Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Lymphknoten-Fettpolster-Chimäre zu erzeugen, um den Beitrag des Fettgewebes zur Bildung des Lymphknotenstromas zu beurteilen. Dies wird zunächst durch die Isolierung von Lymphknoten von neugeborenen Mäusen und Fettpolstern von Mausembryonen am Tag 18,5 erreicht. Der Lymphknoten wird aus dem embryonalen Fettpolster entfernt und durch den neugeborenen Lymphknoten ersetzt.

Die Lymphknoten-Fettpolster-Chimäre wird zusammengesetzt, indem ein neugeborener Lymphknoten mit einem embryonalen Fettpolster in vitro reassoziiert und dann kultiviert wird. Die Chimäre wird dann unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus transplantiert. Drei Wochen nach der Transplantation wird die Niere entnommen und die Chimäre entnommen.

Letztendlich kann der Beitrag der aus dem Fettpolster abgeleiteten Zellen zum Lymphknotenstroma durch durchflusszytometrische und immunfluoreszenzmikroskopische Analyse beurteilt werden. So hatten wir die Idee zu dieser Methode erst, als wir nach einer Möglichkeit suchten, um zu beurteilen, ob Zellen aus dem Fettpolster wir zur Bildung der Lymphknoten beitragen, um neugeborene Leistenlymphknoten zu isolieren. Nachdem Sie den Kopf geschnitten haben, verwenden Sie eine Schere, um den Körper des Tieres von der Oberseite der Brustregion bis zur Unterseite des Bauches zu öffnen.

Nachdem Sie vorsichtig alle Eingeweide aus der Bauchhöhle entfernt haben, legen Sie den Körper in eine 90-Millimeter-Petrischale, die RF 10-Medien enthält. Stellen Sie die Schale in eine sterile Gewebekulturhaube und geben Sie den Körper dann in eine neue sterile 90-Millimeter-Petrischale, die frisches RF 10 enthält. Löse dann vorsichtig das Bauchfell von der Haut im Leistenbereich und lokalisiere die Leistenlymphknoten, die sich am Schnittpunkt von drei Blutgefäßen im Fettpolster befinden.

Entfernen Sie vorsichtig die Lymphknoten und achten Sie darauf, dass das gesamte Fettgewebe entfernt wird. Legen Sie dann die Lymphknoten in eine 50-Millimeter-Petrischale mit RF 10-Medium auf Eis, um die Leistenfettpolster von Embryonen am Tag 18,5 zu isolieren. Nachdem Sie die Eingeweide wie gerade gezeigt entfernt haben, waschen Sie die Körper in sterilem PBS, um alle Blutspuren zu entfernen.

Übertragen Sie die gereinigten Körper in eine frische 90-Millimeter-Petrischale und lösen Sie dann das Bauchfell, lokalisieren Sie den Leistenlymphknoten und entfernen Sie ihn wie gerade gezeigt. Entsorgen Sie das isolierte Gewebe. Achten Sie darauf, den gesamten Lymphknoten zu entfernen, um eine Kontamination der Fettpolster-Chimäre zu vermeiden.

Entfernen Sie dann das Leistenfettpolster und legen Sie es in eine 50-Millimeter-Petrischale mit RF 10-Medium auf Eis. Um das in vitro Organkultursystem einzurichten, schneiden Sie zunächst etwas Vulcan under wrap in ein bis 1,5 Quadratzentimeter große Stück. Dann kochst du die Schwämme für zwei Stunden und die Filter für 20 Minuten in destilliertem Wasser und lässt sie mehrere Stunden in einer Zellkulturhaube trocknen.

Sobald die Materialien getrocknet sind, legen Sie jeweils einen Schwamm in eine 50-Millimeter-Petrischale, die zwei Milliliter Medium enthält. Tauchen Sie jeden Schwamm in das Medium, um beide Seiten zu befeuchten, und platzieren Sie dann einen Filter pro In-vitro-Organkultursystem an der Flüssigluftgrenzfläche. Assoziieren Sie anschließend vorsichtig ein embryonales Fettpolster mit einem neugeborenen Lymphknoten direkt auf der Oberseite jedes Filters.

Übertragen Sie die Petrischalen in eine rechteckige Plastikbox mit Wasser am Boden und Löchern im Deckel. Klebe den Deckel an die Box und lasse die Löcher offen. Stellen Sie die Box dann in einen 37 Grad Celsius heißen 5%CO2-Zellkultur-Inkubator.

Lassen Sie die Schachtel zwei Stunden lang äquilibrieren und verschließen Sie dann die Löcher im Deckel mit Klebeband. Inkubieren Sie das Gewebe mindestens zwei Tage lang, damit sich die Lymphknoten an den Fettpolstern festsetzen können, bevor Sie drei bis vier Wochen nach der Transplantation unter die Nierenkapsel übertragen werden. Isolieren Sie jede Lymphknoten-Fettpolster-Chimäre in jeder Niere und präparieren Sie die Lymphknoten.

Verwenden Sie dann für jeden Lymphknoten eine kleine Schere, um einen einzigen Schnitt in das Gewebe zu machen, um die enzymatische Verdauung zu unterstützen. Legen Sie anschließend je einen Lymphknoten in einzelne 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen mit 600 Mikrolitern Verdauungspuffer. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem rührenden Thermoblock und pipettieren Sie alle 10 Minuten auf und ab, um das Gewebe zu dissoziieren.

Geben Sie dann sechs Mikroliter EDTA in die Röhrchen und tritrieren Sie die Zellsuspension einige Male, um die Dissoziation zu beenden. Die Zellen können dann mit den gewünschten Antikörpern gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert werden, um die verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins oder des EYFP zu erhalten. Fixieren Sie die Lymphknoten für drei bis vier Stunden.

Geben Sie dann für jeden Lymphknoten einen einzelnen Tropfen kalte OCT-Verbindung auf ein kleines Stück Aluminiumfolie. Um Luftblasen zu vermeiden, legen Sie vorsichtig einen Lymphknoten in die Mitte jedes Tropfens und legen Sie dann die Folie auf Trockeneis, um das Gewebe einzufrieren. Die Lymphknoten können dann geschnitten, gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden.

Die sorgfältige Isolierung des Lymphknotens ermöglicht eine weitere Analyse der Nachkommen von EYFP-positiven Fettzellen. Kryoschnitte und Immunfluoreszenzanalysen des Lymphknotens zeigen, dass EYFP-positive Fettzellen in den Lymphknoten wandern, wo sie zum GP 38 positiven E RTR sieben positiven Lymphknoten-Stromazellnetzwerkfluss beitragen Die zytometrische Analyse bestätigt, dass ein wichtiger Teil der Lymphknotenstromazellen von lokalen EYFP-positiven Fettgewebsvorläuferzellen stammt, die zu 30 % der CD beitragen 45 negative G 38 positive CD 31 negative FIBROBLASTISCHE und 10 % der CD 45 negativen GP 38 negativen CD 31 positiven Endothelzellfraktion im Blut bis zu 80 % der CD 45, negativen G 38 positiven CD 31 negativen fibroblastischen Fraktion können aus Fettgewebsvorläuferzellen gewonnen werden, was die entscheidende Rolle des Fettgewebes bei der Aufrechterhaltung des Wachstums des Lymphknotenstromas zeigt. Also einmal diese Technik mit einem Forscher auf dem Gebiet der lymphoiden Organogenese gemeistert, um die Rolle verschiedener Moleküle zu erforschen, die an der des Lymphtraumas beteiligt sind.