Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein lymphknotenfettgewebe-Chimär zu erzeugen, um den Beitrag des Fettgewebes an der Bildung des lymphatischen Stroma zu untersuchen. Dies wird zunächst erreicht, indem Lymphknoten von neugeborenen Mäusen und Fettgewebe von 18,5-tägigen Mausembryonen isoliert werden. Der Lymphknoten wird aus dem embryonalen Fettgewebe entfernt und durch den Lymphknoten eines Neugeborenen ersetzt.

Das Lymphknoten-Fettgewebe-Chimär wird hergestellt, indem ein neugeborener Lymphknoten mit einem embryonalen Fettgewebe in vitro reassembliert und anschließend kultiviert wird. Das Chimär wird dann unter die Nierenkapsel einer Wirtmaus transplantiert. Drei Wochen nach der Transplantation wird die Niere entnommen und das Chimär gewonnen.

Schließlich kann der Beitrag der aus dem Fettgewebe stammenden Zellen zur Lymphknotenstroma mittels Durchflusszytometrie und immunfluoreszenzmikroskopischer Analyse bewertet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir nach einem Weg suchten, um zu überprüfen, ob Zellen aus dem Fettgewebe zur Bildung der Lymphknoten beitragen. Um neugeborene inguinale Lymphknoten zu isolieren, öffnen Sie nach dem Abtrennen des Kopfes mit einer Schere den Körper des Tieres vom oberen Thoraxbereich bis zum unteren Bauchbereich.

Nachdem Sie vorsichtig sämtliche Eingeweide aus der Bauchhöhle entfernt haben, legen Sie den Körper in eine 90 Millimeter große Petrischale, die RF-10-Medien enthält. Stellen Sie die Schale in eine sterile Gewebekulturhaube und überführen Sie anschließend den Körper in eine neue sterile 90 Millimeter große Petrischale mit frischem RF 10. Trennen Sie dann vorsichtig das Peritoneum von der Haut im Leistenbereich und lokalisieren Sie die dort im Fettgewebe an der Kreuzung dreier Blutgefäße gelegenen Leistenlymphknoten.

Entfernen Sie vorsichtig die Lymphknoten und stellen Sie sicher, dass das gesamte Fettgewebe entfernt wird. Anschließend geben Sie die Lymphknoten in eine 50 Millimeter große Petrischale mit RF 10-Medium auf Eis, um die inguinalen Fettgewebe von 18,5-tägigen Embryonen zu isolieren. Nachdem Sie die Eingeweide wie zuvor gezeigt entfernt haben, waschen Sie die Körper in steriler PBS, um alle Blutrückstände zu beseitigen.

Überführen Sie die gereinigten Körper in eine neue 90 Millimeter große Petrischale und lösen Sie anschließend das Peritoneum, lokalisieren Sie den inguinalen Lymphknoten und entfernen Sie ihn, wie zuvor gezeigt. Entsorgen Sie das isolierte Gewebe. Achten Sie darauf, den gesamten Lymphknoten zu entfernen, um eine Kontamination des Fettgewebe-Chimärs zu vermeiden.

Entfernen Sie dann das inguinale Fettgewebe und geben Sie es in eine 50 Millimeter große Petrischale mit RF-10-Medium auf Eis. Um das in-vitro-Organkultursystem vorzubereiten, schneiden Sie zunächst einige Stücke von Vulcan-Folie in Größen von ein bis 1,5 Quadratzentimetern zurecht. Anschließend kochen Sie die Schwämme zwei Stunden und die Filter zwanzig Minuten lang in destilliertem Wasser und lassen sie anschließend mehrere Stunden lang in einer Zellkulturhaube trocknen.

Nachdem die Materialien trocken sind, jeweils einen Schwamm in eine 50 Millimeter große Petrischale mit zwei Millilitern Medium geben. Jeden Schwamm im Medium untertauchen, um beide Seiten zu benetzen, und anschließend je ein Filter pro In-vitro-Organkultursystem an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche platzieren. Danach vorsichtig ein embryonales Fettgewebe mit einem neugeborenen Lymphknoten direkt auf die Oberseite jedes Filters bringen.

Überführen Sie die Petrischalen in eine rechteckige Plastikbox mit Wasser am Boden und Löchern im Deckel. Kleben Sie den Deckel mit Klebeband an der Box fest, wobei die Löcher offen bleiben. Stellen Sie dann die Box in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Lassen Sie die Box zwei Stunden lang equilibrieren und verschließen Sie anschließend die Löcher im Deckel mit Klebeband. Inkubieren Sie die Gewebe mindestens zwei Tage lang, um den Lymphknoten ausreichend Zeit zu geben, sich an die Fettgewebepolster anzulagern, bevor sie unter die Nierenkapsel transplantiert werden, drei bis vier Wochen nach der Transplantation. Isolieren Sie jedes chimärische Fettgewebepolster mit Lymphknoten in jeder Niere und dissezieren Sie die Lymphknoten aus.

Verwenden Sie dann für jeden Lymphknoten eine kleine Schere, um einen einzelnen Schnitt im Gewebe vorzunehmen, um die enzymatische Verdauung zu erleichtern. Anschließend jeweils einen Lymphknoten in einzelne 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen geben, die 600 Mikroliter Verdauungspuffer enthalten. Die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem schüttelnden Wärmeprotokoll inkubieren und alle 10 Minuten auf- und abpipettieren, um die Gewebeauflösung zu unterstützen.

Gegeben Sie anschließend sechs Mikroliter EDTA zu den Röhrchen und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um die Dissoziation abzuschließen. Die Zellen können dann mit den gewünschten Antikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie auf die Expression des verbesserten gelben fluoreszierenden Proteins (EYFP) analysiert werden. Fixieren Sie die Lymphknoten drei bis vier Stunden lang.

Legen Sie dann für jeden Lymphknoten einen einzelnen Tropfen kalte OCT-Verbindung auf ein kleines Stück Aluminiumfolie. Platzieren Sie vorsichtig, ohne Luftblasen einzuschließen, einen Lymphknoten in die Mitte jedes Tropfens und legen Sie die Folie anschließend auf Trockeneis, um das Gewebe einzufrieren. Die Lymphknoten können dann geschnitten, gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden.

Eine sorgfältige Isolierung des Lymphknotens ermöglicht die weitere Analyse der Nachkommen von EYFP-positiven, aus Fettgewebe stammenden Zellen. Kryoschnitte und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen des Lymphknotens zeigen, dass EYFP-positive, aus Fettgewebe stammende Zellen in den Lymphknoten migrieren und dort zum GP38-positiven, ERTR7-positiven Netzwerk der lymphknotenständigen Stromazellen beitragen. Die Durchflusszytometrie bestätigt, dass ein bedeutender Anteil der lymphknotenständigen Stromazellen von lokalen EYFP-positiven Vorläuferzellen des Fettgewebes abstammt, wodurch sie 30 % der CD45-negativen, GP38-positiven, CD31-negativen fibroblastischen Fraktion sowie 10 % der CD45-negativen, GP38-negativen, CD31-positiven Fraktion der Blutendothelzellen ausmachen. Bis zu 80 % der CD45-negativen, GP38-positiven, CD31-negativen fibroblastischen Fraktion können aus Vorläuferzellen des Fettgewebes hervorgehen, was die entscheidende Rolle des Fettgewebes bei der Aufrechterhaltung des Wachstums des lymphknotenständigen Stromas verdeutlicht. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie von einem Forscher auf dem Gebiet der lymphoiden Organogenese genutzt werden, um die Rolle verschiedener Moleküle bei der Entwicklung lymphoider Gewebe zu untersuchen.