Name: Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie genetische Voraussetzungen für Proteinabbau in Saccharomyces cerevisiae durch Wachstumsassays bestimmen und biochemisch mit Western Blot bestätigen. Diese Methode ermöglicht schnelle Hochdurchsatzanalysen.

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Wir bedanken uns bei aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein Labor zur Bereitstellung eines unterstützenden und begeisterten Forschungsumfeld. Wir danken Ryan T. Gibson um Hilfe bei der Protokolloptimierung. Wir danken Markus Hochstrasser (Yale University) und Dieter Wolf (Universität Stuttgart) für Hefestämme und Plasmide. Wir danken unseren anonymen Gutachtern für ihre Hilfe bei der Verbesserung der Klarheit und Nützlichkeit dieses Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem Forschungspreis der Ball State University Kapitel der Sigma Xi zu SGW unterstützt, ein National Institutes of Health Zuschuss (R15 GM111713) zu EMR, ein Ball State University ASPiRE Forschungspreis zur EMR und Mittel aus der Ball State University Provost Büro und Fachbereich Biologie.

1. Hefe-Wachstumstest zur Kandidaten Mutanten Defekte in Proteinabbau identifizieren <ol><li> Transformieren Wildtyp- und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid einen instabilen Protein fusioniert codiert, im Rahmen, mit einem Reporter-Stoffwechselenzym. </li><li> Beimpfen von Transformanten in 5 ml synthetischem definiert (SD) Minimalmedium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert. </li><li> Anschließend wird die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von jeder Übernachtkultur. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen in Kultur in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein, sollte aber eine minimale OD 600 von 0,2 erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. </li><li> Bereiten sechsfache serielle Verdünnungen von transformierten Hefezellen in einem sterilen 96-Well-Platte, beginnend mit den Zellen, um eine verdünnten OD 600 von 0,2. Platzieren jedes Hefetransformante in einer anderen Reihe in der Platte mit 96 Vertiefungen untersucht werden. <ol><li> Für jede Transformante, die Berechnung des Volumens der Übernacht-Kultur erforderlich ist, um Zellen zu einer OD 600 von 0,2 in einem Endvolumen von 200 ul verdünnt. Fügen Sie diese Volumen von Übernacht-Kultur, um die entsprechende Vertiefung in Spalte 1. Fügen Sie die entsprechende Menge an sterilem Wasser, um das Volumen auf 200 ul zu bringen. </li><li> Für jede Reihe von Hefe, fügen 125 ul sterilem Wasser, um die Vertiefungen in den Spalten 2, 3 und 4. HINWEIS: Einzeln verpackte sterile 96-Well-Platten mit einer sterilen Deckeln verpackt werden. Der Deckel kann als Reservoir für das sterile Wasser, das in dieser Stufe verteilt werden. Dies ermöglicht die gleichzeitige Übertragung von sterilem Wasser zu allen Vertiefungen in einer bestimmten Spalte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Mischen Sie den Inhalt der ersten Spalte (Hefe zu einer OD 600 von 0,2 verdünnt) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Transfer 25 ul Hefe aus Spalte 1 bis Spalte 2, mit einer Mehrkanalpipette. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Transfer 25 ul aus Spalte 2 bis Spalte 3, und 25 ul aus Spalte 3 bis Spalte 4 (gut mischen bei jedem Schritt). </li></ol></li><li> Mischen Sie jede Probe mit einer Mehrkanalpipette. Ausgehend von den meisten verdünnten in wenigstens verdünnte Spalten von Hefe, einer Pipette 4 ul jeder Probe auf beiden Platten, die den entsprechenden Selektionsmedium. Verwenden Sie eine Platte mit Medium, das Plasmid-Selektion (diese Platte dient als Hefe-Spotting und Wachstumskontrolle) unterhält. Verwenden einer zweiten Platte mit Medium, das für die Erhaltung des Plasmids und Expression des instabilen Protein an das Reporterenzym fusioniert auswählt. Da Hefe begleichen schnell, mischen Zellen durch Auf- und Abpipettieren in regelmäßigen Abständen. HINWEIS: Trockenplatten werden leichter absorbiert Flüssigkeit als frisch zubereiteten Platten und sind daher für diese Versuche zu empfehlen. Feuchten Platten können durch Inkubation bei Raumtemperatur in lo trocknendenw Luftfeuchtigkeit für 1 - 2 Tage oder kürzer Inkubationen in einer Haube mit laminarer Strömung. Platten können ungleichmäßig trocknen, wenn sich die laminare Luftströmung parallel zu der Bank. Verwendung einer Schablone erleichtert die Hefezellen in regelmäßigen Abständen zu erkennen. Zwei Mustervorlagen sind in Figur 1 zur Verfügung gestellt. Diese können gedruckt werden, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. </li><li> Lassen Platten auf der Bank oben trocknen. </li><li> Inkubation erfolgt bei 30 ° C für 2 - 6 Tagen haben. </li><li> Fotografieren Sie jede Platte nach Inkubation. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Abbildung 1. Vorlagen für das Auffinden Hefezellen auf 100-mm-Agar-Platten. Diese Vorlagen können verwendet werden, um zu ermöglichen Spotting Hefe in regelmäßigen Abständen mit einem Mehrkanalpipette werden. Templates können ausgedruckt, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. Zeigen Petrischale mit WachstumMedium im Deckel mit Schablone angebracht. Vorlagen werden mit einer Einkerbung markiert, um Orientierung zu verfolgen. Es wird empfohlen, dass die Platten in Wachstumsassays verwendet in ähnlicher Weise mit einer Kerbe markiert werden, um die Orientierung zu verfolgen. Vorlagen für die Erkennung von vier (A) oder fünf (B) Reihenverdünnungen von Hefezellen zur Verfügung gestellt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine druckfähige Version dieser Figur mit 100-mm-Vorlagen zu sehen.</a> 2. Biochemische Bestätigung des Hefe-Wachstumstest <ol><li> Das Wachstum der Hefezellen und Post-Alkaline Proteinextraktion (von 31 modifiziert) <ol><li> Transform-Wildtyp und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid der instabilen Protein kodiert. </li><li> Beimpfen von Transformanten in 5 ml SD-Medium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert. </li><li> Messen Sie die OD600 von jeder Nacht culture. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen entweder in logarithmische oder stationäre Wachstumsphase sein, sollte aber eine OD 600 die Verdünnung bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frisches Selektivmedium (Schritt 2.1.4) erlauben wird erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. </li><li> Verdünne Hefezellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frischem selektivem Medium. </li><li> Weiter zu den Zellen bei 30 ° C inkubieren, Drehen oder Schütteln, bis Kulturen erreichen einer OD 600 zwischen 0,8 und 1,2 (dh sind Mitte logarithmischen Wachstums). Hinweis: Wenn der instabile Protein von Interesse unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, kann die optimale Zeitsteuerung der Induktion der Proteinexpression und der Zellgewinnung nach den vorherigen Studien oder empirischen Beobachtungen variieren. </li><li> Sammeln 2,5 OD 600 Einheiten der Kultur in 15 ml konischenal Rohr durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. Hinweis: eine OD600-Einheit wird als die Menge der vorhandenen Hefe von 1 ml der Kultur bei einer OD 600 von 1,0 definiert. V = 2,5 OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich, um 2,5 OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden </li><li> Zellen in 1 ml destilliertem Wasser. Übertragen suspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr. </li><li> Pelle Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 xg für 30 sec bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Zellen in 100 ul destilliertem Wasser durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung, und fügen Sie 100 ul 0,2 M NaOH. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Proben für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 x (von denen die meisten noch nicht veröffentlicht Proteine ​​und sind noch lebensfähig)g für 5 min. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Pellet in 50 bis 100 ul 1x Laemmli-Probenpuffer, die Zellen zu lysieren wird, durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbeln. HINWEIS: Die Entfernung des Alkaliüberstand nach Zentrifugation und anschließende Resuspension der Zellen in Laemmli-Probenpuffer extrahiert Proteine ​​bei einem pH-Wert mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kompatibel mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem und Western Blotting. </li><li> Um vollständig zu denaturieren, Inkubation Lysate bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Aggregation neigende Proteine ​​(zB Proteine ​​mit mehreren Transmembransegmente) können unlöslich werden, wenn sie bei 95 ° C inkubiert. Daher sollte Lysate bei niedrigeren Temperaturen inkubiert werden (zB 37 ° C - 70 ° C) für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt, für die Analyse von solchen Proteinen. </li><li> Kühle Lysaten durch Anordnen auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifuge Lysate bei 18000 g für 1 min bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletisieren. Trennen Sie den Überstand (in Lösung extrahierte Protein) durch SDS-PAGE vor der anschließenden Western Blot-Analyse (Abschnitt 2.2). Alternativ Shop Lysate bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Vertreter Western Blot Protokoll <ol><li> Laden empirisch ermittelten Volumen Lysate in einem SDS-PAGE-Gel. </li><li> Führen Gel bei 200 V, bis Farbstofffront den Boden des Gels erreichte. </li><li> Transferproteine ​​aus Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C. </li><li> Block Membran durch Inkubation in 5% Magermilch in Tris-gepufferter Saline (TBS), schaukeln, für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Blockierungslösung. </li><li> Dazu werden die Membranen mit primärem Antikörper, der für das Protein von Interesse (oder Epitoptag davon) in 1% Magermilch in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) für 1 h bei Raum temperatur, schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. Hinweis: Da Fluorophore sind lichtempfindlich, sollte Verdünnungen fluorophorkonjugierten Antikörper im Dunkeln hergestellt werden. Zusätzlich sollte die Inkubation von Membranen in Gegenwart von fluorophorkonjugierten Antikörpern in lichtundurchlässigen Behältern auftreten. Dies kann durch Umwickeln Inkubationsschalen in Aluminiumfolie durchgeführt werden. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Nach Abbilden Membran inkubieren der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für einen Lasting Kontrollprotein in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellte Methode erlaubt die schnelle Bestimmung und biochemischen Bestätigung genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau in Hefezellen. Diese Experimente unterstreichen den Nutzen und die Kraft der Hefe als Modell eukaryotischen Organismus (mehrere ausgezeichnete Bewertungen von Hefe Biologie und Zusammenstellungen von Protokollen für die Handhabung, Speicherung und Manipulation von Hefezellen (zB 41 bis 44) sind für die Ermittler neue für den Organismus verfügbar). Die Techniken kö...

Selektive Proteinabbau ist für eukaryontische Leben und veränderten Proteinabbau trägt zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich verschiedene Arten von Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislaufkrankheiten und Mukoviszidose 1-5. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die selektive Proteinabbau katalysiert, ist eine aufstrebende therapeutisches Ziel für diesen Bedingungen 10.6. Ubiquitin-Ligase kovalent an Polymere der 76-Aminosäure-Ubiquitin an Proteine ​​11. Proteine, die mit Polyubiquitinketten markiert wurden, werden erkannt und durch die ~ 2,5 Megadalton 26S Proteasom proteolysiert 12. Studien im Modell eukaryotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) initiiert wurden grund bei der Aufklärung von Proteinabbaumechanismen in eukaryotischen Zellen. Der erste Beweis physiologischen Substrat der USV war die Hefe Transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, und viele hoch konservierte Komponenten des UPS wurden zuerst identifiziert oder gekennzeichnet Hefe (zB 15-26). Entdeckungen in diesem vielseitigen und genetisch manipulierbaren Modellorganismus hergestellt werden wahrscheinlich weiterhin wichtige Einblicke in konservierten Mechanismen des Ubiquitin-vermittelten Abbau liefern. Anerkennung und Abbau der meisten UPS Substrate erfordern die konzertierte Aktion von mehreren Proteinen. Daher ist ein wichtiges Ziel bei der Charakterisierung des geregelten Abbau einer bestimmten instabilen Protein die genetischen Erfordernisse für die Proteolyse zu bestimmen. Klassische Ansätze (zB Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Experimente 27) zur Überwachung der Proteinabbau in Säugetier- oder Hefezellen sind mühsam und zeitaufwendig. Während diese Art von Methode bereitzustellen hochempfindliche Einrichtung zum Erfassen des Proteinabbaus für eine schnelle Analyse des Proteinabbaus oder Groß screeni sind sie nichtng für Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay zur schnellen Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Abbau von instabilen Proteinen präsentiert. Im Hefewachstum basiertes Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau, ein instabiles Protein von Interesse (oder Abbausignals) fusioniert, im Rahmen, ein Protein, das für das Wachstum der Hefe unter bestimmten Umständen erforderlich ist. Das Ergebnis ist ein künstliches Substrat, das als ein mächtiges Werkzeug, um die genetischen Voraussetzungen des Proteinabbaus der instabilen Protein von Interesse festzustellen, dienen können. Zweckmßigerweise beherbergen am häufigsten verwendeten Labor Hefestämme eine Gruppe von Mutationen in Genen, die Stoffwechselenzyme in der Biosynthese von bestimmten Aminosäuren oder stickstoffhaltigen Basen (zB 20,28-30) beteiligt kodiert. Diese Enzyme sind für die zelluläre Proliferation in Abwesenheit von exogen bereitgestellt Metaboliten in deren Synthese der Enzyme beteiligt. Sometabolische Enzyme können so als Wachstumsbasis Reporter für den Abbau von instabilen Proteinen, denen sie fusioniert sind. Die genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau kann leicht erklärt werden, da Mutationen, die Proteolyse zu verhindern, können Zellen, die das Abbau Reporter, unter selektiven Bedingungen wachsen. Einen Wachstumsvorteil ist ein indirekter Hinweis auf eine bestimmte Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Allerdings ist direkte biochemische Analyse erforderlich, um zu bestätigen, dass eine Mutation ermöglicht Wachstum durch erhöhte Protein-Ebene und nicht durch indirekte oder Artefakt Ursachen. Die Wirkung einer Mutation auf Proteinmenge kann durch Western-Blot-Analyse der Steady-State-Protein-Spiegel in den Zellen, und tun nicht die bestimmte Mutation beherbergen bestätigt werden. Ein Verfahren für die schnelle und effiziente Gewinnung von Hefeproteinen (sequentielle Inkubation der Hefezellen mit Natriumhydroxid und Probenpuffer) in einer geeigneten Formfür die Analyse durch Western-Blot wird ebenfalls vorgestellt 31. Zusammen stellen diese Experimente ermöglichen die schnelle Identifizierung von Kandidatenregulatoren der Proteinabbau.

<table><tbody><tr><td>Gewünschte Hefestämme, Plasmide, Standardmedium und Pufferkomponenten</td><td></td><td></td><td>Hefestämme mit gewünschten Mutationen können im Labor des Prüfarztes erzeugt werden. Wildtyp-Hefe und eine Vielzahl von Mutanten sind ebenfalls kommerziell erhältlich (z. B. von GE Healthcare). Plasmide, die für Fusionsproteine kodieren, können im Labor des Forschers erzeugt werden.</td></tr><tr><td>3-Amino-1H-1,2,4-triazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Kompetitiver Inhibitor des His3-Enzyms. Kann in Medium eingeschlossen werden, um die Stringenz des Wachstumsassays unter Verwendung von His3-Reporterkonstrukten zu erhöhen.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (rekombinante Form aus Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>Kann zur Bestimmung der N-Glykosylierung von Proteinen verwendet werden; kompatibel mit den SDS- und Beta-Mercaptoethanol-Konzentrationen, die in 1x Laemmli-Probenpuffer gefunden werden.</td></tr><tr><td>Einweg-Borosilikatglas-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>Temperaturgeregelter Inkubator (z.B. Heratherm Inkubator Modell IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>New Brunswick Austauschbare Trommel für 18 mm Röhrchen (Rohrrolle)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Die Röhrchenwalze wird empfohlen, um Hefestarterkulturen von Hefezellen über Nacht in Suspension zu halten. Ein Plattformschüttler oder eine Röhrchenrolle kann verwendet werden, um größere Kulturen in Suspension zu halten.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Zur Verwendung mit der Röhrenrolle</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>Sterile 96-Well-Mikrotestplatten mit flachem Boden und Deckel, einzeln verpackt</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & My; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Einkanal- und Mehrkanalpipetten werden in verschiedenen Phasen des Protokolls eingesetzt. Während Mehrkanalpipetten die Pipettierbelastung in mehreren Schritten reduzieren, können Einkanalpipetten über das gesamte Protokoll hinweg verwendet werden. Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern.</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor, der mit einer Einheit verkauft wird, die 1,5 und 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen fasst. Der Rotor kann gegen einen Rotor ausgetauscht werden, der konische Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 ml und 50 ml aufnehmen kann.</td></tr><tr><td>Platten-Bildgebungssystem (z. B. Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Eine Vielzahl von Systemen kann zur Abbildung von Platten verwendet werden, einschließlich hochentwickelter Bildgebungssysteme, Computerscanner und Kamerahandys.</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor F-35-6-30 mit Deckel und Adaptern für Zentrifuge Modell 5430/R, 15/50 ml konische Röhrchen, 6-fach</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Siebdruck-Schraubverschlussröhrchen 17 x 20 mm konisch, Polypropylen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>1,5 ml Flex-Tube, PCR clean, Natural Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Hersteller</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Das Siedewasserbad mit Heizplatte kann auch zur Denaturierung von Proteinen verwendet werden</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Lauf- und Übertragungsgeräte, Netzteile und bildgebende Geräte oder Dunkelkammern für SDS-PAGE und Übertragung auf die Membran</td><td></td><td></td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Western-Blot-Bildgebungssystem (z. B. Li-Cor Odyssey CLx Scanner und Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF-Transfermembranen</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper (z. B. Monoklonaler Antikörper Phosphoglyceratkinase (Pgk1), Maus (Klon 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper (z. B. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr></tbody></table>

growth-basierte bestimmung und biochemische bestätigung der genetischen voraussetzungen für proteinabbau in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Geregelten Proteinabbau ist entscheidend für praktisch jede Zellfunktion. Vieles von dem, was über die molekularen Mechanismen und genetischen Erfordernisse für eukaryotische Proteinabbau bekannt wurde zunächst in Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Klassische Analysen der Proteinabbau haben biochemische Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Methoden verlassen. Während diese Techniken empfindliche Mittel zur Beobachtung des Proteinabbaus sind mühsam, zeitaufwendig und niedrigem Durchsatz. Diese Ansätze sind nicht geeignet, um eine schnelle und großflächige Screening auf Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay für die leichte Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau beschrieben. In diesem Test wird ein Reporterenzym für das Wachstum unter bestimmten Selektionsbedingungen erforderlich, um ein instabiles Protein fusioniert ist. Zellen, denen das endogene Reporter-Enzym exprimieren, aber das Fusionsprotein unter sele wachsenctive Bedingungen nur, wenn das Fusionsprotein stabilisiert ist (dh, wenn der Proteinabbau gefährdet ist). Bei dem hier beschriebenen Wachstumstest werden Verdünnungsreihen von Wildtyp und mutierten Hefezellen ein Plasmid ein Fusionsprotein kodiert, auf selektiven und nicht-selektiven Medium entdeckt. Wachstum unter selektiven Bedingungen entspricht Abbau Beeinträchtigung von einer bestimmten Mutation. Erhöhte Proteinmenge sollte biochemisch bestätigt werden. Ein Verfahren zur schnellen Extraktion von Hefe-Proteinen in einer für die Elektrophorese und Western-Blotting Form wird auch gezeigt. Ein Wachstum basierende Auslesen für die Proteinstabilität, kombiniert mit einer einfachen Protokoll für die Proteinextraktion zur biochemischen Analyse, erleichtert die schnelle Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau. Diese Techniken können angepaßt, um den Abbau einer Vielzahl von kurzlebigen Proteinen zu überwachen. In dem dargestellten Beispiel des HIS3-Enzym, das für die Biosynthese von Histidin erforderlich ist, fusioniertum deg1 -Sec62. deg1 -Sec62 ist für den Abbau gezielt nach der aberrant die Endoplasmatischen Retikulum Translokon einrastet. Zellen, die deg1 -Sec62-His3 konnten unter selektiven Bedingungen wachsen, wenn das Protein stabilisiert wurde.

Diese Methodik zu veranschaulichen, hat das HIS3-Enzyms zu dem Carboxy-Terminus des Modells endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierte Abbau fusioniert (ERAD) -Substrat deg1 -Sec62 (2A) zu deg1 -Sec62-His3 schaffen (Figur 3) . deg1 -Sec62 eine Gründungsmitglied einer neuen Klasse von ERAD Substrate, die folgenden persistenten, anomale Verbindung mit dem Translokon ausgerichtet sind, wird der Kanal in erster Linie für die Bewegung Proteine ​​durch die ER-Memb...

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, schnell die genetischen Voraussetzungen für den Abbau eines instabilen Proteins in Croce Visier zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein Reporterenzym, das für das Wachstum unter bestimmten selektiven Bedingungen erforderlich ist, mit einem instabilen Protein von Interesse fusioniert wird. Als nächstes werden Wildtyp- oder mutierte Zellen, die beide das Fusionsprotein exprimieren, auf selektiven Agarplatten kultiviert.Der Plattierungsassay bietet einen geeigneten Indikator für die Proteinstabilisierung auf der Grundlage des Wachstums von Hefezellen, um biochemisch bestätigte Unterschiede in der Proteinhäufigkeit während des Typs in mutierten Zellen, die das Fusionsprotein beherbergen, über eine schnelle, ineffiziente Proteinextraktionsmethode für die Western-Blot-Analyse lysiert zu werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Häufigkeit eines instabilen Proteins in Zellen mit einer Mutation in einem Gen erhöht ist, das für den Abbau erforderlich ist. Das Gegenteil gilt für abbaukompetente Wildtyp-Stämme.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Puls-Chase- und Cycl-Heide-Chase-Analysen besteht darin, dass sie weniger arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist und eine schnelle und hohe Durchsatzbestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau ermöglicht. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Abbauanforderungen für eine Reihe von instabilen Proteinen geben. Es kann auch verwendet werden, um Regulatoren für andere Aspekte der Genexpression wie Transkription und Translation zu identifizieren.Die Verfahren werden von Sheldon Watts und Justin Crowder vorgeführt. Studenten in meinem Labor: Vor dem Assay transformieren sie ein Plasmid, das für ein Fusionsprotein kodiert, das aus einem instabilen Protein und einem metabolischen Reporterenzym besteht, in einen mutierten Hefestamm. Bei Verdacht auf genetische Defekte, die mit der Regulation des Proteinabbaus als Kontrolle zusammenhängen, wird das gleiche Plasmid auch in einen Wildtyp-Hefestamm umgewandelt.Impfen Sie die Transformanten in fünf Milliliter minimalem Medium, das für Zellen selektiert und die Plasmidmoleküle beherbergt. Setzen Sie das Reagenzglas in einen Schrägrotator ein und inkubieren Sie es am nächsten Tag über Nacht bei 30 Grad Celsius. Messen Sie die optische Dichte der Übernachtkulturen und gleichen Sie dann die Zellkonzentration für alle Zellen aus, indem Sie jede Kultur mit frischen Medien und sterilen einzelnen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf einen OD 600 von 0,2 verdünnen.Zu Beginn des Hauptassays richten Sie eine sechsfache Verdünnungsreihenmatrix ein, indem Sie zunächst 200 Mikroliter jedes vorverdünnten Stammes, ausgehend von einem OD 600 von 0,2, in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der ersten Säule einer sterilen 96-Well-Platte übertragen, um die nachfolgenden Verdünnungen vorzubereiten, und mit einer Mehrkanalpipette 125 Mikroliter steriles Wasser in die leeren Vertiefungen in der zweiten Säule geben. drei und vier. Übertragen Sie als Nächstes 25 Mikroliter Hefe von Spalte eins in Spalte zwei, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Zellen gleichmäßig zu mischen, und fahren Sie mit dem Transfer von 25 Mikrolitern Zellen von Spalte zwei in Spalte drei fort. Wiederholen Sie die seriellen Verdünnungsschritte, bis die Vertiefungen in Spalte vier gut durchmischt sind, um die Zellfleckung zu erleichtern.Drucken Sie eine Gitterschablone aus und kleben Sie sie auf die Innenseite eines Petrischalendeckels, beginnend mit der am wenigsten konzentrierten Säule in der seriellen Verdünnungsmatrix. Übertragen Sie vier Mikroliter Zellen aus jeder Säule. Auf der 96-Well-Platte auf eine Kontroll-Minimalmedium-Agarplatte, die für die intrazelluläre Plasmiderhaltung selektiert. Platzieren Sie weitere vier Mikroliter Zellen aus jeder Säule auf eine separate, minimale Agarplatte, die für beide intrazellulären Plasmide selektiert.Aufrechterhaltung und Expression des instabilen Fusionsproteins. Lassen Sie beide Platten fünf bis 10 Minuten auf der Bank trocknen. Verschließen Sie die Deckel mit Param, um eine Austrocknung zu verhindern, und inkubieren Sie die Zellen zwei bis sechs Tage lang bei 30 Grad Celsius.Wenn Völker aus der am schnellsten wachsenden Kultur zum ersten Mal an der am dünnsten verdünnten Stelle auf einer bestimmten Platte sichtbar werden, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und dokumentieren Sie das Ausmaß des Wachstums. Beim Fotografieren kann es erforderlich sein, verschiedene Platten an verschiedenen Tagen oder dieselbe Platte an mehreren Tagen zu fotografieren. Im Falle verschiedener Hefestämme, die eine breite Palette von Wachstumsraten aufweisen, also biochemisch bestätigt, dass ein im Wachstumsassay identifiziertes Gen die Proteinhäufigkeit reguliert, beginnen Sie mit der Transformation von Wildtyp- und mutierten Hefestämmen mit einem Plasmid, das für das oben genannte Fusionsprotein kodiert, inokulieren Sie die Transformanten in fünf Millilitern minimalem Medium, das für die intrazelluläre Plasmiderhaltung selektiert, und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht in einem 30 Grad Celsius geneigten Rotator.Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte bei 600 jeder Übernachtkultur. Sobald alle Stämme einen OD 600 von 0,4 oder mehr erreicht haben, verdünnen Sie alle Kulturen wieder auf 0,2 mit frischem Medium, so dass das endgültige Volumen für jeden Stamm 10 Milliliter beträgt. Inkubieren Sie die Zellen auf einem 30 Grad Celsius heißen Plattformschüttler, bis alle Kulturen ein Wachstum OD 600 in der mittleren logaritmischen Phase zwischen 0,8 und 1,2 erreichen.Ernten Sie eine Zelle, indem Sie insgesamt 2,5 OD-Einheiten von Zellen in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der S-Überstand entfernt. Fügen Sie dann einen Milliliter destilliertes Wasser hinzu, wirbeln Sie oder pipettieren Sie auf und ab, um den Gaumen wieder zu suspendieren, und geben Sie die Zellsuspension in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen.Isolieren Sie die Zellen mit der zweiten Zentrifugation für 30 Sekunden Entfernen Sie bei Raumtemperatur die Schlinge und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser. Geben Sie 100 Mikroliter 0,2 molares Natriumhydroxid in die Zellsuspension, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Proben zu mischen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, um eine vorzeitige Zelllyse zu vermeiden. Verwirbeln Sie die Zellen nicht.Isolieren Sie die Zellen erneut mit einer dritten Zentrifugation für 30 Sekunden. Entfernen Sie bei Raumtemperatur die Überstände aus den Zellen und lysieren Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 50 bis 100 Mikrolitern eines x lamby Probenpuffers reanimieren, denaturieren Sie alle Proteine, indem Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubieren und dann das gesamte Zelllysat fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Um die Häufigkeit von aggregationsanfälligen Proteinen wie Proteinen mit mehreren Transmembransegmenten empirisch zu bestimmen, bestimmen Sie empirisch die optimale denaturierende Inkubation, Temperatur und Zeit, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten anstelle von 95 Grad Celsius für fünf Minuten beginnen.Zum Schluss isolieren Sie die lösliche Fraktion, indem Sie das Lysat eine Minute lang bei Raumtemperatur zentrifugieren, das Snat in ein frisches Röhrchen überführen und die unlösliche Pelletfraktion verwerfen. Die lösliche Fraktion kann nun direkt auf eine SDS-Seite, ein Gel geladen oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, um einen auf Hefewachstum basierenden Proteinabbau-Assay einzurichten. Ein instabiles Triple-Fusionsprotein wird mit einem zusätzlichen Stoffwechselenzym fusioniert, das den Hintergrund eines Hefestamms ergänzt, dem das gleiche Stoffwechselgen fehlt.Wenn das Fusionsprotein in Hefe exprimiert wird, ist es anfällig für unfruchtbare Translokationsereignisse an der endoplasmatischen Retikulummembran. Diese aberrante Translokation löst den Ubiquitin-vermittelten Abbau des gesamten Proteins, einschließlich des metabolischen Enzyms, aus und verhindert so die Zellproliferation. In Hefestämmen, denen die Ubiquitin-Ligase fehlt, ist das Fusionsprotein jedoch vor dem Abbau geschützt, selbst bei durchschnittlicher Translokation, wodurch sich die Zellen vermehren können.Daher besteht in Gegenwart von Ubiquitin-Ligase eine Korrelation zwischen dem Proteinabbau in den Zellen und dem Versagen von Hefezellen, sich auf Metaboliten-abgereicherten Agarplatten zu vermehren. Andererseits deutet die Zellproliferation im Zusammenhang mit einem defekten oder fehlenden Ubiquitin darauf hin, dass das Fusionsprotein vor dem Abbau geschützt wurde, um das Hintergrund- oder Fehlwachstum zu reduzieren und die Stringenz dieses Assays zu erhöhen. Kompetitive Inhibitoren des metabolischen Enzyms können dem Wachstumsmedium zugesetzt werden, um die im Hefewachstumsassay beobachteten Ergebnisse zu bestätigen.Ein direkter Nachweis des Abbaus von Fusionsproteinen kann auch mit einem Western Blot erbracht werden. In Gegenwart oder Abwesenheit von Ubiquitin-Ligase wird das Fusionsprotein abgebaut bzw. von der Zerstörung verschont. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Verfahren am direktesten über die Steady-State-Häufigkeit des interessierenden Proteins berichten.Nachdem diese Verfahren durchgeführt wurden, können Puls- oder Cycloheximid-Chase-Analysen durchgeführt werden, um die Kinetik des Proteinabbaus und das Vorhandensein von Mutationen, die die Proteinspiegel im Studienzustand erhöhen, direkt zu analysieren.

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