-Tween (TBST) für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C (in der nachfolgenden Tabelle 1). </li><li> Dazu werden die Membranen mit primären Antikörpers an das Epitop-markierten Proteins von Interesse in 4% milk/1x TBST für 1-3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit 1x TBST. </li><li> Inkubieren Membran mit geeignetensekundären Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Antikörper für 1-3 h bei RT. </li><li> Waschen Sie die Membran 3x für je 15 min in einem großen Volumen von 1x TBST. </li><li> Titelbild Membran mit ECL Substrat und wickeln Sie sie in Frischhaltefolie. </li><li> Expose Membran zu filmen und zu entwickeln, um Proteine ​​zu visualisieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine ​​von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen 12 hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Western-Bl...

Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand 1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt 2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum Beispiel kann das Hefe-Zellwand mit lytischen Enzymen (zB Zymolyase) und die daraus resultierenden Sphäroblasten entfernt werden kann durch Scherung, Detergenzien oder osmotische Lyse, um Proteine ​​freizusetzen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich als Ausgangspunkt für viele subzelluläre Fraktionierung eingesetzt, aber es erfordert langwierige Inkubationendie nicht kompatibel sind mit der Stabilität einiger Proteine ​​7. Proprietary Hefelyse Reagenzien (z. B. Waschmittel) für die chemische Extraktion von Proteinen von Hefezellen sind im Handel erhältlich, aber die Wirksamkeit dieser Reagenzien in Protein-Extraktion und ihre Wirkung auf nachfolgende biochemische Charakterisierung von Proteinen ist nicht immer klar, 8. Hochdruckhomogenisatoren, die oft als Französisch Pressen bezeichnet, effektiv zu brechen Hefezellen durch sie einer ersten hohen Druck und anschließend extrudiert durch eine kleine Öffnung in einer Druckzelle. Diese Technik produziert hochwertige Extrakte aber die Ausrüstung ist sehr teuer und nicht geeignet für kleine Mengen von Zellen oder mehrere Proben 9. Daher ist die mechanische Störung der Hefezellen in einer Kugelmühle oft die Methode der Wahl für die native Hefeprotein Zubereitungen 10. Diese Technik beinhaltet mechanische Zerstörung des Hefe-Zellwand mit Säure-waSchuppen Glasperlen, die mit einer Vielzahl von Schüttler, Vortexer oder Kugelmühlen durchgeführt werden kann. Insbesondere kann dieses Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig zu verarbeiten mehrere kleine Proben (1 ml Zellen oder weniger) ist. Viele verschiedene Perlen oder Kugelmühle Störung Matrizen sind jetzt im Handel erhältlich für fast jede Art von Zelltyp in 2-ml-Röhrchen zu stören. Unter Berücksichtigung der sonstigen Techniken und Ausrüstung hat eine Perlmühle den zusätzlichen Vorteil, dass die Unterbrechung des Hefe-Zellen sehr schnell, die hilft, posttranslationale Modifikationen wie sumoylation erhalten auftritt, vor allem, wenn die entsprechenden Puffer mit Protease-und / oder Proteasom-Inhibitoren verwendet werden, und die Temperatur der Extrakte gesteuert wird. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die schnelle, effektive und zuverlässige Extraktion von endogenen und überexprimierten Proteine ​​unter schonenden Bedingungen mit dem Ziel, um Protein-Funktion, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. Nährmedien, ZelllysepufferZusammensetzungen und Perlmühle Einstellungen optimiert, um Protein-Wechselwirkungen und posttranslationale Modifikationen wie sumoylation und Ubiquitinierung halten.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-ORF-Stamm in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ Hefestamm, der für die Induktion und Extraktion verwendet werden</td></tr><tr><td>kann pYES2.1 TOPO Vektor</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ Hefestamm, der für Induktion und Extraktion verwendet werden kann; enthält einen V5/6xHIS Tag</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Röhrchen mit Sockel und angebundenem Schraubverschluss</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Stellen Sie sicher, dass das Röhrchen richtig in den Perlenruptor passt</td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen, 425-600 & micro; m (30-40 US-Sieb)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Zur zusätzlichen Filterung von geklärtem Lysat</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Für die Aufreinigung von 6xHIS-markierten Proteinen</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Zur Vorbereitung und/oder Eluierung von Proben vor SDS-PAGE und Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Fertiggele, die häufig für SDS-PAGE vor Western Blotting verwendet werden</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Protein-Gel-Färbung</td></tr><tr><td>Säugetier-Lysepuffer</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternativer kommerzieller Lysepuffer</td></tr><tr><td>Anti-V5-Agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Methode der Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS Gele</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc-Antikörper</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Ziege pAb zu Maus IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

bäckerhefe protein extraktion und reinigung für das studium der funktion, wechselwirkungen, und post-translationale modifikationen

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine ​​und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine ​​durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine ​​eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.

Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis&gt; 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend für hochwe...

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefe-Proteine zu isolieren, wobei die native Struktur, Funktionsinteraktionen und posttranslationale Modifikationen erhalten bleiben sollen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst angezüchtet werden, um die Expression des Proteins von Interesse zu induzieren. Anschließend werden die geernteten Hefezellen in einem geeigneten Puffer homogenisiert, um die Proteine zu extrahieren.Anschließend werden die Proteine von Interesse aus dem geklärten Gesamtzelllysat mithilfe eines Affinitätsharzes gereinigt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigten Proteine vom Affinitätsharz zu eluieren, um sie weiteren Analysen oder nachgeschalteten Anwendungen zuzuführen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Proteinreinigungsmodifikationen und -interaktionen anhand einer Western-Blot-Analyse zeigen.Den Ablauf demonstriert Eva Ky, eine Absolventin der William and Mary, die die letzten Jahre als Doktorandin in meinem Labor tätig war. Der Hauptvorteil der Perlen-basierten Zelllyse gegenüber anderen etablierten Methoden liegt in der schnellen Aufarbeitung und Lyse mehrerer Proben unter Bedingungen, die Protein-Funk

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

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Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen...

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Hier stellen wir einen Workflow für die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR Heterodimeren in Hefe vor.

Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Herstellung von ganzen Zellextrakten aus Hefe oder anderen Zellen mit hilfe einer kryogenen Gefriermühle, die den Abbau und die Denaturierung von Proteinen minimiert. Die Zellextrakte eignen sich zur Reinigung funktioneller Proteinkomplexe, proteomischer Analysen, Co-Immunpräzipitationsstudien und zum Nachweis von labilen Proteinmodifikationen.

Herstellung von Zellextrakten durch Cryogrinding in einer automatisierten Gefriermühle

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Lernen Sie die effiziente Proteinextraktion aus Bäckerhefe unter Erhaltung nativer Strukturen, Interaktionen und post-translationaler Modifikationen. Diese Methode ermöglicht präzise biochemische Analysen.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen (Video) | JoVE Journal

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

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