Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Dieses Protokoll verwendet einen regulierbaren Promotor, der eine kontrollierte Proteinexpression ermöglicht. In diesem Experiment verwenden wir ein zwei Mikrometer hohes Plasmid mit hoher Kopie, das die N zwei Domänen von einem Methionin-repressiblen Promotor exprimiert. Wildtyp-Hefezellen werden damit transformiert.

Plasmid und Transformanten werden auf Platten selektiert, denen uol fehlt. Nach dem Wachstum über Nacht. In selektiven Medien werden die Zellen durch kein Cortisol-vermitteltes Wachstum synchronisiert. Verhaften.

Schließlich wird die Expression induziert, indem Zellen während des Zeitverlaufsexperiments auf Medien ohne Methionin übertragen werden. Die Proteinkonzentration wird durch Western Blotting und die morphologische Phänotypentwicklung durch Mikroskopie überwacht. Hallo, ich bin Claudia vom Department of Biological Sciences der Purdue University.

Ich bin de Bari Muji im Alar und I'M und auch im AL Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse der Entwicklung des morphologischen Phänotyps in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im Körperinduktion. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die morphologischen und molekularen Aspekte eines Zellteilungsphänotyps zu untersuchen, der bei der Überexpression der N-Zwei-Domäne des endozytären adaptiven Proteins ohne zwei beobachtet wird.

Also lasst uns loslegen. Dieses Protokoll beginnt mit der Konstruktion eines Hefestammes, der das gewünschte Protein exprimiert. In unserem Fall haben wir den Wildtyp-Hefestamm W 3 0 3 mit hoher Plasma-DNA, die n-te zwei enthält, transformiert, unter der Kontrolle des Methionin-repressiblen Promotors zwei millimolare Methionin-Methionin-Suppressor-Aktivität von Met 25.

Während Medien ohne Methionin eine maximale Expression ermöglichen, werden sechs Kolonien aus einer Platte mit kürzlich transformierten Zellen entnommen und in 50 Millilitern selektiver Medien mit 0,2 millimolaren Methionin in einem konischen Kolben inokuliert, über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert und am nächsten Morgen bei 200 U/min geschüttelt. Schätzen Sie die Zelldichte, indem Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern messen. Das Äquivalent von 20 OD 600 Nanometern pro Milliliter Zellen wird in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführt und durch Zentrifugation geerntet.

Suspendieren Sie die Zellen wieder in YPD-Medium durch Vortexen, um den Zellzyklus aole auf eine Endkonzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter aus einem Bestand von einem Milligramm pro Milliliter in DMSO zu synchronisieren. Inkubieren Sie vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 200 U/min. Überprüfen Sie nach vier Stunden den Prozentsatz der Zellen, die in der Mitose verhaftet sind.

Indem Sie unter dem Mikroskop betrachten und die Anzahl der Zellen mit gleich großen Knospen zählen, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Nur wenn der Arrest größer als 90 % istErnten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2200 U/min für fünf Minuten. Nach drei Wäschen mit eiskaltem Wasser und Reanimation suspendieren Sie das Pellet in selektiven Medien ohne Methionin bei einer Zelldichte von etwa 0,5 OD 600 Nanometern pro Milliliter.

Übertragen Sie die Hälfte des Zellvolumens in ein neues steriles Röhrchen und fügen Sie Methionin bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Millimolar hinzu. Dies dient als Kontrolle für Effekte aufgrund der basalen Proteinexpression. Bringen Sie beide Kulturen wieder in den 30 Grad Celsius heißen Inkubator.

Die Zellen werden stündlich für jeweils sechs Stunden auf die Entwicklung des Phänotyps analysiert. Übertragen Sie einen Milliliter Zellsuspension jeder Kultur in ein steriles Mikrofuge-Röhrchen und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 70 Mikrolitern Medien. Geben Sie dann 30 Mikroliter Methylenblau aus einer Brühe von einem Milligramm pro Milliliter in steriles Wasser.

Pipettieren Sie anschließend etwa sechs Mikroliter dieser Suspension auf einen sauberen Objektträger und legen Sie einen Deckschirm über den Tropfen. Drücken Sie vorsichtig auf den Deckglas, um eine dünne, gleichmäßige Zellschicht zwischen den Glasoberflächen zu bilden. Teilen Sie den Deckglas in neun Quadranten auf und nehmen Sie drei Bilder pro Quadranten auf.

Die Anzahl der Zellen pro Feld sollte nicht größer als 30 Zellen sein, um eine genaue Quantifizierung zu ermöglichen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den untersuchten Phänotyp aufweisen, in diesem Beispiel knospende Hefezellen mit länglichen und/oder verketteten Knospen, die sich nicht voneinander trennen können. Wir zählen auch die Anzahl der toten Zellen, die an ihrer blauen Farbe identifiziert sind, seit der Zellteilungsdefekt, der am n-ten induziert wurde.

Zwei Überexpression führt zum Zelltod, um phänotypspezifische Defekte jederzeit sichtbar zu machen. Ein Milliliter Kultur wird in einem sterilen Mikrofurugeuröhrchen aliquotiert und die Zellen durch Zentrifugation reus entnommen. Das Zellpellet wird in 100 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter in sterilem Wasser suspendiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.

Die Färbung mit Calcior White ermöglicht die Visualisierung der E-Zellwand. Waschen Sie das Pellet dreimal mit einem XPBS. Das fertige Pellet suspendieren wir in 100 Mikrolitern PBS.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und nehmen Sie Bilder mit 100-facher Vergrößerung mit UV-Optiken auf, um die Zellwand sichtbar zu machen. Um GFP-getaggte Septin-Erfassungsbilder mit einem FS E-Filter zu visualisieren, quantifizieren Sie den Prozentsatz der Zellen mit Zellwanddefekten und der Septin-Mis-Lokalisierung mit der zuvor gezeigten Methode, indem Sie den Deckglas in neun Quadranten unterteilen und drei Bilder pro Quadranten für die Zählung von Zeitraffervideos aufnehmen. Für die Mikroskopie einzelner Hefezellen werden in Medien eingebettete Agros-Betten benötigt, um ein Agros-Bett zu erstellen.

Reinigen Sie zuerst einen Objektträger mit einer konkaven Vertiefung mit 70 % Alkohol und lassen Sie ihn an der Luft trocknen, während der Objektträger an der Luft trocknet. 0,06 Gramm Agros in fünf Millilitern selektiven Medien ohne Methionin in der Mikrowelle kochen, bis sich das Agros schnell vollständig aufgelöst hat. Pipettieren Sie 200 Mikroliter des Agros-haltigen Mediums in den Objektträger.

Senken Sie und drehen Sie einen weiteren sauberen Glasschieber darüber und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen darunter eingeschlossen sind. Wenn das Gel fest wird, bewegen Sie den Objektträger nach oben sanft von der Vertiefungsfolie weg und halten Sie ihre Oberflächen immer parallel. Dadurch wird sichergestellt, dass die Oberfläche des Agros-Bettes bündig mit der Oberfläche des Vertiefungsschiebers abschließt.

Reinigen Sie den Rutschbereich, der das Agros-Bett umgibt, mit einem feinen Tuch. Die Rutsche ist jetzt in einer Zeit von vier Stunden einsatzbereit. Übertragen Sie einen Milliliter Zellen aus der Kultur in ein steriles Mikrofuge-Röhrchen und ernten Sie durch Zentrifugation.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern frischem selektivem Medium, dem Methionin fehlt. Tragen Sie Vaseline auf die Ränder des Deckglases auf. Geben Sie dann einen Tropfen Zellsuspension in die Mitte des Agros-Bettes und verteilen Sie es gleichmäßig, indem Sie ein Deckglas vorsichtig darüber drücken.

Versiegeln Sie die Kanten des Eindeckglases und fixieren Sie seine Position, indem Sie die Kanten mit Nagellack auskleiden. Sobald der Nagellack getrocknet ist, legen Sie den Objektträger auf einen beheizten Tisch eines Mikroskops. Wir verwenden ein Zeiss Axio 200 M Mikroskop, das mit einer Zeiss Axio Cam, MRM Monochrom-Digitalkamera ausgestattet ist, um ein Feld auszuwählen, das nicht mehr als 10 Zellen enthält, die in ausreichendem Abstand angeordnet sind, da das Feld mit der Zeit überfüllt wird.

Wenn sich die Zellen teilen, nehmen Sie etwa fünf Stunden lang alle fünf Minuten ein Bild des Feldes auf. Um ein wiederholtes Nachjustieren des Fokus zu vermeiden. Wir programmieren die Bilderfassungssoftware so, dass sie zu jedem Zeitpunkt automatisch einige wenige Zack-Bilder aufnimmt.

Das Bild mit dem besten Fokus wird später für die Montage des Films ausgewählt, um eine ausreichende Wärme für die Zellen zu gewährleisten. Eine externe Wärmequelle zusätzlich zu den beheizten Tischen, die durch das Einwirken des durchgelassenen weißen Lichts des Mikroskops für die gesamte Dauer der Bildgebungs-Phänotypregression bereitgestellt werden, kann untersucht werden, indem die Bilder unter Verwendung der Image J-Software zu einem Film zusammengesetzt werden. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Überexpression unseres Proteins von Interesse. N-te zwei.

Erstens, die Proteinexpression von n-te zwei. Während des Verlaufs des Experiments wurden Lysate aus Zellen, die HA n-te exprimieren, durch Western Blot unter Verwendung eines monoklonalen Anti-HA-Antikörpers analysiert, wie die Immuno-Blot-Zellen zeigten, die in Gegenwart von 0,2 millimolar Methionin gezüchtet wurden, wiesen eine minimale Proteinexpression auf. Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, in denen Methionin fehlt, zeigen jedoch einen stetigen Anstieg der Konzentration von S zwei im Laufe des Experiments.

Als nächstes wurden Zellen analysiert, die sechs Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von Methionin gezüchtet wurden, da eine niedrige n-te Zwei-Konzentration nicht in der Lage ist, einen Zellteilungsphänotyp oder nur den Zelltod zu induzieren. Ein geringer Prozentsatz der Zellen ist tot, was sich an ihrer blauen Farbe nach der Färbung mit Methylenblau zeigt. Ebenso sind die Anzahl der Zellkerne pro Zelle, die Zellwand und die Organisation des Septins erwartungsgemäß normal.

Im Gegensatz dazu führt die Überexpression von M zwei zu einem massiven Zellteilungsdefekt und Zelltod, was sich in langen Ketten verbundener, länglicher Knospen zeigt, die ihre blaue Farbe behalten, wenn sie mit Methylenblau gefärbt werden. Die meisten phänotypischen Zellen sind mehrkernig, wie die DPI-Färbung zeigt. Die weiße Calcior-Färbung zeigt Ansammlungen der abnormalen Zellwandflecken.

Darüber hinaus ist das Septin stark falsch lokalisiert und unorganisiert. Die Quantifizierung des Phänotyps als Funktion der Zeit ist in dieser Grafik dargestellt, wobei die offenen Kreise null millimolares Methionin und die geschlossenen Kreise 0,2 millimolares Methionin darstellen. Wir sehen hier, dass, wenn sich die n-te Zwei-Konzentration in den Zellen im Laufe der Zeit aufbaut, auch der Prozentsatz der Zellen steigt, die den Zellteilungsphänotyp aufweisen.

Kontrollzellen, die bei 0,2 gezüchtet wurden. Millimethionin zeigt, dass die Entwicklung des Phänotyps eine Funktion einer erhöhten Proteinkonzentration ist und nicht auf die Bedingungen der Zellkultur. Schließlich wird die Entwicklung des Phänotyps nach n-ter Überexpression durch Zeitraffer-Videomikroskopie erfasst.

Nach vier Stunden n-tem Training zeigen zwei Überexpressionszellen einen milden morphologischen Zellteilungsphänotyp. Im Laufe des Films sehen wir abnormale und längere Perioden apikalen Knospenwachstums, die zu sehr länglichen Knospen führen. Wir sehen auch Ereignisse, bei denen neue Knospen auftauchen, bevor eine Zelltrennung stattgefunden hat.

Darüber hinaus wird beobachtet, dass Knospen aus mehreren Regionen der Zelle der Mutter hervorgehen, die einen Zweig zum Aussehen bilden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Entwicklung eines morphologischen Phänotyps in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration in der Knospenliste charakterisieren und analysieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen mit den empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu streicheln, da höhere Geschwindigkeiten die Zellen beschädigen können.

Es ist auch wichtig, daran zu denken, Methylenblau, und Chlorid erst kurz vor der Bildgebung hinzuzufügen, da sie für leichte Ostzellen giftig sind. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.