Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Dieses Protokoll nutzt einen regulierbaren Promotor, der eine kontrollierte Proteingexpression ermöglicht. In diesem Experiment verwenden wir ein Plasmid mit hohem Kopienzahl-Zwei-Mikrometer-Vektor, der die N-terminale Domäne unter Kontrolle eines methioninreprimierbaren Promotors exprimiert. Wildtyp-Hefezellen werden damit transformiert.

Plasmid und Transformanten werden auf Platten ohne Uol ausgewählt. Nach dem Wachstum über Nacht werden die Zellen in selektivem Medium durch Wachstumsarrest, vermittelt durch kein Cortisol, synchronisiert.

Schließlich wird die Expression dadurch induziert, dass die Zellen während des Zeitverlaufsversuchs in ein Medium überführt werden, das Methionin fehlt. Die Proteinkonzentration wird mittels Western Blotting überwacht und die Entwicklung des morphologischen Phänotyps durch Mikroskopie. Hallo, ich bin Claudia aus der Abteilung für Biowissenschaften der Purdue University.

Ich bin De Bari Muji in der Alar- und I'M-Gruppe sowie im AL-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyps in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im Körperindukt. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die morphologischen und molekularen Aspekte eines Zellteilungsphänotyps zu untersuchen, der nach Überexpression der N2-Domäne des endozytotischen Adapterproteins Absent2 beobachtet wird.

Beginnen wir also. Dieses Protokoll startet mit dem Aufbau eines Hefestamms, der Ihr Protein von Interesse exprimieren soll. In unserem Fall transformierten wir den Wildtyp-Hefestamm W 3 0 3 mit einem Plasmid-DNA-Hochkopf, das nth zwei unter Kontrolle des Methionin-reprimierbaren Promotors enthält; zwei Millimolar Methionin unterdrücken die Aktivität des met 25-Promotors.

Obwohl Medien ohne Methionin eine maximale Expression ermöglichen, wählen Sie sechs Kolonien von einer Platte mit kürzlich transformierten Zellen aus und impfen Sie diese in 50 Milliliter selektivem Medium mit 0,2 Millimolar Methionin in einem Erlenmeyerkolben an. Inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Am folgenden Morgen schätzen Sie die Zelldichte durch Messung der optischen Dichte der Kultur bei 600 Nanometern ab. Überführen Sie die äquivalente Menge von 20 OD bei 600 Nanometern pro Milliliter Zellen in ein steriles Zentrifugenröhrchen und gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Suspendieren Sie die Zellen in YPD-Medium durch Vortexen, um den Zellzyklus zu synchronisieren, und geben Sie Nocodazol auf eine Endkonzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter aus einer Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter in DMSO zu. Inkubieren Sie vier Stunden bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Überprüfen Sie nach vier Stunden den Prozentsatz der Zellen, die in der Mitose arrestiert sind.

Unter dem Mikroskop beobachten und die Anzahl der Zellen mit gleich großen Knospen zählen, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Erst wenn die Arrestierung über 90 % beträgt, die Zellen durch Zentrifugation bei 2200 U/min für fünf Minuten ernten. Nach drei Waschungen mit eiskaltem Wasser das Pellet in selektivem Medium ohne Methionin bei einer Zelldichte von etwa 0,5 OD 600 Nanometer pro Milliliter resuspendieren.

Überführen Sie die Hälfte des Zellvolumens in ein neues steriles Reagenzglas und geben Sie Methionin bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Millimolar hinzu. Dies dient als Kontrolle für Effekte, die auf den Grundniveau der Proteingexpression beruhen. Stellen Sie beide Kulturen zurück in den 30 °C-Inkubator.

Die Zellen werden stündlich über einen Zeitraum von sechs Stunden auf die Entwicklung des Phänotyps analysiert. Übertragen Sie jeweils ein Milliliter Zellsuspension jeder Kultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 70 Mikrolitern Medium. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter Methylenblau aus einer Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter in sterilem Wasser hinzu.

Als Nächstes pipettieren Sie etwa sechs Mikroliter dieser Suspension auf einen sauberen Objektträger und legen ein Deckglas über den Tropfen. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig, um eine dünne, gleichmäßige Zellschicht zwischen den Glasoberflächen zu erzeugen. Teilen Sie das Deckglas in neun Quadranten ein und nehmen Sie drei Bilder pro Quadrant auf.

Die Anzahl der Zellen pro Feld sollte nicht größer als 30 Zellen sein, um eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die das untersuchte Phänotyp zeigen, in diesem Beispiel sind dies Sprosshefezellen mit verlängerten und/oder verketteten Sprossen, die nicht voneinander getrennt werden. Wir zählen außerdem die Anzahl der toten Zellen, die an ihrer blauen Färbung erkannt werden, da der Zellteilungsdefekt nach nth-Induktion auftritt.

Die Überexpression führt zu Zelltod, um phänotypspezifische Defekte zu jedem Zeitpunkt sichtbar zu machen. Entnehmen Sie einen Aliquot von einem Milliliter Kultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern einer Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Calcofluor White in sterilem Wasser und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Färbung mit Calcofluor-Weiß ermöglicht die Visualisierung der Zellwand. Waschen Sie das Pellet dreimal mit jeweils einem Volumen PBS. Wir suspendieren das endgültige Pellet in 100 Mikrolitern PBS.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und nehmen Sie Bilder bei 100-facher Vergrößerung unter Verwendung von UV-Optiken zur Visualisierung der Zellwand auf. Um mit GFP markierte Septine darzustellen, nehmen Sie Bilder unter Verwendung eines FS-E-Filters auf. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Zellen mit Zellwanddefekten und Fehllokalisation von Septinen mithilfe der zuvor gezeigten Methode, indem Sie das Deckglas in neun Quadranten einteilen und drei Bilder pro Quadrant zur Zählung im TimeLapse-Video aufnehmen. Die Mikroskopie einzelner Hefezellen erfordert Agarosebetten mit eingebettetem Medium, um ein Agarosebett herzustellen.

Reinigen Sie zunächst einen Objektträger mit konkaver Vertiefung mit 70 %igem Alkohol und lassen Sie ihn trocknen, während der Objektträger an der Luft trocknet. Kochen Sie 0,06 Gramm Agar in fünf Millilitern selektivem Medium ohne Methionin in einer Mikrowelle, bis sich der Agar schnell vollständig aufgelöst hat. Pipettieren Sie 200 Mikroliter des Agar enthaltenden Mediums auf den Objektträger.

Drücken Sie einen weiteren sauberen Objektträger darauf und drehen Sie ihn um, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Luftblasen darunter eingeschlossen werden. Sobald das Gel erstarrt ist, bewegen Sie den oberen Objektträger gleichmäßig vom Vertiefungsobjektträger weg, wobei deren Oberflächen stets parallel zueinander bleiben müssen. Dadurch wird gewährleistet, dass die Oberfläche des Agarosebetts bündig mit der Oberfläche des Vertiefungsobjektträgers abschließt.

Reinigen Sie den Objektträgerbereich um das Agros-Bett mit einem empfindlichen Tuch. Der Objektträger ist nun nach vier Stunden einsatzbereit. Überführen Sie ein Milliliter Zellen aus der Kultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie durch Zentrifugation.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter frischem selektivem Medium ohne Methionin. Tragen Sie Vaseline an den Rändern des Deckgläschens auf. Geben Sie dann einen Tropfen der Zellsuspension in die Mitte des Agros-Bettes und verteilen Sie ihn gleichmäßig, indem Sie vorsichtig ein Deckgläschen darauf drücken.

Versiegeln Sie die Ränder der Deckglasplatte und fixieren Sie ihre Position, indem Sie die Kanten mit Nagellack umranden. Sobald der Nagellack getrocknet ist, platzieren Sie die Probe auf der beheizten Mikroskopbühne. Wir verwenden ein Zeiss Axio 200 M Mikroskop, ausgestattet mit einer Zeiss Axio camm, MRM monochromen digitalen Kamera, um ein Blickfeld auszuwählen, das nicht mehr als 10 ausreichend voneinander entfernte Zellen enthält, da sich das Feld im Laufe der Zeit füllen wird.

Während sich die Zellen teilen, machen Sie alle fünf Minuten für etwa fünf Stunden ein Bild des Feldes. Um wiederholte Neufokussierungen zu vermeiden, programmieren wir die Bildaufnahmesoftware so, dass sie automatisch mehrere Zack-Bilder zu jedem Zeitpunkt aufnimmt.

Später wird das Bild mit der besten Schärfe für die Zusammenstellung des Films ausgewählt, um eine ausreichende Wärmezufuhr für die Zellen sicherzustellen; zusätzlich zu den beheizten Stagen kann eine externe Wärmequelle verwendet werden, indem das durchgehende weiße Licht des Mikroskops während der gesamten Dauer der Bildaufnahme eingeschaltet bleibt. Die Regression des Phänotyps kann untersucht werden, indem die Bilder mithilfe der Image-J-Software zu einem Film zusammengestellt werden. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Überexpression unseres Proteins der Interesse. Nth zwei.

Zunächst wurde die Proteinexpression von NTH2 untersucht. Während des Zeitverlaufs des Experiments wurden Lysate aus Zellen, die HA-markiertes NTH2 exprimierten, mittels Western Blot unter Verwendung eines monoklonalen Anti-HA-Antikörpers analysiert. Wie die Immunoblot-Analyse zeigt, weisen Zellen, die in Gegenwart von 0,2 Millimolar Methionin gezüchtet wurden, eine minimale Proteinexpression auf. Dagegen zeigen Zellen, die in methioninfreiem Medium kultiviert wurden, im Verlauf des Experiments einen kontinuierlichen Anstieg der S2-Konzentration.

Anschließend wurden Zellen analysiert, die sechs Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von Methionin kultiviert wurden, da eine niedrige Nth2-Konzentration allein nicht ausreicht, um ein Zellteilungs-Phänotyp oder Zelltod hervorzurufen. Ein geringer Prozentsatz der Zellen ist abgestorben, was durch ihre blaue Färbung nach Anfärbung mit Methylenblau angezeigt wird. Ebenso sind die Anzahl der Kerne pro Zelle, die Zellwand- und Septin-Organisation normal, wie erwartet.

Im Gegensatz dazu führt die Überexpression von M zwei zu einem massiven Zellteilungsdefekt und Zelltod, wie durch lange Ketten verbundener, verlängerter Knospen gezeigt wird, die die blaue Färbung behalten, wenn sie mit Methylenblau gefärbt werden. Die meisten phänotypischen Zellen sind mehrkernig, wie durch DPI-Färbung angezeigt. Calcofluor-Weiß-Färbung zeigt Ablagerungen abnormaler Zellwandflecken.

Außerdem ist Septin stark fehllokalisiert und desorganisiert. Die Phänotyp-Quantifizierung in Abhängigkeit von der Zeit ist in diesem Diagramm dargestellt, wobei die offenen Kreise null Millimolar Methionin und die geschlossenen Kreise 0,2 Millimolar Methionin repräsentieren. Wir sehen hier, dass mit zunehmender Nth1-Konzentration in den Zellen im Laufe der Zeit auch der Prozentsatz der Zellen, die den Zellteilungsphänotyp zeigen, ansteigt.

Kontrollzellen, die bei 0,2 Milli Methionin gezüchtet wurden, zeigen, dass die Phänotypentwicklung eine Funktion der erhöhten Proteinkonzentration und nicht der Zellkulturbedingungen ist. Schließlich wird die Phänotypentwicklung nach der Überexpression von nth2 mittels zeitraffender Videomikroskopie erfasst.

Nach vier Stunden der nth zeigen zwei Überexprimionszellen ein mildes morphologisches Zellteilungsphänotyp. Während sich der Film fortsetzt, beobachten wir abnormale und verlängerte Phasen des apikalen Knospungswachstums, die zu sehr langgestreckten Knospen führen. Wir sehen außerdem das Auftreten neuer Knospen, bevor eine Zellteilung stattgefunden hat.

Außerdem wird beobachtet, dass Knospen aus mehreren Bereichen der Mutterzelle hervortreten und einen verzweigten Erscheinungsbild verleihen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Entwicklung eines morphologischen Phänotyps in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration in knospenden Hefezellen charakterisieren und analysieren kann. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Zellen bei den empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu pelletieren, da höhere Geschwindigkeiten die Zellen beschädigen könnten.

Es ist außerdem wichtig, Methylblau und Chlorid erst unmittelbar vor der Bildgebung hinzuzufügen, da sie für Lichtpilzzellen toxisch sind. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.