Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen oder Erythrozyten im Patientenserum zu bewerten. Dies wird durch Inkubation roter Blutkörperchen mit Patientenserum in Gegenwart von blockierenden Anti-C-5-Antikörpern erreicht, um die Ablagerung von C-4 und C3 auf der Erythrozytenoberfläche zu induzieren. Als nächstes werden die Erythrozyten mit fluoreszenzmarkierten Anti-C-4- und Anti-C3-Antikörpern gefärbt, und die Menge der Komplementablagerung auf den Erythrozyten kann dann durch Durchflusszytometrie in einer alternativen Methode analysiert werden.

Die Erythrozyten werden in Abwesenheit von Anti-C-5 mit Patientenserum inkubiert, um eine komplementvermittelte Lyse zu induzieren. Der Prozentsatz der lysierten Erythrozyten kann dann bestimmt werden, indem die Menge an Hämoglobin, die von den Zellen durch Spektrometrie freigesetzt wird, gemessen wird. Der Hauptvorteil dieser neuen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Hämolyse oder dem Antiglobulintest, die in der Routinediagnostik verwendet werden, besteht darin, dass sie quantitativer Natur ist und wir suboptimale Unterschiede in der Komplementaktivierung feststellen können.

Elizabeth Brook, Postdoktorandin in unserem Labor, wird Verfahren demonstrieren: Beginnen Sie damit, nulltypisierte rote Blutkörperchen dreimal mit PBS zu waschen, dann inkubieren Sie das Pellet 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 0,5%iger Roma-Lane-Lösung, nachdem Sie die Zellen drei weitere Male gewaschen haben, lagern Sie sie als 3%ige Lösung in frischem PBS bei vier Grad Celsius, um die Komplementablagerung auf den Erythrozyten durch Durchflusszytometrie zu analysieren. Inaktivieren Sie zunächst die gewünschte Menge des Patientenserums 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius, während das Serum wärmebehandelt wird. Waschen Sie die mit Brola behandelten roten Blutkörperchen nach der letzten Wäsche dreimal in Roal-Puffer.

Reanimation des Pellets in vbg plus plus mit einer Verdünnung von 0,5 %. Als nächstes an einer Glasperle, 25 Mikroliter mit 0,5 % Erythrozyten, 37,5 Mikroliter frisches AB-Serum und 37,5 Mikroliter mit 200 Mikrogramm pro Milliliter, Anti-C fünf auf jede Vertiefung einer 96 Vertiefung runden Bodenplatte. Geben Sie dann das hitzeinaktivierte Patientenserum in der entsprechenden Konzentration in jede Vertiefung und ergänzen Sie es bei Bedarf mit hitzeinaktiviertem AB-Serum und einschließlich einer Negativkontrolle.

Mit VBG plus plus bringen Sie jede Vertiefung auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern und inkubieren Sie die mit E IA-Folie abgedeckte Platte dann eineinhalb bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, das mit 0,5 % BSA ergänzt ist, und markieren Sie die Zellen dann mit einem Mikrogramm pro Milliliter. Ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Anti-C3- und Anti-C-Vier-Antikörper inkubiert die Zellen 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln und resuspendiert dann nach dreimaligem Waschen der Platte die Erythrozyten in 150 Mikrolitern PBS plus 0,5 % BSA pro Stück.

Übertragen Sie die Zellsuspensionen in eine neue runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen, laden Sie die Platte dann auf das Durchflusszytometer, trennen Sie die einzelnen Zellen von den Dubletten mit einem Vorwärtsstreudiagramm. Stellen Sie das Gate auf die einzelnen RBCs ein und wählen Sie dann den entsprechenden Detektionskanal für die Fluoreszenzsignale aus. Quantifizieren Sie die Ergebnisse anhand der medianen Fluoreszenzintensität für die quantitative hämolytische Analyse, erhitzen und aktivieren Sie das Patientenserum und waschen Sie die mit Romain behandelten Erythrozyten, wie gerade gezeigt.

Nach der Inkubation der Erythrozyten mit Komplement- und Patientenserum, wie gerade gezeigt, aber ohne das Anti-C-Fünf, drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 664 GS mit reduzierter Verzögerung herunter. Als nächstes werden vorsichtig 90 Mikroliter Überstand auf eine neue Mikrotiterplatte übertragen, wobei darauf geachtet wird, dass die intakten Zellen nicht übertragen werden und keine Luftblasen entstehen, und dann die Absorption bei vier 14 bis sechs 90 in einem Spektralphotometer express messen. Die Hämolyse als Prozentsatz der Lyse einer Probe von Erythrozyten, die in reinem Wasser inkubiert wurde.

In dieser ersten Abbildung sind repräsentative Streudiagramme für mit Brola behandelte Erythrozyten dargestellt. Hier ist ein geeignetes Gating für einzelne Erythrozyten zu sehen. In der Regel fallen etwa 95 % der Erythrozyten in dieses Einzelzell-Gate. In diesen Histogrammen finden repräsentative Befunde für die Wirkung der autoimmunhämolytischen Anämie oder Aha.

Patientenserum auf C-4- und C3-Ablagerung wird wie erwartet gezeigt, mehr Patientenserum führt zu mehr Komplementablagerung. Kurioserweise erfolgt die Komplementablagerung in zwei unterschiedlichen positiven Peaks. Dies ist wahrscheinlich nicht auf die Heterogenität in der Erythrozytenpopulation zurückzuführen, da die Erythrozyten von einem einzigen Donor entnommen werden, obwohl die Ursache dieses Phänomens noch untersucht wird, die medianen Fluoreszenzintensitäten der Proben in diesen Liniendiagrammen aufgetragen werden, um die Reproduzierbarkeit der C-4- und C3-Abscheidungsassays zu zeigen.

Beachten Sie die große Variation in der Abscheidung der verschiedenen AH H-Patientenproben. Schließlich können in diesen Diagrammen Daten aus einem hämolytischen Assay einer Ahha-Patientenserumprobe mit Autoantikörpern gegen Erythrozyten beobachtet werden. Die Titration mit der Serumprobe ergibt eine klare, reproduzierbare Kurve mit einem geeigneten Komplementinhibitor wie z. B. Anti-C-Fünf.

Das hämolytische Signal kann wegtitriert werden, wie in dieser Grafik gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Komplementaktivierung durch spezifische Antikörper gegen rote Blutkörperchen gemessen werden kann, entweder durch durchflusszytometrische Analyse der C3- oder C-Vier-Ablagerung oder durch einen quantitativen hämolytischen Assay.