Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, schnell die genetischen Voraussetzungen für den Abbau eines instabilen Proteins in Croce Visier zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein Reporterenzym, das für das Wachstum unter bestimmten selektiven Bedingungen erforderlich ist, mit einem instabilen Protein von Interesse fusioniert wird. Als nächstes werden Wildtyp- oder mutierte Zellen, die beide das Fusionsprotein exprimieren, auf selektiven Agarplatten kultiviert.

Der Plattierungsassay bietet einen geeigneten Indikator für die Proteinstabilisierung auf der Grundlage des Wachstums von Hefezellen, um biochemisch bestätigte Unterschiede in der Proteinhäufigkeit während des Typs in mutierten Zellen, die das Fusionsprotein beherbergen, über eine schnelle, ineffiziente Proteinextraktionsmethode für die Western-Blot-Analyse lysiert zu werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Häufigkeit eines instabilen Proteins in Zellen mit einer Mutation in einem Gen erhöht ist, das für den Abbau erforderlich ist. Das Gegenteil gilt für abbaukompetente Wildtyp-Stämme.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Puls-Chase- und Cycl-Heide-Chase-Analysen besteht darin, dass sie weniger arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist und eine schnelle und hohe Durchsatzbestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau ermöglicht. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Abbauanforderungen für eine Reihe von instabilen Proteinen geben. Es kann auch verwendet werden, um Regulatoren für andere Aspekte der Genexpression wie Transkription und Translation zu identifizieren.

Die Verfahren werden von Sheldon Watts und Justin Crowder vorgeführt. Studenten in meinem Labor: Vor dem Assay transformieren sie ein Plasmid, das für ein Fusionsprotein kodiert, das aus einem instabilen Protein und einem metabolischen Reporterenzym besteht, in einen mutierten Hefestamm. Bei Verdacht auf genetische Defekte, die mit der Regulation des Proteinabbaus als Kontrolle zusammenhängen, wird das gleiche Plasmid auch in einen Wildtyp-Hefestamm umgewandelt.

Impfen Sie die Transformanten in fünf Milliliter minimalem Medium, das für Zellen selektiert und die Plasmidmoleküle beherbergt. Setzen Sie das Reagenzglas in einen Schrägrotator ein und inkubieren Sie es am nächsten Tag über Nacht bei 30 Grad Celsius. Messen Sie die optische Dichte der Übernachtkulturen und gleichen Sie dann die Zellkonzentration für alle Zellen aus, indem Sie jede Kultur mit frischen Medien und sterilen einzelnen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf einen OD 600 von 0,2 verdünnen.

Zu Beginn des Hauptassays richten Sie eine sechsfache Verdünnungsreihenmatrix ein, indem Sie zunächst 200 Mikroliter jedes vorverdünnten Stammes, ausgehend von einem OD 600 von 0,2, in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der ersten Säule einer sterilen 96-Well-Platte übertragen, um die nachfolgenden Verdünnungen vorzubereiten, und mit einer Mehrkanalpipette 125 Mikroliter steriles Wasser in die leeren Vertiefungen in der zweiten Säule geben. drei und vier. Übertragen Sie als Nächstes 25 Mikroliter Hefe von Spalte eins in Spalte zwei, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Zellen gleichmäßig zu mischen, und fahren Sie mit dem Transfer von 25 Mikrolitern Zellen von Spalte zwei in Spalte drei fort. Wiederholen Sie die seriellen Verdünnungsschritte, bis die Vertiefungen in Spalte vier gut durchmischt sind, um die Zellfleckung

Drucken Sie eine Gitterschablone aus und kleben Sie sie auf die Innenseite eines Petrischalendeckels, beginnend mit der am wenigsten konzentrierten Säule in der seriellen Verdünnungsmatrix. Übertragen Sie vier Mikroliter Zellen aus jeder Säule. Auf der 96-Well-Platte auf eine Kontroll-Minimalmedium-Agarplatte, die für die intrazelluläre Plasmiderhaltung selektiert. Platzieren Sie weitere vier Mikroliter Zellen aus jeder Säule auf eine separate, minimale Agarplatte, die für beide intrazellulären Plasmide selektiert.

Aufrechterhaltung und Expression des instabilen Fusionsproteins. Lassen Sie beide Platten fünf bis 10 Minuten auf der Bank trocknen. Verschließen Sie die Deckel mit Param, um eine Austrocknung zu verhindern, und inkubieren Sie die Zellen zwei bis sechs Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Wenn Völker aus der am schnellsten wachsenden Kultur zum ersten Mal an der am dünnsten verdünnten Stelle auf einer bestimmten Platte sichtbar werden, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und dokumentieren Sie das Ausmaß des Wachstums. Beim Fotografieren kann es erforderlich sein, verschiedene Platten an verschiedenen Tagen oder dieselbe Platte an mehreren Tagen zu fotografieren. Im Falle verschiedener Hefestämme, die eine breite Palette von Wachstumsraten aufweisen, also biochemisch bestätigt, dass ein im Wachstumsassay identifiziertes Gen die Proteinhäufigkeit reguliert, beginnen Sie mit der Transformation von Wildtyp- und mutierten Hefestämmen mit einem Plasmid, das für das oben genannte Fusionsprotein kodiert, inokulieren Sie die Transformanten in fünf Millilitern minimalem Medium, das für die intrazelluläre Plasmiderhaltung selektiert, und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht in einem 30 Grad Celsius geneigten Rotator.

Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte bei 600 jeder Übernachtkultur. Sobald alle Stämme einen OD 600 von 0,4 oder mehr erreicht haben, verdünnen Sie alle Kulturen wieder auf 0,2 mit frischem Medium, so dass das endgültige Volumen für jeden Stamm 10 Milliliter beträgt. Inkubieren Sie die Zellen auf einem 30 Grad Celsius heißen Plattformschüttler, bis alle Kulturen ein Wachstum OD 600 in der mittleren logaritmischen Phase zwischen 0,8 und 1,2 erreichen.

Ernten Sie eine Zelle, indem Sie insgesamt 2,5 OD-Einheiten von Zellen in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der S-Überstand entfernt. Fügen Sie dann einen Milliliter destilliertes Wasser hinzu, wirbeln Sie oder pipettieren Sie auf und ab, um den Gaumen wieder zu suspendieren, und geben Sie die Zellsuspension in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Isolieren Sie die Zellen mit der zweiten Zentrifugation für 30 Sekunden Entfernen Sie bei Raumtemperatur die Schlinge und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser. Geben Sie 100 Mikroliter 0,2 molares Natriumhydroxid in die Zellsuspension, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um die Proben zu mischen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, um eine vorzeitige Zelllyse zu vermeiden. Verwirbeln Sie die Zellen nicht.

Isolieren Sie die Zellen erneut mit einer dritten Zentrifugation für 30 Sekunden. Entfernen Sie bei Raumtemperatur die Überstände aus den Zellen und lysieren Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 50 bis 100 Mikrolitern eines x lamby Probenpuffers reanimieren, denaturieren Sie alle Proteine, indem Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubieren und dann das gesamte Zelllysat fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Um die Häufigkeit von aggregationsanfälligen Proteinen wie Proteinen mit mehreren Transmembransegmenten empirisch zu bestimmen, bestimmen Sie empirisch die optimale denaturierende Inkubation, Temperatur und Zeit, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten anstelle von 95 Grad Celsius für fünf Minuten beginnen.

Zum Schluss isolieren Sie die lösliche Fraktion, indem Sie das Lysat eine Minute lang bei Raumtemperatur zentrifugieren, das Snat in ein frisches Röhrchen überführen und die unlösliche Pelletfraktion verwerfen. Die lösliche Fraktion kann nun direkt auf eine SDS-Seite, ein Gel geladen oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, um einen auf Hefewachstum basierenden Proteinabbau-Assay einzurichten. Ein instabiles Triple-Fusionsprotein wird mit einem zusätzlichen Stoffwechselenzym fusioniert, das den Hintergrund eines Hefestamms ergänzt, dem das gleiche Stoffwechselgen fehlt.

Wenn das Fusionsprotein in Hefe exprimiert wird, ist es anfällig für unfruchtbare Translokationsereignisse an der endoplasmatischen Retikulummembran. Diese aberrante Translokation löst den Ubiquitin-vermittelten Abbau des gesamten Proteins, einschließlich des metabolischen Enzyms, aus und verhindert so die Zellproliferation. In Hefestämmen, denen die Ubiquitin-Ligase fehlt, ist das Fusionsprotein jedoch vor dem Abbau geschützt, selbst bei durchschnittlicher Translokation, wodurch sich die Zellen vermehren können.

Daher besteht in Gegenwart von Ubiquitin-Ligase eine Korrelation zwischen dem Proteinabbau in den Zellen und dem Versagen von Hefezellen, sich auf Metaboliten-abgereicherten Agarplatten zu vermehren. Andererseits deutet die Zellproliferation im Zusammenhang mit einem defekten oder fehlenden Ubiquitin darauf hin, dass das Fusionsprotein vor dem Abbau geschützt wurde, um das Hintergrund- oder Fehlwachstum zu reduzieren und die Stringenz dieses Assays zu erhöhen. Kompetitive Inhibitoren des metabolischen Enzyms können dem Wachstumsmedium zugesetzt werden, um die im Hefewachstumsassay beobachteten Ergebnisse zu bestätigen.

Ein direkter Nachweis des Abbaus von Fusionsproteinen kann auch mit einem Western Blot erbracht werden. In Gegenwart oder Abwesenheit von Ubiquitin-Ligase wird das Fusionsprotein abgebaut bzw. von der Zerstörung verschont. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Verfahren am direktesten über die Steady-State-Häufigkeit des interessierenden Proteins berichten.

Nachdem diese Verfahren durchgeführt wurden, können Puls- oder Cycloheximid-Chase-Analysen durchgeführt werden, um die Kinetik des Proteinabbaus und das Vorhandensein von Mutationen, die die Proteinspiegel im Studienzustand erhöhen, direkt zu analysieren.