Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie In-vitro-

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre postnatale Neuroblasten von Nagetieren zu transfizieren, um die Wirkung von Zielproteinen auf deren Migration zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Neuroblasten aus dem rostralen Migrationsstrom der Nagetierpops präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, sie zu dissoziieren und durch Zellkernaffektion entweder mit DNA oder S-H-R-N-A zu transfizieren.

Anschließend werden die Neuroblasten in hängenden Tropfen wieder aggregiert und dann für eine angemessene Zeit in Suspension kultiviert. Der letzte Schritt besteht darin, die reaggregierten Neuroblastencluster in eine dreidimensionale Matrix einzubetten und sie wandern zu lassen. Letztendlich wird die Immunfluoreszenz- oder Zeitraffer-Bildgebungsmikroskopie verwendet, um die Migration von Neuroblasten zu analysieren.

Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage auf dem Gebiet der Neurogenese zu beantworten, wie z.B. die Kontrolle der Migration von Neuroblasten aus Stammzellen im postnatalen Gehirn. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zur Verwendung viraler Vektoren, die schwierig und zeitaufwändig sein kann, relativ einfach und schnell ist. Nachdem Sie eine Rattenstreu der P sechs bis P sieben geopfert haben, machen Sie bei jeder Ratte mit einer Skalpellklinge einen hinteren Schnitt in der Haut entlang der mittleren sagittalen Naht von der Nase bis zum Kleinhirn.

Als nächstes ziehst du die Haut ab und wiederholst den gleichen Schnitt entlang des Schädels. Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette die Schädellappen und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn zusammen mit den Riechkolben mit einem Spatel.

Schneiden Sie danach das am meisten verhätschelte Drittel des Gehirns ab und werfen Sie es weg. Anschließend schneiden Sie das Hirngewebe mit einem Gewebehacker in 1,4 Millimeter dicke Kronenscheiben. Übertragen Sie die Scheiben in eine Schüssel mit kaltem Seziermedium.

Betrachten Sie dann die Scheiben unter dem Präpariermikroskop. Trennen Sie sie vorsichtig mit einer Nadel. Der rostrale Wanderstrom erscheint als dreieckiger durchscheinender Bereich in der Mitte der OB-Abschnitte und als kleiner kreisförmiger Bereich.

Schneiden Sie bei stärker verhätschelten Hirnschnitten das RMS mit einem mikrochirurgischen Messer aus jeder Scheibe heraus und achten Sie darauf, dass das umgebende Gewebe nicht eingeschlossen wird. Sammeln Sie anschließend die RMS-Fragmente mit einer Plastikpasterpipette und legen Sie sie in eine kleine Schale mit kaltem Seziermedium auf Eis. Drehen Sie dann die Schale vorsichtig, um die RMS-Fragmente in der Mitte der Schale zu sammeln.

Sammeln Sie die Fragmente mit einer Plastikpipette und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Fragmente am Boden des Rohrs absetzen. Ersetzen Sie das Präpariermedium durch zwei Milliliter Dissoziationsmedium T tri.

Bewerten Sie die RMS-Fragmente, indem Sie die Fragmentsuspension anschließend mit einer P 1000-Pipette etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Lassen Sie den Schlauch mit den Gewebefragmenten zwei Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Pipettieren Sie die Lösung anschließend erneut 10 Mal und stellen Sie sicher, dass sich die Fragmente dissoziiert haben.

Dann inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie fünf Milliliter vorentwurmtes DMEM plus 10 % FCS hinzufügen und die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 433 mal G zentrifugieren. Entfernen Sie das überschüssige Medium und die Reanimation. Suspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es vorsichtig in einen Milliliter vorwarmes DMEM plus 10 % FCS pipettieren und dann weitere vier Milliliter desselben Mediums hinzufügen.

Führen Sie dann eine Zellzählung durch. Für jede Nukleobektion sind mindestens 2,5 mal 10 bis sechste Zellen erforderlich, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Mit drei- bis viermal 10 Zellen pro Zellkern Affektion.

Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 433-fachem G zentrifugiert. Entfernen Sie danach bei diesem Verfahren so viel Medium wie möglich. Sofort Resus, suspendieren Sie das Zellpellet in der zuvor inkubierten Lösung für die Nukleoaffektion des Rattenneurons.

Bei Raumtemperatur werden 100 Mikroliter der Zellsuspension in jedes EOR-Röhrchen gegeben, das SI R-N-A-D-N-A enthält. Mischen Sie es dann vorsichtig, indem Sie es zwei- bis dreimal mit einer Pipette P 200 pipettieren. Geben Sie anschließend die Probe auf den Boden des Nucle Affection Vete und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.

Für die Schädigung von Kernen verwenden Sie das Programm G Strich 0 1 3 für Rattenzellen oder O Strich 0 0 5 für Mauszellen. Danach geben Sie schnell einen Milliliter Vorkriegs-DMEM plus 10 % FCS in die vom Zellkern betroffene Probe. Die Probe wird mit der Kunststoffpipette, die im Nucle Affection Kit enthalten ist, in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern DMEM aus der Vorkriegszeit plus 10 % FCS überführt.

Zentrifugieren Sie dann die Probe fünf Minuten lang bei 433 mal G. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 25 bis 30 Mikrolitern Vorkriegs-DMEM plus 10 % FCS mit einer P 20-Pipette. Verwenden Sie nicht mehr als 30 Mikroliter Medium.

Anschließend pipettieren Sie die Suspension als Tropfen auf die Innenseite eines P 35 Schalendeckels. Drehen Sie dann den Deckel über die Schale P 35 mit zwei Millilitern vollständigem Medium. Lassen Sie es mindestens fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid im Inkubator.

Nach fünf Stunden geben Sie die hängenden Tropfen vom Deckel in das komplette Medium in der Schale. Mit einer P 1000 Pipette mit abgeschnittener Spitze. Dann inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden für DNA-NU-Kerninfektionen oder 48 Stunden für SI A HRA-Kerninfektionen.

Bereiten Sie nun 25 Milliliter des kompletten Mediums vor und äquilibrieren Sie es bei 37 Grad Celsius für einige Stunden mit 5% Kohlendioxid. In der Zwischenzeit nehmen Sie die gefrorenen Aliquots der Basalmembranmatrix aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen sie im Kühlraum auf Eis auf. Bereiten Sie für jede Kernerkrankung eine sechs Zentimeter große Schale mit bis zu acht 13 Millimeter sterilen Deckgläsern vor.

Stellen Sie das Geschirr auf eine mit Frischhaltefolie bedeckte Eisbox. Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, legen Sie einen Streifen feuchtes Gewebe in eine 15-Zentimeter-Schale, die für bis zu drei Sechs-Zentimeter-Schalen mit in das Knie eingebetteten Oblasten verwendet wird. Als nächstes fügen Sie das gesamte Medium in einem Verhältnis von eins zu drei zur HAW-Matrix hinzu, überführen die reaggregierten Zellcluster in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren es fünf Minuten lang mit dem 433-fachen G.

Entfernen Sie danach das überschüssige Medium und suspendieren Sie die Palette wieder in 10 Mikrolitern vollständigem Medium. Geben Sie dann zwei Mikroliter Zellaggregatsuspension auf jeden sterilen Deckglas. Fügen Sie 18 Mikroliter Matrizenmischung hinzu und verteilen Sie die Matrize mit der Pipettenspitze über die gesamte Abdeckung.

Schieben Sie die Sechs-Zentimeter-Schale mit den Abdeckfolien sofort in die 15-Zentimeter-Schale. Bringen Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 15 bis 20 Minuten in den Inkubator. Nachdem sich die Matrix verfestigt hat, geben Sie vorsichtig fünf Milliliter vollständiges Medium in jede Sechs-Zentimeter-Schale und drücken Sie mit der Pipettenspitze alle schwimmenden Deckgläser nach unten, die dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5%-Carbogen inkubiert werden, damit der Neuroblast aus den Zellaggregaten wandern kann.

In dieser Abbildung ist gezeigt, dass die isolierten RMS-Zellen der Ratte immunpositiv für die migratorischen Neuroblastenmarker DCX und Beta-3-Tubulin sind. Und diese Abbildung zeigt, dass die wandernden Neuroblastenmarker DCX und PSA NCA in den Zellen exprimiert werden, die aus der Maus migrieren. RMS Explan für Maus Neuroblast Nu nukleäre Affektion, dissoziierte Maus RMS Neuroblasten wurden mit GFP reaggregiert, eingebettet in eine dreidimensionale Matrix und sechs Stunden lang wandern gelassen.

Die Neuroblasten, die aus einem reaggregierten Zellcluster migrieren, zeigen eine hohe Transfektionseffizienz. Hier wurden Ratten-Neuroblasten nukleär beeinflusst, wobei zwei verschiedene Plasmide, die für GFP kodieren, reaggregiert, in die Matrix eingebettet und 24 Stunden lang wandern gelassen wurden. Die Zellen wurden dann fixiert und immungefärbt für GFP und Beta-3-Tubulin, um die Migrationsdistanz zu messen.

Der aggregierte Zellcluster wird in sechs gleiche Sektoren unterteilt, und für jeden Sektor wird der Abstand zwischen dem Rand des Clusters und der am weitesten migrierten Zelle gemessen. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der relativen Distanz, die von den GFP-positiven NUCLE-betroffenen Zellen migriert wurde, und die Kontrolle der GFP-negativen nicht-nukle-betroffenen Zellen zur Überwachung der Neuroblastenmigration. Nach der S-H-R-N-A-Affektion von Ratten-Neuroblasten wurden die Zellkerne mit einem Kontroll-S-H-R-N-A-Vektor oder demselben Vektor, der ein HRNA-Ziel enthielt, beeinflusst, um Proteinzellen zu befestigen und zu aktinbündeln, über 48 Stunden wieder aggregiert, in die Matrix eingebettet und 24 Stunden lang wandern zu lassen.

Anschließend wurden die Aggregate fixiert und die Immunfärbung für GFP und Beta-3-Tubulin vorgenommen. Eine effektive Depletion der Befestigungsmittel kann 50 Stunden nach der Befall der S-H-R-N-A-Kerne durch Western Blood Analysis nachgewiesen werden, und Acton wird hier als Belastungskontrolle gezeigt. Hier ist die quantitative Analyse der relativen Migrationsdistanz, die zeigt, dass eine befestigte Depletion die Neuroblastenmigration signifikant beeinträchtigt.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die postnatale Elektroporation durchgeführt werden, um die mit dem NU Nuclear Affection Migration Assay erzielten Ergebnisse in vivo zu validieren.