Name: Sammlung und Analyse von Arabidopsis Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie die EDTA-Methode zur Sammlung von Phloemexsudaten aus Arabidopsis für metabolische und proteomische Analysen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Pflanzensignalwegen und Stressantworten.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation NSF-IOS Grant # 1144391 zu SHB unterstützt.

1. Herstellung von Pflanzen <ol><li> Arabidopsis Samen können direkt auf dem Boden oder auf MS Platten gekeimt werden. Wachsen die Pflanzen für vier bis sechs Wochen in Klimakammern mit einer 12-Stunden-Photoperiode (22 ° C Tag, 15 ° C Nacht 14). Wasserpflanzen ein-bis zweimal in der Woche. Verwenden Bodenwanne für die Bewässerung; nicht Wasserpflanzen von oben; ermöglichen die Tabletts, bevor erneut Wasser trocknen. Achten Sie darauf, Pflanzen sind gut hydriert zum Zeitpunkt der Ernte. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Geschirr <ol><li> K 2-EDTA-Lösung: Machen Sie eine 100 mM K 2-EDTA Lösung stock Lösung, die im Kühlschrank aufbewahrt werden. Am Tag der Sammlung, verdünnte die Lösung 1-5 (ein Teil EDTA-Lösung, vier Teile Wasser), um eine 20 mM K 2-EDTA-Lösung zu erhalten. </li><li> Füllen Sie ein Glas oder eine Petrischale (Durchmesser 7-15 cm) zur Hälfte mit dem 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Wenn Sammeln von Proben aus verschiedenen Behandlungen (zBreichlich Steuer-und Salz-gestressten Pflanzen oder verschiedenen Genotypen), bereiten separaten Gerichte für jede Behandlung. </li><li> Füllen gewünschte Anzahl von 1,7 ml Reaktionsgefäße mit 1,4 ml 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Füllen einer gleichen Anzahl von Reaktionsrohren mit 1,4 ml autoklaviert deionisiertem oder Millipore-Wasser. </li><li> Legen Sie Papier Handtücher auf der Bank, um Pflanzen am Set; erhalten eine neue Rasierklinge und setzen auf Handschuhe. </li></ol> 3. Sammlung von Phloemexsudaten (Dargestellt in Flussdiagramm in Abbildung 1) <ol><li> Ernte Rosettenblätter von vier auf sechs Wochen alten Pflanzen, indem sie mit der Rasierklinge an der Basis des Stiels in der Nähe der Mitte der Rosette. </li><li> Sofort legen Sie die Blätter in den Schalen mit 20 mM K 2-EDTA. Stellen Sie sicher, das abgeschnittene Ende der Blattstiel in die Lösung eingetaucht ist (Abbildung 2). </li><li> Sobald 15 Blätter wurden gesammelt (ca. drei Minuten vor vier Pflanzen), sanft stapeln Blätter auf der jeweils anderen wie tHut der Schnitt Blattstiele sind zueinander ausgerichtet. Umschnitt der Basis der Blattstiele (ca. 1 mm) und sofort in die Blätter in einem der Reaktionsgefäße mit 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Die Blätter passen am einfachsten, wenn sie leicht aufgerollt. Vermeiden Sie drückte die Blätter in da dies könnte Verletzungen von Zellen und führt somit zu der Sammlung von Blattzelle Inhalte führen. </li><li> Wenn mehr Material benötigt wird, sanft decken die Proben mit einem feuchten Papiertuch. Verwenden Sie eine neue Reihe von Gerichten, wenn für die Entnahme von Proben aus verschiedenen Behandlungen oder Genotypen. </li><li> Nachdem alle Proben in Reaktionsgefäße positioniert, sammeln die Ausscheidungen entweder im Dunkeln oder im Licht. </li><li> Zum Sammeln in der Dunkelheit, Linie der Boden eines großen flachen Teller mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in die Schüssel und entweder mit nassen Papiertüchern oder in eine schwarze Kunststoff-Rückseite mit Schlitzen für die Belüftung. Legen Sie das gesamte Setup in einem Schrank oder in einen dunklen Raum. </li><li> Zum Sammeln im Licht, Den Boden einer klaren Plexiglas-Behälter mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in dem Behälter und schließen Sie es. </li><li> Nach 1 Stunde, Blätter zu entfernen sanft aus dem Behälter und den Reaktionsrohren und gründlich mit destilliertem, deionisiertem oder Millipore-Wasser, um alle EDTA zu entfernen. Dieser Schritt dient drei Zwecken: (1) es entfernt das EDTA minimiert Schäden an den Zellen, (2) es beseitigt die Störung von EDTA mit SDS-PAGE und Chromatographie, und (3) entfernt alle Verbindungen, die aus geschnittenen angesammelt haben / beschädigt Zellen. Sofort in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit autoklaviertes Wasser übertragen und zu den befeuchteten Sammelbehälter für die Sammlung von Ausscheidungen. An dieser Stelle hinzufügen RNase-Inhibitor, wenn das Exsudat muss zur RNA-Extraktion verwendet werden. Optional: Proteinase-Inhibitor hinzugefügt, wenn Protein Analyse gewünscht wird. </li><li> Nach der beabsichtigten Abholzeit, herausziehen und discard die Blätter und einfrieren Phloemexsudaten in flüssigem N 2 für die weitere Verwendung. Wenn längere Lagerung erforderlich ist, lyophilisieren die Proben und bei -80 ° C </li><li> Im Falle von Arabidopsis durch Metabolite bereits nach dem Sammeln von Exsudaten 1 Stunde nachgewiesen werden. Allerdings ist eine Sammlung für 5-8 Stunden sinnvoll, wenn die Analyse von weniger reichlich Komponenten geplant. Bei größeren Anlagen wie Perilla, längere Abholzeiten (8 St.) empfohlen. Exsudat gesammelt aus 15 Blättern ist in der Regel ausreichend für eine Spur auf einem SDS-PAGE-Gel (Proteine), für die mRNA-Extraktion, GC-MS (Zucker und Metaboliten). Für Lipidanalyse die Bündelung von 2-3 Proben (Exsudat 30-45 Blätter) wird empfohlen und führt zu klareren Ergebnissen. </li></ol> 4. Die anschließende Analyse (Für Video zeigen wir nur 4.4) <ol><li> Für Protein-Analyse, resuspendieren Probe in 15 ul Wasser und 30 ul Lämmli Puffer, Hitze bis 95 ° C für 5 min, schnell Spin-Down jede precipitates und laden gesamte Probe auf einem SDS-PAGE-Gel (45 ul Laden Taschen). Die Proben sollten mit kolloidalem Coomassie oder andere empfindliche Flecken gefärbt werden, da Proteinfülle ist sehr gering. </li><li> Für Zucker und kleine Metabolitenanalyse, fügen Derivatisierungsmittel auf die getrocknete Probe, wie in der Literatur 14 beschrieben. </li><li> mRNA analysiert unter Verwendung von RT-PCR, Microarray-oder RNA-Seq-Analyse werden. </li><li> Für Lipidanalyse sofort Pool zwei vor drei Proben und Partition gegen Chloroform: Methanol (1:1) im Abzug wie folgt: in eine gleiche Menge Chloroform: Methanol zu jeder Probe, Wirbel für ein paar Sekunden, und Zentrifuge für 4 min bei 400 x g. Sammeln Sie die untere (organische) Phase in ein Glasrohr mit Teflon-Kappe und wiederholen Partition mit der oberen Phase noch dreimal. Die vereinigten organischen Phasen unter einem Strom von N 2 und legt weitere Analyse (Dünnschichtchromatographie: DC 14, 37; Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie: LC-MS 14). </li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die EDTA-erleichtert Sammlung von Phloemexsudaten ist sehr einfach, benötigt minimale Ausrüstung und ist für die meisten Pflanzen. Insgesamt erstreckt sich dieses Verfahren die Möglichkeit, Phloemexsudaten von mehr Arten zu analysieren. Obwohl das Exsudat verdünnt wird, ist es leicht, viele verschiedene Proben zu sammeln oder von vielen Pflanzen zu skalieren, um eine große Menge von Material. Dies ermöglicht dann zum Nachweis von neuen Verbindungen, die in sehr geringer Menge sind und ansonsten übersehen werden. Diese Methode kann für mehrere Pflanzenarten eingesetzt werden und arbeitet als für die, die in diesem Manuskript beschrieben aufgelistet. Wenn neue Arten entdeckt werden, sind die beiden Aspekte, die geändert werden müssen möglicherweise die Anzahl der Blätter verwendet und die Zeit der Absonderung. In den meisten Fällen sollte ein fünf-bis 8 Stunden Ausschwitzen geeignet sein. Um die Verwendung dieser Methode für eine neue Pflanzenarten zu bestätigen, muss Exsudat gesammelt und eine oder mehrere der nachfolgenden Analyse wie in Protokoll Teil 4 n beschriebeneeds durchgeführt werden. In Abhängigkeit von der Intensität des Signals beobachtet, kann die Auffangvolumen müssen skaliert werden. In der Regel wird Lipid-und Protein-Analyse erfordern mehr Material als Zucker und Metabolit-Analyse seit der ehemalige weniger reichlich in Phloemexsudaten sind. Da der EDTA-erleichtert Exsudat Sammlung beinhaltet geschnitten Oberflächen sowie eine möglicherweise schädliche Wirkung von EDTA, haben mehrere Punkte berücksichtigt werden: (1) nach der einstündigen Inkubation mit EDTA, haben die Blattstiele gründlich gewaschen werden. Dadurch werden alle Verbindungen von verletzten Zellen sowie die EDTA selbst, die Zellen beschädigen oder stören die Extraktion gewonnen. (2) Positive und negative Kontrollen enthalten müssen, damit Daten, die von Phloemsaft abgeleitet werden und nicht von verletzten Zellen (siehe kritischen Schritte unten). (3) Phloemsaft enthält zwar mehrere Enzyme, die aktiv sein konnte während Exsudat Sammlung. Daher wird in einigen Fällen kann es nützlich sein, fo sammelnr unterschiedliche Mengen an Zeit. (4) Da das Verfahren Exsudation in Wasser beteiligt sind, ist eine absolute Quantifizierung der Verbindungen nicht möglich. Kritische Schritte: Der Schlüssel für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode ist die Verwendung von Vorsicht beim Umgang mit der Probe nicht zu verletzen keine Zellen sowie die Verwendung geeigneter Kontrollen (vgl. Rz 14).. Eine geeignete Steuerung ist die Sammlung von Phloemexsudaten ohne vorherige Behandlung mit EDTA. In diesem Fall wird das Phloem Dichtung selbst und nicht Exsudat gesammelt werden können. Alle Verbindungen verunreinigt, die aus den Zellen Verwundeten hier erfasst werden. Ein zweiter würde die Analyse von Zuckern in dem Exsudat sein. In Arabidopsis sollte Saccharose die vorherrschende Metaboliten im Phloemsaft sein, mit Fructose Saccharose-Verhältnis von 1.04 bis 01.08 (Ref. 8, 14). Für die RNA-Extraktion die Verwendung einer RNAse-Inhibitor notwendig ist. Darüber hinaus ist eine positive Kontrolle von zuvor described Phloem-lokalisierten mRNA (UBC9: Ubiquitin conjugating Enzym 9, At4g27960, 8, 14) und eine negative Kontrolle von zum Beispiel ein Chloroplasten-mRNA (Rubisco LSU) sind ratsam. Weil das Exsudat enthält aktive Enzyme wird eine Zeit natürlich empfohlen, dass Änderungen im Phloem Profil machen, sind nicht nur aufgrund von Variationen in der Abholzeit. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, Proteinase-Inhibitoren zu verwenden. Allerdings müssen die Ermittler im Auge zu behalten, dass die gesammelte Exsudat konzentriert werden und dass keine zugesetzten Verbindungen werden weitgehend konzentriert werden. Ein zweiter wichtiger Schritt innerhalb des Protokolls ist das Nachschneiden der Blattstiel unter EDTA. Dieser Schritt dient einem doppelten Zweck: Erstens, entfernt es keine verschlossenen Sieb Platten und verhindert gleichzeitig die Bildung neuer Stecker wodurch für freien Durchfluss des Phloemsaft. Zweitens, entfernt es die Kavitationsblase im Xylem erzeugt beim Schneiden und ermöglicht somit Xylem Transport. Die Größe des zweiten Zuschnitts abhängens auf die Pflanzen verwendet werden. In Anlagen mit größeren Blattstiele sollte einige Millimeter (ca. 1 cm) über dem ersten Schnitt in Pflanzen wie Arabidopsis sein, sind 1-2 mm ausreichend. Die Verwendung dieser Methode kann zur Entdeckung neuer Verbindungen in Phloemexsudaten die haben signalisiert, Entwicklungs-oder biomedizinischen Auswirkungen führen könnte. Es hat eine mehr gefragt in tiefen Einblick in Fern-Lipid-Signalisierung, die ein wenig untersuchtes Feld innerhalb Pflanzenwissenschaften aufgrund des fehlenden Zugangs zum Phloem war.

Pflanzen können sich nicht bewegen, um widrigen Bedingungen zu entkommen. Folglich mussten sie Mechanismen auf Belastungen der Umwelt erkennen zu entwickeln, zu entlocken und senden ein Signal verwandten in der gesamten Anlage, und stellen Sie die Entwicklung entsprechend. Zwei Transportsysteme gibt es für die Verteilung von Wasser, Nährstoffe und andere (Signalisierung)-Verbindungen. Das erste ist das Xylem, die in der Regel transportiert Wasser und Mineralien von den Wurzeln in der gesamten Anlage gemacht. Das zweite ist das Phloem. Der Blick auf das Phloem hat sich von einem einfachen assimilieren Transportsystem mit einer Leitung für RNA verändert, Eiweiß, Viren, Lipide und andere kleine Moleküle. Es spielt eine wichtige Rolle in assimilieren und Stofftransport, als Reaktion auf biotische und abiotische Stress sowie in Pflanzenwachstum und-entwicklung. Es heißt jetzt &quot;Datenautobahn&quot; der Anlage 18. Phloemparenchymzellen, sowie spezialisierte Begleiter ce: Das Phloem besteht aus mehreren Zelltypen bestehenlls und Siebelementen. Das Sieb Element ist die Website von Fern-Bewegung. Um freie Längs fließen zu lassen, werden Siebelementen fehlen die meisten Organellen sowie Kerne und sind gedacht, um im besten Fall eine begrenzte Translationsmaschinerie 21, 33 enthalten. Es wird angenommen, dass Begleitzellen Proteine ​​und andere Verbindungen, die im Phloem reisen strömen zu synthetisieren. Diese Verbindungen werden dann in das Siebelement über plasmodesmata transportiert und kann als lange Strecke Signale 4,16 funktionieren. Mehrere Gruppen von Verbindungen können in Phloemexsudaten gefunden werden: <ul><li> Zucker sind oft die Produkte der Photosynthese und werden als &quot;energietragende&quot; Moleküle in andere Teile der Anlage zur Lagerung oder als Bausteine ​​transportiert. Sie können aber auch als Frostschutzmittel oder als Signalstoffe funktionieren. </li><li> Proteine ​​können auch in Phloemexsudaten gefunden werden. Dazu gehören aber auch metabolische Enzyme haben Meldefunktion. Eine Blutzuckerwerle eines Proteins, das als Entwicklungs-Signal dient, ist die Blüte locus T-Protein, das die Induktion der Blüte sowie saisonale Blattabwurfs in Anlagen signalisiert. 6 </li><li> Nukleinsäuren sind in Phloemexsudaten in Form von mRNA, Klein-und Kleinstunternehmen RNAs und viralen RNAs. Sie scheinen weitgehend in Signalisierung 27, 28, 39 einbezogen werden. Zur gleichen Zeit, haben rRNA und tRNAs für fast alle Aminosäuren in der Phloemsaft der Kürbisgewächse 42 beobachtet worden. Sie erscheinen, um selektiv in das Sieb Rohr übertragen werden. Die tRNAs zeigen notwendigen Änderungen für die Fähigkeit, Aminosäuren zur Translationsgerät übertragen. Doch nicht teilnehmenden Übersetzung, scheinen sie diesen Prozess hemmen. Alternativ kann sie als eine Quelle von Cytokinin dienen oder signalisieren die metabolischen Zustand der Anlage 42. </li><li> Fettsäuren, Oxylipine und andere Lipide auch in Phloemexsudaten 3, 13, 14, 23 gefunden. Jasmonic Säure, ein Oxylipin bewegt sich durch das Phloem als Teil der Reaktion auf Pathogeninfektion 22, 29, 31, 32. Während die Rolle der meisten Phloem Lipide, ist noch unklar, einige von ihnen haben wahrscheinlich Meldefunktion 4. </li></ul> Die Herausforderung in der Arbeit mit Pflanzen Phloem liegt in seiner Fähigkeit, sich auf Verwundung versiegeln. Es gibt vier große Methoden zur Phloemexsudaten sammeln, aber sie funktionieren nur in ausgewählten Arten: 1) In Kürbisgewächse ist es möglich, in angemessener Höhe zur Phloem Exsudat durch Kürzungen der Blattstiel zu erhalten. Sobald der erste Tropfen mit Kontamination von verletzten Zellen entfernt wird, ist es möglich, relativ große Mengen an reinen Phloemsaft 1, 15 zu erhalten. Doch mit zunehmender Sammlung Zeit, diese Exsudat verdickt, so dass es zunehmend ungeeignet für die Flüssigkeitschromatographie Ansätze (unveröffentlicht). Neuere Publikationen deuten, dass je nach Art, diese Phloemsaft von eithe abgeleitetr die faszikuläre (FP) oder die extrafaszikuläres Phloem (EP) und das, während sie enthalten &quot;mobile&quot; Phloemsaft aus den Siebelementen (FP) tut, ist es auch anfällig für Verunreinigungen durch andere Zelltypen, einschließlich der Xylem 40, 41 . 2) Ein zweiter Ansatz ist Phloemsaft durch flache Schnitte oder Einstiche in Stamm-oder Blattstiel zu erhalten. Diese Methode wurde erfolgreich in Lupine 17, 25, 36 Kürbisgewächse und Brassica napus 12 verwendet. Hier ist die Kontamination von verletzten Zellen ist minimal und die Ausscheidungen sehr rein. Allerdings müssen Pflanzen gesund zu sein und gut bewässert, da es sehr schwierig ist, selektiv nur die Punktion Siebelementen. Wenn Xylemgefäße geklaut werden, wird alle Exsudat in das Xylem Strom gezogen. Dies macht das Verfahren nicht geeignet für Anlagen mit sehr zerbrechlich oder stark verholzten Stielen oder Stielen. 3) Blattlaus stylectomy ermöglicht Blattläuse ihre Stilett in die Siebelementen legen Sie dien Entfernen der Blattlaus mit einem Laser. Phloemsaft ist durch den verbleibenden Mandrin 2, 9, 10, 35, 38 ausgeschieden. In der Theorie kann jeder Pflanze, die von Blattläusen befallen werden können für diesen Ansatz verwendet werden. Allerdings werden die meisten Gewächshaus oder Klimakammer Manager unterstützt die Verwendung eines Erregers. Darüber hinaus vorstellen Blattläuse mehrere Proteine ​​in das Phloem mit ihrem Speichel 19, 33. Dies führt zu einer beschränkten Transkriptions Umprogrammierung 30 und hat das Potential, das Phloem Zusammensetzung 26 zu ändern. 4) Die hier beschriebene Methode ist die EDTA-erleichtert Ausschwitzen Phloemsaft. Dieses Verfahren verwendet EDTA Abdichtung des Phloem 20 zu verhindern. EDTA Chelate Ca 2 +-Ionen, die sonst in Prozesse, die Abdichtung des Phloem teilnehmen würden. Während EDTA zu Zellschädigungen 30 führen kann, haben einige Gruppen diese Methode verwendet und beobachtet keine nachteilige Wirkung von EDTA-Konzentrationen von 10 bis 20 mm auf der Ultrastruktur der Zelle oder auf phloem Verladung und Transport 5, 24. Um keine schädliche Wirkung sowie durch Störungen von EDTA mit Chromatographie und Gel-Elektrophorese zu reduzieren, werden die Pflanzen in Wasser nach 1 h bewegt und nur die späteren Teil des Exsudat 14 verwendet. So, anstatt Exsudation in EDTA wird Phloem in Wasser (EDTA-erleichtert Ausschwitzen) exudated. Es ist eine geradlinige, niedrige Kosten, und Low-Tech-Verfahren für die Sammlung von Phloemexsudaten. Phloemsaft erhalten auf diese Weise verwendet werden, um Proteine, kleine Moleküle, Lipide und RNAs zu analysieren und wurde erfolgreich in vielen Pflanzen verwendet. Während eine begrenzte Anzahl von Versuchen in Monokotyledonen 11 durchgeführt wurde, wird das Verfahren besser geeignet für Dikotyledonen (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Pappel 7). Sammlung von Exsudaten muss in einer feuchten Umgebung, um den Verlust von Ausscheidungen durch Transpiration zu vermeiden auftreten. Je nach Anlage ist Inkubation in EDTA für ein bis zwei Stundenausreicht, um die Abdichtung der Phloem / Siebelementen verhindern. Die Sammlung kann dann in Wasser auftreten. Dies hat den Vorteil, damit negative Auswirkungen EDTA weist an Zellstruktur und Stabilität. Es entfällt auch die Interferenz von EDTA mit Methoden wie HPLC oder SDS-PAGE. Es wird gezeigt, wie es um Arabidopsis gilt. Bei größeren Anlagen, hat Inkubation in EDTA und Exsudat Sammlungen bis skaliert werden und wird in Bechern anstatt in 1,7 ml Reaktionsgefäße durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Flache Petrischale aus Glas oder Kunststoff (7-15 cm)</td><td>PYREX oder Corning</td><td></td><td>Jede saubere, flache Schale funktioniert</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Nur offene Behälter im Abzug</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schraubverschluss-Röhrchen</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schraubverschluss-Röhrchen</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Rohre</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

sammlung und analyse von<em&gt; arabidopsis</em&gt; phloemexsudaten mit der edta-methode erleichtert

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Die Pflanze Phloem ist wesentlich für die Langstrecken-Transport von (Foto-) assimiliert sowie von Signalen, die biotischen oder abiotischen Stress. Es enthält Zucker, Aminosäuren, Proteine, RNA, Lipide und andere Metaboliten. Zwar gibt es ein großes Interesse in das Verständnis der Zusammensetzung und Funktion des Phloem, die Rolle der viele dieser Moleküle und damit ihre Bedeutung in der Entwicklung von Pflanzen und Stressreaktion muss noch bestimmt werden. Ein Hindernis für die Phloem Analyse liegt in der Tatsache, dass die Dichtungen selbst Phloem nach Verwundung. Als ein Ergebnis ist die Anzahl der Pflanzen, von denen Phloemsaft erhalten werden können, beschränkt. Eine Methode, die Sammlung von Phloemexsudaten ermöglicht aus mehreren Pflanzenarten ohne zusätzliche Ausrüstung ist die EDTA-erleichterten Phloem Exsudat Sammlung hier beschrieben. Zwar ist es leicht zu bedienen ist, führt es auf die Verwundung von Zellen und darauf zu achten, um den Inhalt der beschädigten Zellen zu entfernen. Darüber hinaus, um mehrere Kontrollen nicht Reinheit des Exsudatserforderlich. Weil es ein Ausschwitzen statt einer direkten Sammlung des Phloemsaft (nicht möglich bei vielen Arten) nur relative Quantifizierung der Inhalte auftreten können. Der Vorteil dieser Methode gegenüber anderen ist, dass es in vielen krautigen oder Gehölzarten (Perilla, Arabidopsis, Pappel, etc.) verwendet werden und erfordert nur minimale Ausrüstung und Ausbildung. Es führt zu einer relativ großen Mengen an Ausscheidungen, die für die anschließende Analyse von Proteinen, Zuckern, Lipiden, RNA, Viren und Metaboliten verwendet werden können. Es ist einfach genug, dass es sowohl in einer Forschung als auch in einem Labor Lehre verwendet werden kann.

Es hat sich in den vergangenen Jahren deutlich, dass die Komplexität des Phloemsaft kann die Antwort auf die Frage, wie Pflanzen senden unterschiedliche Entwicklungs-und Stress-Signale für eine optimale Reaktion sein. Mit EDTA-erleichtert Phloem Ausschwitzen kann die Möglichkeit bieten, Phloemexsudaten aus Pflanzen, die nicht geeignet sind für andere Ansätze, sondern kann aus wirtschaftlichen oder physiologischen Interesse sein zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Ernte genug Phloemexsudaten zu Phloem-lokalisierten Proteine ​​zu identifizieren und erkennen Veränderungen in ihrer Ebene in Reaktion auf die Entwicklung oder Stress (Abbildung 3). Wie die Abbildung zeigt, Proteine ​​sind in sehr geringer Menge, und doch ist ihr hoch genug für die anschließende Proteomik Experimente mit LC-MS/MS oder Western-Blot-Analyse. Würdigung in Kürbisgewächse legen nahe, dass das Schneiden der Stammzellen zu einer Störung des Wasser Potential Balance und einem nachfolgenden Einstrom von Wasser führt undmögliche Verunreinigungen aus dem Apoplast 41. Doch Sammlung für Zeiten zwischen einem bis acht Stunden keinen Einfluss auf die Phloem Protein profile / Zusammensetzung in Arabidopsis (. Nur die absolute Höhe variiert Guelette et al), die Menge des Proteins gesammelt und das Muster der Proteine ​​gefunden variiert zwischen den Arten (Arabidopsis: An; Perilla, Spur I und NI) und Behandlungen (Perilla in verschiedenen Längen Tag gewachsen, Spur I und NI). Als Ergebnis proteinhaltigen Signale visualisiert werden können, identifiziert und verfolgt. mRNA-und Mikro-RNAs können auch in Phloemexsudaten durch dieses Verfahren identifiziert werden. Allerdings ist die Behandlung mit RNAse-Inhibitor erforderlich, um den Abbau der mRNA in der verlängerten Ausschwitzen der Zeit zu verhindern. Da die Siebelementen nicht enthalten funktionelle Chloroplasten, Rubisco kleinen oder großen Untereinheit (RbcS oder RbcL, respectively) mRNAs kann als negative Kontrollen verwendet werden, während bekannt PhloemLokalisierten mRNA wie Ubiquitin konjugierendes Enzym kann als positive Kontrolle (Abbildung 4) verwendet werden. Ebenso können Zucker oder kleinen Metaboliten analysiert entweder mit GC-MS oder LC-MS werden. Hier sei erwähnt, dass die Phloemexsudaten eine große Anzahl von funktionellen Enzymen, darunter fast die gesamte Glykolyse 12 enthalten. Daher kann die Verwendung von verschiedenen Zeitpunkten während der Stoffwechselprozesse Exsudat Kollektion offenbaren. Ein Beispiel ist in Abbildung 5 dargestellt: In allen Ausscheidungen, Saccharose ist das am häufigsten vorkommende Metaboliten, das ist die offensichtlichste nach einer Sammlung für 1 Stunde. Nach fünf Stunden wurde die Saccharose zu Fructose-Verhältnis leicht reduziert. Wenn die gleiche Exsudat für eine Stunde gesammelt und links auf der Bank für die nächsten vier Stunden wird die Saccharose zu Fructose Verhältnis zu einem viel größeren Ausmaß reduziert, was darauf hindeutet, dass die aktive Enzyme im Phloem führen zu einem Abbau von Saccharose Ausscheidungen bei Raumtemperaturtemperatur (für weitere Interpretationen Spitze sehen 14). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen, dass Phloembeladung und Transport von Molekülen aus Begleiter Zellen in die Siebelementen während Ausschwitzen fortsetzen kann, bis das System verliert seine Vitalität 34. Lipide in den Phloemexsudaten und durch die Erweiterung, sind Fern-Lipid-Signalisierung ein relativ neues Feld von Interesse in Plant Science. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur Lipide sind nur in geringen Konzentrationen und können an andere Moleküle zur Solubilisierung gebunden. Dennoch kann die EDTA-erleichtert Ausschwitzen für die Sammlung von ausreichend Material zur Visualisierung (DC, Fig. 6) und identifizieren (LC-MS, Fig. 7) Phloem Lipide aus mehreren Pflanzenarten. Wie die Abbildung zeigt, ist es möglich, zu erkennen und zu trennen mehrere Lipide. LC-MS ermöglicht es, verschiedene Lipidspezies zu identifizieren und Veränderungen innerhalb der Lipid-Profile von differe überwachennt Genotypen oder Behandlungen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Lipiden der Pflanzenentwicklung und Stressantwort. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Abbildung 1. Ablaufschema der Sammlung Phloemexsudaten von Arabidopsis oder Perilla. Verschiedene Wege führen zu unterschiedlichen Endprodukten, die in blau angegeben. Für die Herstellung von RNA, RNase-Inhibitor (100 U / ml, Roche) mit dem Wasser, in das das Phloem Exsudat gesammelt worden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Abbildung 2. Aufbau von Materialien für Phloem Exsudat sammelnion. Das Setup zeigt alle Materialien für die Protokoll-Schritte 3.1-3.4 benötigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Abbildung 3 Proteine ​​in Phloem gefunden Ausscheidungen von zwei verschiedenen Pflanzenarten Arabidopsis (At) und Perilla (I und NI, verschiedene Längen Tag); MW: Molekulargewichtsmarker (Spur 2). Proteine ​​wurden unter Verwendung eines 10-20% Gradienten-SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Abbildung 4. Analysisdie Anwesenheit von mRNA für Rubisco kleinen und großen Untereinheit (Erythrozyten und RbcL, jeweils) und Ubiquitin konjugierendes Enzym (UBC). mRNA von Arabidopsis Blättern (L), Blattstiele (P) und Phloemexsudaten (Ph) wurde gesammelt, revers transkribiert und spezifisch Transkripte visualisiert unter Verwendung von PCR. Die Figur wurde von Guelette et al modifiziert. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Abbildung 5. GC-MS Profil Phloemexsudaten für unterschiedliche Höhe der Zeit gesammelt. Beachten Sie, wie die relative Menge von Saccharose Änderungen ab 1 Stunde Sammlung (A) bis 5 Stunden nach der Entnahme Zeit (B). Exsudat Profil nach der Sammlung für 1 Stunde mit dem &quot;Inkubation&quot; bei Zimmertemperatur gefolgt<html> (RT) für vier Stunden (C). Blatt Metabolitenprofil (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Abbildung 6. Dünnschichtchromatogram Vergleich Lipide aus Perilla (links) und Arabidopsis (rechts) Blätter und Phloemexsudaten. Sternchen zeigen Lipide spezifisch für Phloemexsudaten. DGDG: Digalactosyldiacylglycerol; PG: Phosphatidylglycerin; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, die Teil der Figur zeigt Arabidopsis Lipide aus Guelette et al modifiziert 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Abbildung 7. Lipid Profil Phloemexsudaten von Arabidopsis (Chloroform-Phase) mit LC-MS / Negativ-Ionen-Modus. Graphen in der oberen (Mutante, A) und unten (Wildtyp, B) zeigen die Unterschiede in den Lipid-Profile zwischen zwei verschiedenen Genotypen (durch Pfeile angedeutet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Die Kenntnis der Zusammensetzung des Phloemsaft sowie der Mechanismus ihrer Be-und Fernverkehr ist für das Verständnis der Langstrecken-Signalisierung in der Entwicklung von Pflanzen und Stress / Pathogen Reaktion und assimilieren Transport unerlässlich. Dieses Manuskript beschreibt die Sammlung von Phloemexsudaten mit der EDTA-Methode erleichtert.

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Floem-Exsudat von Arabidopsis oder anderen Pflanzen zu sammeln, um dessen Inhaltsstoffe zu analysieren oder das Vorhandensein bestimmter Verbindungen im Floem-Strom nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem man zunächst das Blütenblatt in Kalium-EDTA schneidet und inkubiert, um die Versiegelung des Siebelements zu verhindern. Der zweite Schritt besteht darin, das Blütenblatt gründlich zu waschen, um verbleibendes EDTA zu entfernen, das die nachfolgende Analyse stören und bei längerer Exposition auch Zellen schädigen könnte.Anschließend werden die fließenden EM-Exsudate in Wasser gesammelt. Hier ist der letzte Schritt die Probenvorbereitung für die anschließende Analyse mittels L-C-M-S-G-C-M-S-Gel, Elektrophorese und Dünnschichtchromatographie. Letztendlich kann die EDTA-vermittelte Phem-Exsudation verwendet werden, um den Phem-Gehalt an Metaboliten und Lipiden, Proteinen oder RNAs zu analysieren und zu bestätigen.Pflanzen können ungünstigen Bedingungen nicht entkommen. Daher benötigen sie sehr effiziente und schnelle Systeme, um Umweltsignale im gesamten Pflanzenkörper weiterzuleiten und durch Veränderungen der Entwicklung zu reagieren. Einer dieser Signalwege ist der Pflanzenfluss, dessen Zusammensetzung nur schwer zu verstehen ist.Wir verwenden die EDTA-unterstützte Fluss-Sedierung zur Gewinnung und Analyse von Flussinhalten. Die Methode wurde ursprünglich in Perilla von King entwickelt, kann aber leicht für andere Arten modifiziert werden. Elena und US, beide Studierende aus meinem Labor, werden das Verfahren vor Beginn dieses Protokolls demonstrieren.Züchten Sie Arabidopsis-Pflanzen vier bis sechs Wochen lang in Wachstumskammern mit einer 12-stündigen Lichtperiode am Tag der Probennahme. Verdünnen Sie zuvor hergestellte 100 Millimolar Kalium-EDTA-Lösung mit Wasser, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erhalten. Füllen Sie anschließend zwei Glasgefäße mit einem Durchmesser von sieben bis 15 Zentimetern zur Hälfte mit der 20 Millimolar Kalium-EDTA-Lösung.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, füllen Sie 1,7-Milliliter-Reaktionsgefäße mit 1,4 Milliliter der 20-Millimolar-Pottassium-EDTA-Lösung. Danach füllen Sie eine gleiche Anzahl von Reaktionsgefäßen mit 1,4 Milliliter Millipore-Wasser. Nachdem vier bis sechs Wochen alte Pflanzen aus den Wachstumskammern entnommen wurden, ernten Sie die Rosettenblätter, indem Sie diese mit einem Rasiermesser an der Basis des Blütenblattes nahe dem Zentrum der Rosette abschneiden.Legen Sie die Blätter unverzüglich in die Schalen mit 20 Millimolar Kalium-EDTA, wobei das Schnittende der Stiele in der Lösung eingetaucht sein muss. Sobald 15 Blätter von drei bis vier Pflanzen gesammelt wurden, stapeln Sie sie vorsichtig übereinander, sodass die geschnittenen Blütenstiele miteinander ausgerichtet sind. Schneiden Sie die Basis der Blütenstiele erneut an und rollen Sie die Blätter vorsichtig auf.Bringen Sie die gerollten Blätter anschließend vorsichtig in eines der Reaktionsröhrchen, die 20 Millimolar Kalium-EDTA zur Exsudatsammlung enthalten. Legen Sie den Boden einer großen flachen Schale in einer dunklen Umgebung mit feuchten Papiertüchern aus. Stellen Sie das Gestell mit den mit Blättern gefüllten Reaktionsröhrchen in die Schale und platzieren Sie diese in einer schwarzen Plastiktüte mit Schlitzen zur Belüftung.Stellen Sie danach die gesamte Apparatur zur Exsudatsammlung in einen Schrank. Legen Sie im Licht den Boden eines durchsichtigen Plexiglasbehälters mit feuchten Papiertüchern aus. Stellen Sie das Gestell mit den mit Blättern gefüllten Reaktionsgefäßen in den Behälter und schließen Sie diesen.Nachdem der Halter eine Stunde später aus dem Behälter entfernt wurde, entnehmen Sie die Blätter aus den Reaktionsröhrchen. Spülen Sie die Blätter gründlich mit destilliertem Wasser, um sämtliches EDTA zu entfernen. Überführen Sie die Blätter unverzüglich in Reaktionsröhrchen, die Millipore-Wasser enthalten, und stellen Sie sie zurück in die befeuchteten Behälter, um nach der Entnahme des Halters aus dem befeuchteten Behälter die Exsudate zu sammeln.Fünf bis acht Stunden später entnehmen Sie die Blätter aus den Röhrchen, gefrieren die Fluss-Exsudate in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie in einem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank. Zum weiteren Analysieren am folgenden Tag tauen Sie die Proben auf, um sie für die Lipidanalyse vorzubereiten. Anschließend entnehmen Sie zwei bis drei Proben und geben eine gleiche Menge Chloroform und Methanol zur kombinierten Lösung hinzu.Vortexen Sie die Mischung einige Sekunden lang. Zentrifugieren Sie danach die Probe vier Minuten bei 400 ×g. Sammeln Sie anschließend die untere organische Phase in einem Glasröhrchen, nachdem Sie die Phasentrennung dreimal erneut mit der oberen Phase durchgeführt haben, trocknen Sie die vereinigten organischen Phasen unter einem Stickstoffstrom und führen Sie eine Dünnschichtchromatographie sowie eine LC-MS-Analyse durch.Mithilfe dieser Methode lässt sich genügend Phloem-Exsudat gewinnen, um auf Phloem lokalisierte Proteine zu identifizieren und Veränderungen ihres Spiegels als Reaktion auf Entwicklung oder Stress zu untersuchen. In einigen Fällen kann es sinnvoll sein, Proteaseinhibitoren zu verwenden, um den Abbau von Proteinen zu verhindern. Wie hier gezeigt, sind Proteine zwar in sehr geringer Menge vorhanden, doch ihr Gehalt ist ausreichend für nachfolgende Proteomik-Experimente.Untersuchungen mittels LCMS oder Western Blot-Analysen an Kürbisgewächsen deuten darauf hin, dass das Durchtrennen des STEMS zu einer Störung des Wasserpotentialgleichgewichts und anschließendem Einfluss von Wasser sowie möglichen Kontaminanten aus dem Alast führt. Die Probensammlung über Zeiträume von einer bis acht Stunden beeinflusst jedoch nicht das Flussmuster des M-Proteins und dessen Zusammensetzung in OpSys. Die Menge des gesammelten Proteins sowie das Muster der nachgewiesenen Proteine variieren zwischen Arten und Behandlungen.Dadurch können Proteinsignale visualisiert, identifiziert und verfolgt werden. mRNA und microRNAs können mit dieser Methode ebenfalls in Flom-Exsudaten nachgewiesen werden. Eine Behandlung mit einem RNA-Inhibitor ist jedoch erforderlich, um den Abbau der mRNA während der verlängerten Exsudationszeit zu verhindern.Da die C-Elemente keine funktionellen Chloroplasten enthalten, können Rubis-, kleine oder große Untereinheit-mRNAs als negative Kontrollen verwendet werden, während eine bekannte, im Phloem lokalisierte mRNA wie die der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme als positive Kontrolle dienen kann. Ebenso können Zucker oder kleine Metaboliten entweder mittels GC-MS oder LC-MS analysiert werden. Es sollte erwähnt werden, dass die Phloem-Exsudate eine große Anzahl funktioneller Enzyme enthalten, darunter nahezu den gesamten glykolytischen Weg.Daher können mehrere Zeitpunkte Stoffwechselprozesse während der Exsudatsammlung aufzeigen. In allen Exsudaten ist Saccharose der häufigste Metabolit. Dies ist nach einer Sammlungsdauer von einer Stunde am deutlichsten.Jedoch wird nach fünf Stunden das Verhältnis von Saccharose zu Fruktose leicht verringert. Wenn derselbe Exsudat eine Stunde lang gesammelt und anschließend vier zusätzliche Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wird, reduziert sich das Verhältnis von Saccharose zu Fruktose deutlich stärker. Dies deutet darauf hin, dass aktive Enzyme in den Phloem-Exsudaten bei Raumtemperatur zum Abbau von Saccharose führen.Zusätzlich ist die Tatsache, dass eine kontinuierliche Sammlung über fünf Stunden nur eine geringe Abnahme des Saccharose-zu-Fructose-Verhältnisses zeigt, vereinbar mit Befunden, dass das Beladen der Phloemleiterzellen und der Transport von Molekülen aus den Begleitzellen in die Siebelemente während der Exsudation fortgesetzt werden kann, bis das System seine Vitalität verliert. Lipide in den Phloem-Exsudaten und damit verbunden auch die langstreckige Lipid-Signalübertragung sind ein relativ neues Forschungsfeld in der Pflanzenwissenschaft. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur liegen Lipide nur in geringen Konzentrationen vor und können an andere Moleküle gebunden sein, um Löslichkeit zu gewährleisten.Trotzdem ermöglicht die EDTA-vermittelte Exsudation die Gewinnung ausreichender Mengen, um Fluss und Lipide aus mehreren Pflanzenarten sichtbar zu machen und zu identifizieren. Wie hier gezeigt, ist es möglich, verschiedene Lipidarten mittels Dünnschichtchromatographie zu trennen. Die LC-MS ermöglicht die Identifizierung unterschiedlicher Lipidarten und die Überwachung von Veränderungen in den Lipidprofilen verschiedener Genotypen oder Behandlungen.Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Lipiden während der Pflanzenentwicklung und der Stressantwort. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von nur drei Stunden durchgeführt werden, sofern sie korrekt angewendet wird. Für die meisten Proben empfehlen wir jedoch eine Sammeldauer von fünf bis acht Stunden.In diesem Fall wird ein früher morgendlicher Beginn der Blattgewinnung empfohlen. Dieses Verfahren kann für andere Pflanzen angepasst werden und zur Entdeckung oder Bestätigung neuartiger Transportverbindungen führen. Während der Durchführung des Verfahrens ist darauf zu achten, die PDLs nach der ersten Stunde sorgfältig zu überwachen, um das EDTA zu entfernen, und die Blätter nicht zu auszuquetschen, um eine Kontamination mit Inhalt anderer Zellen zu vermeiden.Des Weiteren schützt das Tragen von Handschuhen Ihre Proben vor Kontaminationen, die Sie von Ihrer Haut her einbringen könnten. Um Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie die geeigneten Kontrollen für Protein-, RNA- oder Metabolitproben. Vorgeschlagene Kontrollen sind im Textprotokoll aufgelistet. Diese Methode hat es uns ermöglicht, neue Erkenntnisse über die Zusammensetzung des Pflanzenblütenstands zu gewinnen.Wir konnten mehrere Lipide im Formikausfluss identifizieren, die in der wässrigen Umgebung des Bodens nicht erwartet wurden. Dies führte uns und andere dazu, das Konzept der langstreckigen Lipidsignalgebung einzuführen, das sich mittlerweile zu einem spannenden neuen Forschungsfeld in der Implantatforschung entwickelt hat.

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Research

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Biology

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