Sammlung und Analyse von Arabidopsis Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Flomexsudat von Arabidopsis oder anderen Pflanzen zu sammeln, um seinen Inhalt zu analysieren oder das Vorhandensein von Verbindungen im Flomstrom zu bestätigen. Dies wird erreicht, indem das Blütenblatt zuerst geschnitten und in Kalium-EDTA inkubiert wird, um eine Versiegelung des Meereselements zu verhindern. Der zweite Schritt besteht darin, das Blütenblatt gründlich zu waschen, um verbleibende EDTA zu entfernen, die die anschließende Analyse beeinträchtigen und auch die Zellen bei längerer Exposition schädigen können.

Anschließend werden die EM-Exsudate der Strömung im Wasser gesammelt. Der letzte Schritt besteht darin, die Proben für die anschließende Analyse mittels L-C-M-S-G-C-M-S-Gel, Elektrophorese und Dünnschichtchromatographie vorzubereiten. Letztendlich kann die EDTA-erleichterte Phem-Exsudation verwendet werden, um Phem-Gehalte wie Metaboliten und Lipide, Proteine oder RNAs zu analysieren und zu bestätigen.

Pflanzen können sich widrigen Bedingungen nicht entziehen. Daher benötigen sie sehr effiziente und schnelle Systeme, um Umweltsignale in den Pflanzen zu übertragen und darauf mit einer Änderung der Entwicklung zu reagieren. Einer dieser Signalwege ist die Pflanzenströmung, deren Zusammensetzung recht komplex zu verstehen ist.

Wir verwenden die EDTA-erleichterte Flusssedierung für die Entnahme und Analyse von Flussinhalten. Es wurde ursprünglich in Perilla von King entwickelt und kann aber leicht für andere Arten modifiziert werden. Das Verfahren wird von Elena und US, beides Bachelor-Studenten aus meinem Labor, vor Beginn dieses Verfahrens demonstriert.

Grow Arabidopsis plant vier bis sechs Wochen in Wachstumskammern mit einer 12-stündigen Fotoperiode am Tag der Sammlung. Verdünnte die zuvor zubereitete 100 Millimolare Kalium-EDTA-Lösung mit Wasser, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erhalten. Füllen Sie anschließend zwei Glasschalen mit einem Durchmesser von sieben bis 15 Zentimetern zur Hälfte mit der 20 Millimolaren Kalium-EDTA-Lösung.

Wenn Sie fertig sind, füllen Sie 1,7 Milliliter Reaktionsgefäße mit 1,4 Millilitern der 20 Millimolaren Kalium-EDTA-Lösung. Füllen Sie dann eine gleiche Anzahl Reaktionsgefäße mit 1,4 Millilitern Milliporenwasser. Nachdem Du vier bis sechs Wochen alte Pflanzen aus den Wachstumskammern genommen hast, ernte die Rosettenblätter, indem Du sie mit einer Rasierklinge an der Basis des Blütenblattes in der Nähe der Mitte der Rosette abschneidest.

Legen Sie die Blätter sofort in die Schalen mit 20 millimolaren Kalium EDTA, wobei das abgeschnittene Ende der Blätter in die Lösung getaucht wird. Sobald du 15 Blätter von drei bis vier Pflanzen gesammelt hast, stapelst Du sie vorsichtig übereinander, so dass die abgeschnittenen Blütenblätter zueinander ausgerichtet sind. Schneiden Sie die Basis der Blütenblätter wieder ab und rollen Sie die Blätter vorsichtig ein.

Anschließend werden die ausgerollten Blätter vorsichtig in eines der Reaktionsröhrchen mit 20 millimolaren Kalium-EDTA zur Exsudatsammlung eingeführt. In der dunklen Linie den Boden einer großen, flachen Schüssel mit nassen Papiertüchern. Positionieren Sie das Gestell mit den mit Blättern gefüllten Reaktionsgefäßen in der Schale und legen Sie es zur Belüftung in eine schwarze Plastiktüte mit Schlitzen.

Stellen Sie dann das gesamte Setup in einen Schrank für die Exsudatsammlung. In der hellen Linie befindet sich der Boden eines durchsichtigen Plexiglasbehälters mit nassen Papiertüchern. Stellen Sie das Gestell mit den mit Blättern gefüllten Reaktionsgefäßen in den Behälter und verschließen Sie ihn.

Nachdem Sie das Gestell aus dem Behälter genommen haben, nehmen Sie eine Stunde später die Blätter aus den Reaktionsgefäßen. Waschen Sie die Blätter gründlich mit destilliertem Wasser, um das gesamte EDTA zu entfernen. Füllen Sie die Blätter sofort in die Reaktionsgefäße mit Millipore-Wasser und geben Sie sie nach Entnahme des Gestells aus dem befeuchteten Behälter zur Auffangung von Exsudaten in die befeuchteten Behälter zurück.

Fünf bis acht Stunden später nehmen Sie die Blätter aus den Röhren, frieren Sie dann die Ausscheidungen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Für die weitere Analyse am nächsten Tag tauen Sie die Proben auf, um sie für die Lipidanalyse vorzubereiten. Entnehmen Sie dann zwei bis drei Proben und geben Sie die gleiche Menge Chloroform und Methanol in die kombinierte Lösung.

Wirbeln Sie die Mischung einige Sekunden lang ein. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend vier Minuten lang bei 400 g. Wenn Sie fertig sind, sammeln Sie die untere organische Phase in einem Glasröhrchen, nachdem Sie die Teilung mit der oberen Phase drei weitere Male wiederholt haben, trocknen Sie die kombinierten organischen Phasen unter einem Stickstoffstrom und unterziehen Sie sie einer Dünnschichtchromatographie und LCMS-Analyse.

Diese Methode ermöglicht die Ernte von genügend Phem-Exsudaten, um Phem-lokalisierte Proteine und die Veränderungen ihres Spiegels als Reaktion auf Entwicklung oder Stress zu identifizieren. In einigen Fällen möchten Forscher möglicherweise Proteinase-Inhibitoren verwenden, um den Abbau von Proteinen zu verhindern. Wie hier gezeigt, sind Proteine in sehr geringer Häufigkeit, aber ihr Gehalt ist hoch genug für nachfolgende Proteomik-Experimente.

Mit Hilfe von LCMS oder für die Western-Blot-Analyse deuten Befunde bei Kürbisgewächsen darauf hin, dass das Durchtrennen des STEM-Wertes zu einer Störung des Wasserpotentialgleichgewichts und einem anschließenden Zufluss von Wasser und möglichen Schadstoffen aus dem Alast führt. Die Entnahme für einen Zeitraum von einer bis acht Stunden hat jedoch keinen Einfluss auf das Flow-M-Proteinprofil und die Zusammensetzung InOpSys. Die Menge des gesammelten Proteins und das Muster der gefundenen Proteine variieren je nach Spezies und Behandlung.

Dadurch können Proteinsignale visualisiert, identifiziert und verfolgt werden. Auch mRNA und microRNAs können mit dieser Methode in flom-Exsudaten identifiziert werden. Eine Behandlung mit RNAs-Inhibitoren ist jedoch notwendig, um eine Degradation der MRT zu verhindern. NA während der verlängerten Exsudationszeit.

Da die C-Elemente keine funktionellen Chloroplasten enthalten, können Rubis, kleine oder große Untereinheiten-mRNAs als Negativkontrollen verwendet werden, während bekannte pH-Grippe-m-lokalisierte mRNA wie das Ubiquitin-Konjugationsenzym als Positivkontrolle verwendet werden können. In ähnlicher Weise können Zucker oder kleine Metaboliten entweder mit GCMS oder LCMS analysiert werden. Zu erwähnen ist, dass die Phem-Exsudate eine Vielzahl von funktionellen Enzymen enthalten, die fast den gesamten glykolytischen Weg umfassen.

Daher kann die Verwendung mehrerer Zeitpunkte Stoffwechselprozesse während der Exsudatsammlung aufdecken. In allen Exsudaten ist Saccharose der am häufigsten vorkommende Metabolit. Am deutlichsten wird dies nach einer einstündigen Sammlung.

Nach fünf Stunden ist das Verhältnis von Saccharose zu Fruktose jedoch leicht reduziert. Wenn das gleiche Exsudat eine Stunde lang gesammelt und dann weitere vier Stunden auf der Bank belassen wird, reduziert sich das Verhältnis von Saccharose zu Fruktose in einem viel größeren Maße. Dies deutet darauf hin, dass aktive Enzyme in den Phemexsudaten zum Abbau von Saccharose bei Raumtemperatur führen.

Darüber hinaus steht die Tatsache, dass eine kontinuierliche Sammlung über fünf Stunden nur eine geringfügige Verringerung des Verhältnisses von Saccharose zu Fruktose zeigt, im Einklang mit den Befunden, dass die Phem-Beladung und der Transport von Molekülen aus Begleitzellen in die Meereselemente während der Exsudation fortgesetzt werden können, bis das System seine Vitalität verliert. Lipide in den Phem-Exsudaten und damit die Lipidsignalisierung über große Entfernungen sind ein relativ junges Interessengebiet in der Pflanzenwissenschaft. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur sind Lipide nur in geringen Konzentrationen vorhanden und können zur Solubilisierung an andere Moleküle gebunden werden.

Die EDTA-erleichterte Exsudation ermöglicht jedoch die Sammlung von ausreichend Material, um die Strömung und die Lipide verschiedener Pflanzenarten sichtbar zu machen und zu identifizieren. Wie hier gezeigt, ist es möglich, mehrere Lipidspezies mittels Dünnschichtchromatographie zu trennen. LCMS ermöglicht es, verschiedene Lipidspezies zu identifizieren und Veränderungen in den Lipidprofilen verschiedener Genotypen oder Behandlungen zu überwachen.

Dies ermöglicht es, die Rolle von Lipiden während der Pflanzenentwicklung und der Stressreaktion zu untersuchen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Für die meisten Proben empfehlen wir jedoch eine Entnahmezeit von fünf bis acht Stunden.

In diesem Fall empfiehlt sich ein frühmorgendlicher Start der Laubernte. Dieses Verfahren kann für andere Pflanzen modifiziert werden und zur Entdeckung oder Bestätigung neuartiger Fließverbindungen führen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die PDLs nach der ersten Stunde gründlich zu überwachen, um das EDTA zu entfernen, und die Blätter nicht zusammenzudrücken, um eine Kontamination mit dem Inhalt anderer Zellen zu vermeiden.

Darüber hinaus schützt das Tragen von Handschuhen Ihre Proben auch vor Verunreinigungen, die Sie von Ihrer Haut einbringen könnten. Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie die entsprechenden Kontrollen für Protein-RNA- oder Metabolitenproben. Die vorgeschlagenen Steuerelemente sind im Textprotokoll aufgeführt. Diese Methode hat es uns ermöglicht, neue Erkenntnisse über die Zusammensetzung des Pflanzenstroms zu gewinnen.

Wir konnten mehrere Lipide innerhalb des Formexsudats identifizieren, die im wässrigen Milieu des Bodens nicht zu erwarten waren. Dies veranlasste uns und andere, das Konzept der Lipidsignalisierung über große Entfernungen einzuführen, das sich nun zu einer aufregenden neuen Feldimplantatforschung entwickelt hat.