Temperaturgradienten-Assay: Eine Methode zum Testen der Temperaturpräferenz bei Drosophila-Larven

- Um die Temperaturpräferenz von Drosophila-Larven zu testen, erzeugen Sie einen Temperaturgradienten, indem Sie eine Seite einer Aluminium-Testplatte erhitzen und die andere abkühlen. Aluminium hat eine hohe Wärmeleitfähigkeit, was bedeutet, dass die Wärme effizient übertragen wird, wodurch ein stabiler linearer Temperaturgradient entsteht. Nachdem das System das Gleichgewicht erreicht hat, zeichnen Sie die Temperaturen auf der Platte in gleich großen Temperaturzonen auf und beladen Sie dann die Mitte der Platte mit sauberen Larven.

Decken Sie das gesamte System ab, um Interferenzen durch helles Licht zu vermeiden, und starten Sie die Testversion. Die Larven verteilen sich über den Gradienten, meiden aversive Zonen, die zu warm oder zu kalt sind, und siedeln sich in Zonen mit günstigen Temperaturen an. Dieses Verhalten wird als Thermotaxis bezeichnet. Um die Temperaturpräferenz der Larven zu beurteilen, notieren Sie die Anzahl der Tiere in jeder Temperaturzone.

Im Beispielprotokoll sehen wir, wie man einen unidirektionalen Temperaturgradienten zwischen 18 und 28 Grad Celsius einrichtet und wie die Larven während des Assays behandelt werden.

- Um einen unidirektionalen Gradienten vorzubereiten, schaffen Sie zunächst eine feuchte Umgebung für den Assay. Legen Sie zwei Aluminiumblöcke, die zu separaten Wasserbädern verbunden sind, im Abstand von 10 Zentimetern auf nasse Papiertücher. Die Wasserbäder müssen im Vorfeld aufgewärmt werden. Stellen Sie anschließend 100 Milliliter 1 % Agarose her und geben Sie 25 Milliliter auf jede Assay-Platte auf einer ebenen Fläche. Sobald die Agarose fest geworden ist, reiben Sie die Oberfläche vorsichtig mit einem Melaminschwamm ab, um sie leicht grob zu machen.

Um eine effiziente Temperaturübertragung zu fördern, füllen Sie dann alle Lücken zwischen den Aluminiumblöcken in den Assay-Platten mit Wasser, das aus einer Sprühflasche geliefert wird. Platzieren Sie nun die Testplatten auf den Aluminiumblöcken und stellen Sie sicher, dass die Abgrenzungen 2 Zentimeter von beiden Kanten entfernt sind, um genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinzustimmen.

Sprühen Sie anschließend einen Wasserfilm auf die Oberfläche der Platten, damit die Gele nicht austrocknen. Decken Sie als Nächstes das System mit einem Karton ab, um die Verdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie 5 bis 10 Minuten, damit sich die Temperatur ausgleichen kann. Überprüfen Sie dann die Oberflächentemperatur auf der Platte an mindestens 12 Stellen, um sicherzustellen, dass überall eine gleichmäßige Temperatur von 2 Grad Celsius herrscht oder nicht. Bringen Sie dann die Abdeckung der Box wieder an, bis der Assay durchgeführt wird.

Entfernen Sie zuerst den Karton über dem Gel und überprüfen Sie schnell die Oberflächentemperatur des Gels. Wenn die Oberfläche trocken ist, sprühen Sie eine kleine Menge Wasser auf die Oberfläche. Wenn das Gel gut ist, dann laden Sie mit einem kleinen Pinsel 100 bis 200 Larven in die Mitte jeder Platte. Setzen Sie dann einen Deckel über jede Testplatte, um die Larven einzufangen, und decken Sie das Setup mit einem Karton ab, um Lichteinwirkung zu verhindern. Die Analyse ist derzeit im Gange.

Entfernen Sie nach 10 bis 30 Minuten den Karton und den Mikrotiterplattendeckel. Fotografieren Sie dann die Platten von oben, um die Position der Larven festzuhalten. Platzieren Sie die Box über der Kamera, um Reflexionen auf der Oberfläche des Gels zu vermeiden. Um die Platte zu reinigen, saugen Sie alle Larven dort ab, wo sie sich verstreut haben.

Berechnen Sie nun die prozentuale Verteilung der Larven in jeder Zone mit Hilfe einer Bildanalysesoftware. Ziehen Sie alle 2 Zentimeter Linien basierend auf den Abgrenzungen auf der Testplatte und zählen Sie die Anzahl der Larven in jeder Zone.

- Ignorieren Sie beim Zählen Larven, die in Bereichen mit einem Abstand von 0,5 Zentimetern zu jeder Kante verteilt sind. Die Geldicke und die Temperaturbedingungen sind in der Nähe des Randes nicht gleichmäßig.