Name: Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Lernen Sie die Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad-Chimären zur Untersuchung der Herkunft von Lymphknoten-Stromazellen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse adipöser Gewebebeiträge.

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Wir danken dem Personal der Biomedical Services Unit der Universität Birmingham für die Betreuung unserer Tierkolonien. Diese Arbeit wurde durch das integrierte EU-FP7-Projekt INFLACARE to JC unterstützt.

Mäuse wurden in der Biomedical Service Unit an der Universität Birmingham gemäß den Vorschriften des britischen Innenministeriums und der lokalen Ethikkommission unter SPF-Bedingungen gezüchtet und gepflegt. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren fallen unter eine Projektlizenz, die sowohl von der lokalen Ethikkommission als auch vom Innenministerium genehmigt wurde.
1. Isolierung von Neugeborenen-LNs
<ol>
	<li>Opfern Sie die neugeborenen Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation.</li>
	<li>Teilen Sie den Kopf ab und öffnen Sie den Körper mit einer Schere von der Oberseite der Brustregion bis zur Unterseite der Bauchregion und entfernen Sie vorsichtig alle Eingeweide (Herz, Lunge, Leber, Darm, Niere, Blase) aus der Bauchhöhle.</li>
	<li>Übertragen Sie den Körper in eine 90-mm-Petrischale, die RF10-Medien enthält (RPMI1640 Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt wurde). Ab diesem Schritt werden die Gewebe unter sterilen Bedingungen aufbewahrt und in einer Gewebekulturhaube gehandhabt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Körper in eine neue 90-mm-Petrischale, die RF10 enthält.</li>
	<li>Unter dem Präpariermikroskop lösen Sie vorsichtig das Bauchfell von der Haut in der Leistenregion. Die leistenale LN befindet sich am Schnittpunkt von drei Blutgefäßen im Fettpolster.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den LN. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Fettgewebe entfernt wird. Übertragen Sie den LN in eine 50-mm-Petrischale, die RF10-Medien enthält. Halten Sie das Taschentuch auf Eis, während Sie mit dem Eingriff fortfahren.</li>
</ol>
2. Isolierung von E18.5 Fettpolstern
<ol>
	<li>Um Mausembryonen am Tag 18.5 der Trächtigkeit (E18.5) zu erzeugen, richten Sie zeitgesteuerte Schwangerschaften ein, indem Sie eine weibliche und eine männliche Maus pro Käfig über Nacht einsetzen. Trennen Sie die Mäuse morgens und prüfen Sie, ob sich Scheidenstopfen befinden (Schwangerschaftstag E0,5).
	<ol>
		<li>Euthanasieren Sie die verstopften Weibchen am 18.5. Tag der Trächtigkeit durch Zervixluxation.</li>
		<li>Entnehmen Sie die Embryonen und legen Sie sie in eine 90 mm Petrischale, die RF10 enthält.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ab diesem Schritt sollten die Gewebe in der Gewebekulturhaube steril behandelt werden. Unter dem Präpariermikroskop wird der Kopf abgetrennt, die Embryonen mit einer Schere vom Brustbereich bis zum unteren Rand der Bauchregion geöffnet und vorsichtig alle Eingeweide (Herz, Lunge, Leber, Darm, Niere, Blase) aus der Körperhöhle entfernt.</li>
	<li>Reinigen Sie den Körper von allen verbleibenden viszeralen Geweben und waschen Sie ihn in PBS, um alle Blutspuren zu beseitigen, die die Dissektion erschweren könnten.</li>
	<li>Übertragen Sie die sauberen Körper in eine frische 90-mm-Petrischale, die RF10 enthält.</li>
	<li>Löse vorsichtig das Bauchfell im Leistenbereich von der Haut. Die leistenale LN befindet sich am Schnittpunkt von drei Blutgefäßen im Fettpolster.</li>
	<li>Entfernen Sie den LN vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Es ist sehr wichtig, das LN vollständig zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Fettpolster, das für die Chimären verwendet wird, nicht durch lymphoide Stromazellen kontaminiert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Leistenfettpolster und geben Sie es in eine 50 mm Petrischale mit RF10-Medium. Halten Sie das Taschentuch auf Eis, während Sie mit dem Eingriff fortfahren.</li>
</ol>
3. Erzeugung der LN-Fett-Pad-Chimäre
<ol>
	<li>Bereiten Sie das In-vitro-Organkultursystem 15 vor.
	<ol>
		<li>Schwamm- und Filtervorbereitung: Dies kann im Voraus erfolgen und Schwämme und Filter steril in einer Petrischale in der Kulturhaube lagern.
		<ol>
			<li>Schneiden Sie das Vulkan Underwrap in 1-1,5 cm2 Stücke</li>
			<li>Die Schwämme 2 Std. in destilliertem Wasser kochen.</li>
			<li>Lassen Sie die Schwämme einige Stunden in der Zellkulturhaube trocknen.</li>
			<li>Kochen Sie die Filter 20 Minuten lang.</li>
			<li>Lassen Sie die Filter einige Stunden in der Zellkulturhaube trocknen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie DMEM-Medien vor, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES, 1x MEM Nonessential Amino Acid Solution, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml Medium in eine 50 mm Petrischale.</li>
		<li>Lege einen Biskuit auf den Boden der Petrischale. Befeuchten Sie beide Seiten des Schwamms, indem Sie sie in das Medium tauchen.</li>
		<li>Lege einen Filter auf den Schwamm. Der Filter befindet sich an der Flüssig-Luft-Grenzfläche.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unter dem Präpariermikroskop wird ein neugeborenes LN vorsichtig wieder mit einem embryonalen Fettpolster verknüpft.</li>
	<li>Platzieren Sie die LN-Fettpad-Chimäre auf dem Filter.</li>
	<li>Übertragen Sie die Petrischale in eine rechteckige Plastikbox mit ein paar Löchern am Deckel und Wasser am Boden, um die Feuchtigkeit zu gewährleisten.</li>
	<li>Verschließen Sie den Deckel der Box mit Klebeband. Lassen Sie die beiden Löcher im Deckel offen.</li>
	<li>Überführen Sie die Box in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2. Lassen Sie die Box 2 Stunden lang äquilibrieren, bevor Sie die Löcher im Deckel mit Klebeband verschließen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe mindestens 2 Tage lang, damit sich das LN an das Fettpolster anheften und unter die Nierenkapsel übertragen werden kann.</li>
</ol>
4. Übertragung der LN-Fett-Pad-Chimäre unter die Nierenkapsel von Wirtsmäusen
<ol>
	<li>Sammeln Sie die LN-Fett-Pad-Chimären aus dem Filter und geben Sie sie unter die Nierenkapsel der Wirtsmäuse. Die Methode des Nierenkapseltransfers wurde bereits beschrieben 16.</li>
</ol>
5. Isolierung der übertragenen LNs
<ol>
	<li>Nach 3-4 Wochen unter der Nierenkapsel sind die LN-Fettpolster Chimären bereit für die Ernte. Euthanasieren Sie die Wirtsmäuse unter Verwendung der genehmigten Anleitung.</li>
	<li>Entferne die Niere von den Wirtsmäusen.</li>
	<li>Isolieren Sie unter dem Präpariermikroskop die LN-Fettpad-Chimäre und präparieren Sie das LN.</li>
</ol>
6. Enzymatischer Verdau der übertragenen LNs für die durchflusszytometrische Analyse
<ol>
	<li>Machen Sie mit einer kleinen Schere einen Schnitt in das LN, damit die Enzyme in das Organ eindringen und die Verdauung erleichtern können.</li>
	<li>Geben Sie einen LN in 1,5 ml Eppendorf mit 600 μl Aufschlusspuffer (RPMI 1 % FCS, 2,5 mg/ml Kollagenase D, 100 μg/ml DNase I).</li>
	<li>30 min bei 37 °C auf einem Rühr-Thermoblock inkubieren. Pipettieren Sie alle 10 Minuten auf und ab, um die Dissoziation des Gewebes zu unterstützen.</li>
	<li>Geben Sie 6 μl EDTA 0,5 M in das Röhrchen und pipettieren Sie auf und ab, um die Dissoziation des Gewebes zu beenden.</li>
	<li>5 min bei 490 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in der Färbelösung (PBS, 0,1 % BSA, 5 % Rattenserum und 5 % Mausserum), die die Kombination von Primärantikörpern enthält.</li>
	<li>30 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zweimal in PBS waschen</li>
	<li>Bei Bedarf 20 min mit Sekundärantikörpern inkubieren.</li>
	<li>2x in PBS waschen.</li>
	<li>Analyse auf einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>
7. Analyse der übertragenen LNs durch Immunfluoreszenz
<ol>
	<li>Fixierung für die EYFP-Konservierung während des Gefrier- und Kryosektionsprozesses: Geben Sie das LN in eine Lösung aus PBS, 4 % PFA und 10 % Saccharose und lassen Sie es 3-4 Stunden einwirken.</li>
	<li>Geben Sie einen einzelnen kleinen Tropfen kalte O.C.T.-Masse auf ein kleines Stück Aluminiumfolie. Vermeiden Sie Luftblasen. Legen Sie den LN vorsichtig ohne Flüssigkeit in die Mitte des Tropfens.</li>
	<li>Frieren Sie das Organ ein, indem Sie die Alufolie auf Trockeneis legen.</li>
	<li>Schneiden Sie 8-10 μm Abschnitte mit einem Kryostaten auf zusätzliche selbstklebende Glasobjektträger. Lassen Sie die Objektträger 2 Stunden trocknen, bevor Sie sie bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Die Färbeverfahren können je nach verwendetem Primärantikörper variieren und können anhand des folgenden Protokolls optimiert werden. Die Schnitte werden mit einer Färbelösung (PBS, 1 % BSA) gefärbt, die die Kombination von Primärantikörpern enthält.</li>
	<li>1 Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren.</li>
	<li>Zweimal 5 Minuten in PBS waschen</li>
	<li>Inkubieren Sie 1 Stunde lang mit Sekundärantikörpern.</li>
	<li>Zweimal 5 Min. in PBS waschen.</li>
	<li>Einbinden von Folien in Einhängemedien, die DAPI enthalten.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop auf.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
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<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
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<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Artikel haben wir eine Methode vorgestellt, um den Beitrag von Fettgewebe-Vorläuferzellen zu den sich entwickelnden LNs zu testen und zu quantifizieren, sowie zwei Techniken, die die Analyse ihrer Nachkommen ermöglichen. Die Dissektion von embryonalen Fettpolstern und Neugeborenen LNs sind heikel und erfordern manuelle Fähigkeiten, die durch viel Übung vor der Erzeugung der eigentlichen LN-Fettpolster-Chimäre erworben wurden. Um die Qualität der Dissektionen zu kontrollieren, kann eine durchflusszytometrische A...

Lymphknoten (LNs) sind Schlüsselorgane des Immunsystems, die sich an strategischen Stellen im Körper entlang des lymphatischen Gefäßsystems befinden. Sie ermöglichen die Filtration von Antigenen und Krankheitserregern und bieten einen Ort für die Antigenpräsentation bei Lymphozyten und die Induktion adaptiver Immunantworten. Das Stroma, das die Grundstruktur des LN bildet und die Bewegung der verschiedenen hämatopoetischen Teilnehmer der adaptiven Immunantwort orchestriert, ist für die Funktion dieser Organe von zentraler Bedeutung. Unterschiedliche Populationen von Stromazellen liefern essentielle und spezifische Hinweise für die Bewegungen, die Lokalisation, das Überleben, die Proliferation und die Reifung der hämatopoetischen Komponente des Immunsystems1-3. Adulte LN-Stromazellen lassen sich in drei Kategorien einteilen: die Blutendothelzellen, die lymphatischen Endothelzellen und die Fibroblasten. Diese drei Kategorien umfassen heterogene Populationen. Die fibroblastischen Populationen enthalten fibroblastische retikuläre Zellen (FRC), follikuläre dendritische Zellen (FDC), marginale retikuläre Zellen (MRC), während die Fibroblasten, die die Kapsel bilden, die Medulla und andere Zellen, die noch nicht identifiziert wurden1-5. Die Ursprünge und die Mechanismen, die die Reifung der verschiedenen LN-Stromazellpopulationen steuern, sind unklar, und das Fehlen spezifischer Marker, die eine Kartierung des Verbleibs spezifischer LN-Stromazellpopulationen ermöglichen, macht ihre Untersuchung besonders schwierig. Ein vollständiges Verständnis der Ontogenese von LN-Stromazellen ist jedoch notwendig, um die adaptiven Immunantworten zu verstehen, die Mechanismen, die zur Toleranz beitragen, und ist die Grundlage für die Entwicklung künstlicher LNs.
Bisher beschränkte sich die Untersuchung des Ursprungs und der Entwicklung von LN-Stromazellen hauptsächlich auf die direkte Beurteilung der LN-Entwicklung in Embryonen und Neugeborenen in Wildtyp-Mäusen und verschiedenen Knockout-Mausstämmen6-9. Diese Ansätze sind durch die embryonale und perinatale Letalität einiger Mausstämme begrenzt, die Deletionen in Genen tragen, die für die LN-Entwicklung wichtig sind. Darüber hinaus sind einige der Gene, die für die Entwicklung des lymphatischen Gewebes essentiell sind, auch an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt, wie es bei RANK10-11 oder NF-κB212 der Fall ist. Um diese Probleme zu lösen, wurden die Isolierung und Transplantation von embryonalen LNs unter der Nierenkapsel einer Wirtsmaus durchgeführt12-13. Diese Technik ermöglicht beispielsweise den Transfer von genetisch veränderten embryonalen LNs in einer Wildtyp-Umgebung, um die Organentwicklung sowie die Rekrutierung und Organisation von Wirtszellen zu beurteilen. Das Wachstum von embryonalem LN, das unter die Nierenkapsel eines adulten Wirts transplantiert wurde, ist jedoch beeinträchtigt, wodurch die Anwendung dieser Technik eingeschränkt wird.
LNs und Fettdepots sind anatomisch eng miteinander verbunden und entwickeln sich gleichzeitig während der Embryogenese. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Assoziation LN/Fettgewebe eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Stromazellvorläuferzellen für die LNs spielt. Insbesondere steuert die Signalübertragung über den LTβR das Schicksal von Adipozyten-Vorläuferzellen, indem sie die Adipogenese blockiert und stattdessen die Reifung in Richtung eines LN-Stromazell-Phänotypsfördert 14. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf der Generierung von LN-Fettpad-Chimären basiert und die Verfolgung von Zellen aus Fettgewebe im sich entwickelnden LN ermöglicht. Diese Methode wird nützlich sein, um den Beitrag von Fettgewebe zu verschiedenen LN-Stromazellpopulationen zu bestimmen und in Kombination mit der Verwendung von Geweben aus genetisch veränderten Mausstämmen ein besseres Verständnis der Mechanismen ermöglichen, die die Differenzierung der verschiedenen LN-Stromazell-Untergruppen steuern.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sterilin Petrischale</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Sterilin Petrischale</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Selbstklebende Objektträger</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgM Rhodamin Rot</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Podoplanin PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Podoplanin gereinigt</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Extrafeine Pinzette für Embryonal- und Neugeborenendissektionen</td></tr><tr><td>EDTA-Lösung 0,5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinirisschere gerade 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Kleine Schere zum Sezieren</td></tr><tr><td>HEPES Lösung</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isoporen-Membranfilter 0,8 &mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminlösung</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbox mit Deckel</td><td>Watkins und Doncaster</td><td>E6052</td><td>Sandwich-Box für in vitro Organkulturen. Bohren Sie zwei Löcher in den Deckel, um den Gasaustausch im CO2-Inkubator zu ermöglichen.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Schwämme Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Präpariermikroskop mit Zoom</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von lymphknoten-fett-pad chimären für die studie der lymphknoten stromal cell origin

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Das Stroma ist eine Schlüsselkomponente der Lymphknotenstruktur und -funktion. Über seine Herkunft, die genaue zelluläre Zusammensetzung und die Mechanismen, die zu seiner Entstehung führen, ist jedoch wenig bekannt. Lymphknoten sind immer im Fettgewebe verkapselt, und wir haben kürzlich gezeigt, wie wichtig dieser Zusammenhang für die Bildung von Lymphknotenstroma ist. Adipozyten-Vorläuferzellen wandern während seiner Entwicklung in den Lymphknoten und schalten bei Aktivierung des Lymphotoxin-b-Rezeptors die Adipogenese aus und differenzieren sich zu lymphoiden Stromazellen (Bénézech et al.14). Basierend auf dem lymphoiden Stromapotenzial von Fettgewebe stellen wir eine Methode vor, die eine Lymphknoten-/Fettpolster-Chimäre verwendet, die es ermöglicht, die Abstammungslinie von Lymphknotenstromazellvorläufern zu verfolgen. Wir zeigen, wie man neugeborene Lymphknoten und EYFP+ embryonales Fettgewebe isoliert und eine LN/ EYFP+ Fettpolster-Chimäre herstellt. Nach dem Transfer unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus nimmt der Lymphknoten lokale Vorläuferzellen des Fettgewebes auf und schließt seine Bildung ab. Die Nachkommenanalyse von EYFP+-Fettpolsterzellen in den resultierenden Lymphknoten kann durch durchflusszytometrische Analyse enzymatisch verdauter Lymphknoten oder durch Immunfluoreszenzanalyse von Lymphknotenkryosektionen erfolgen. Durch die Verwendung von Fettpolstern aus verschiedenen Knockout-Mausmodellen bietet diese Methode eine effiziente Möglichkeit, die Herkunft der verschiedenen Lymphknotenstromazellpopulationen zu analysieren.

Drei Wochen nach der Transplantation wird das LN/Fettgewebe-Chimäre aus der Niere gewonnen. Das Chimäre ähnelt nun stark einem normalen LK in seinem eigenen Fettgewebe, und der LK ist in der Mitte des Fettgewebes sichtbar (Abbildung 1). Falls der LK nicht identifiziert werden kann, ist es möglich, dass er während der Transplantation auf die Niere verloren ging. Bei der Untersuchung der Rolle von Genen, die möglicherweise wichtig für die LK-Entwicklung sind, können die gewonnenen LKs sehr klein bleiben un...

Die Erzeugung von Lymphknoten-/Fettpolster-Chimären zur Untersuchung des Ursprungs von Lymphknotenstromazellen wird beschrieben. Die Methode umfasst die Isolierung von Lymphknoten aus neugeborenen Mäusen und embryonalen Fettpolstern, die Erzeugung von chimären Lymphknoten-Fettpolstern und deren Übertragung unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein lymphknotenfettgewebe-Chimär zu erzeugen, um den Beitrag des Fettgewebes an der Bildung des lymphatischen Stroma zu untersuchen. Dies wird zunächst erreicht, indem Lymphknoten von neugeborenen Mäusen und Fettgewebe von 18,5-tägigen Mausembryonen isoliert werden. Der Lymphknoten wird aus dem embryonalen Fettgewebe entfernt und durch den Lymphknoten eines Neugeborenen ersetzt.Das Lymphknoten-Fettgewebe-Chimär wird hergestellt, indem ein neugeborener Lymphknoten mit einem embryonalen Fettgewebe in vitro reassembliert und anschließend kultiviert wird. Das Chimär wird dann unter die Nierenkapsel einer Wirtmaus transplantiert. Drei Wochen nach der Transplantation wird die Niere entnommen und das Chimär gewonnen. Schließlich kann der Beitrag der aus dem Fettgewebe stammenden Zellen zur Lymphknotenstroma mittels Durchflusszytometrie und immunfluoreszenzmikroskopischer Analyse bewertet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir nach einem Weg suchten, um zu überprüfen, ob Zellen aus dem Fettgewebe zur Bildung der Lymphknoten beitragen. Um neugeborene inguinale Lymphknoten zu isolieren, öffnen Sie nach dem Abtrennen des Kopfes mit einer Schere den Körper des Tieres vom oberen Thoraxbereich bis zum unteren Bauchbereich.Nachdem Sie vorsichtig sämtliche Eingeweide aus der Bauchhöhle entfernt haben, legen Sie den Körper in eine 90 Millimeter große Petrischale, die RF-10-Medien enthält. Stellen Sie die Schale in eine sterile Gewebekulturhaube und überführen Sie anschließend den Körper in eine neue sterile 90 Millimeter große Petrischale mit frischem RF 10. Trennen Sie dann vorsichtig das Peritoneum von der Haut im Leistenbereich und lokalisieren Sie die dort im Fettgewebe an der Kreuzung dreier Blutgefäße gelegenen Leistenlymphknoten.Entfernen Sie vorsichtig die Lymphknoten und stellen Sie sicher, dass das gesamte Fettgewebe entfernt wird. Anschließend geben Sie die Lymphknoten in eine 50 Millimeter große Petrischale mit RF 10-Medium auf Eis, um die inguinalen Fettgewebe von 18,5-tägigen Embryonen zu isolieren. Nachdem Sie die Eingeweide wie zuvor gezeigt entfernt haben, waschen Sie die Körper in steriler PBS, um alle Blutrückstände zu beseitigen.Überführen Sie die gereinigten Körper in eine neue 90 Millimeter große Petrischale und lösen Sie anschließend das Peritoneum, lokalisieren Sie den inguinalen Lymphknoten und entfernen Sie ihn, wie zuvor gezeigt. Entsorgen Sie das isolierte Gewebe. Achten Sie darauf, den gesamten Lymphknoten zu entfernen, um eine Kontamination des Fettgewebe-Chimärs zu vermeiden.Entfernen Sie dann das inguinale Fettgewebe und geben Sie es in eine 50 Millimeter große Petrischale mit RF-10-Medium auf Eis. Um das in-vitro-Organkultursystem vorzubereiten, schneiden Sie zunächst einige Stücke von Vulcan-Folie in Größen von ein bis 1,5 Quadratzentimetern zurecht. Anschließend kochen Sie die Schwämme zwei Stunden und die Filter zwanzig Minuten lang in destilliertem Wasser und lassen sie anschließend mehrere Stunden lang in einer Zellkulturhaube trocknen.Nachdem die Materialien trocken sind, jeweils einen Schwamm in eine 50 Millimeter große Petrischale mit zwei Millilitern Medium geben. Jeden Schwamm im Medium untertauchen, um beide Seiten zu benetzen, und anschließend je ein Filter pro In-vitro-Organkultursystem an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche platzieren. Danach vorsichtig ein embryonales Fettgewebe mit einem neugeborenen Lymphknoten direkt auf die Oberseite jedes Filters bringen.Überführen Sie die Petrischalen in eine rechteckige Plastikbox mit Wasser am Boden und Löchern im Deckel. Kleben Sie den Deckel mit Klebeband an der Box fest, wobei die Löcher offen bleiben. Stellen Sie dann die Box in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Lassen Sie die Box zwei Stunden lang equilibrieren und verschließen Sie anschließend die Löcher im Deckel mit Klebeband. Inkubieren Sie die Gewebe mindestens zwei Tage lang, um den Lymphknoten ausreichend Zeit zu geben, sich an die Fettgewebepolster anzulagern, bevor sie unter die Nierenkapsel transplantiert werden, drei bis vier Wochen nach der Transplantation. Isolieren Sie jedes chimärische Fettgewebepolster mit Lymphknoten in jeder Niere und dissezieren Sie die Lymphknoten aus.Verwenden Sie dann für jeden Lymphknoten eine kleine Schere, um einen einzelnen Schnitt im Gewebe vorzunehmen, um die enzymatische Verdauung zu erleichtern. Anschließend jeweils einen Lymphknoten in einzelne 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen geben, die 600 Mikroliter Verdauungspuffer enthalten. Die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem schüttelnden Wärmeprotokoll inkubieren und alle 10 Minuten auf- und abpipettieren, um die Gewebeauflösung zu unterstützen.Gegeben Sie anschließend sechs Mikroliter EDTA zu den Röhrchen und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um die Dissoziation abzuschließen. Die Zellen können dann mit den gewünschten Antikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie auf die Expression des verbesserten gelben fluoreszierenden Proteins (EYFP) analysiert werden. Fixieren Sie die Lymphknoten drei bis vier Stunden lang.Legen Sie dann für jeden Lymphknoten einen einzelnen Tropfen kalte OCT-Verbindung auf ein kleines Stück Aluminiumfolie. Platzieren Sie vorsichtig, ohne Luftblasen einzuschließen, einen Lymphknoten in die Mitte jedes Tropfens und legen Sie die Folie anschließend auf Trockeneis, um das Gewebe einzufrieren. Die Lymphknoten können dann geschnitten, gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden.Eine sorgfältige Isolierung des Lymphknotens ermöglicht die weitere Analyse der Nachkommen von EYFP-positiven, aus Fettgewebe stammenden Zellen. Kryoschnitte und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen des Lymphknotens zeigen, dass EYFP-positive, aus Fettgewebe stammende Zellen in den Lymphknoten migrieren und dort zum GP38-positiven, ERTR7-positiven Netzwerk der lymphknotenständigen Stromazellen beitragen. Die Durchflusszytometrie bestätigt, dass ein bedeutender Anteil der lymphknotenständigen Stromazellen von lokalen EYFP-positiven Vorläuferzellen des Fettgewebes abstammt, wodurch sie 30 % der CD45-negativen, GP38-positiven, CD31-negativen fibroblastischen Fraktion sowie 10 % der CD45-negativen, GP38-negativen, CD31-positiven Fraktion der Blutendothelzellen ausmachen. Bis zu 80 % der CD45-negativen, GP38-positiven, CD31-negativen fibroblastischen Fraktion können aus Vorläuferzellen des Fettgewebes hervorgehen, was die entscheidende Rolle des Fettgewebes bei der Aufrechterhaltung des Wachstums des lymphknotenständigen Stromas verdeutlicht. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie von einem Forscher auf dem Gebiet der lymphoiden Organogenese genutzt werden, um die Rolle verschiedener Moleküle bei der Entwicklung lymphoider Gewebe zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

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Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

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