Name: Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Lernen Sie quantitative Methoden zur Bestimmung antikörperinduzierter Komplementaktivierung auf Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie und spektrometrischer Hämoglobinmessung. Diese Techniken ermöglichen präzise diagnostische Aussagen.

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SZ und DW erhalten eine zweckgebundene Zuwendung von Viropharma.

1. Herstellung von Bromelain-behandelten roten Blutzellen <ol><li> Waschen 0 typisierte roten Blutkörperchen 3x mit 1x PBS (Zentrifugation bei 664 g für 2-5 min). </li><li> Inkubieren 1 Volumen Erythrozytenkonzentrat mit zwei Volumina einer 0,5% Bromelain Lösung für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS. </li><li> Die Zellen können als eine 3% ige Lösung bei 4 ° C in 1 × PBS für mindestens eine Woche gelagert werden. </li></ol> 2. C3 und C4 Deposition Analyse auf RBCs durch FACS <ol><li> Wärme-Inaktivierung die erforderliche Menge an Patientenserum (oder andere anti-RBC Antikörper Quelle) durch Erhitzen der Probe für 30 min bei 56 ° C. </li><li> Dreimal waschen Bromelain behandelten Erythrozyten in VBG - (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% Gelatine, pH 7,4) und resuspendieren sie in VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl 2 + 10 mM CaCl 2), um ein zu geben 0,5% igen Lösung. </li><li> Pipettieren Sie die folgenden Komponenten in einem Rundbodenplatte mit einer Glasperle (foder richtige Mischung): 25 ul 0,5% Erythrozyten, 37,5 ul frisch AB-Serum (Komplement-Quelle) und 37,5 ul 200 ug / ml anti-C5. Anti-C5 ist teuer und vielleicht schwer zu bekommen sein. Man könnte überlegen, C5-/C6-/C7- oder C8-defizienten Serum anstelle von AB-Serum und Anti-C5. </li><li> Hinzufügen Patientenserum pro Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 33%. Richtige für Unterschiede in der Serumkonzentration pro Vertiefung durch Verwendung von hitzeinaktiviertem AB-Serum. In VBG + +, um eine endgültige Volumen von 150 ul / gut. Schließen ELISA-Platte mit Folie. </li><li> Inkubieren 1,5-2 h bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Die Erythrozyten dreimal mit PBS + 0,5% BSA (Zentrifugation bei 664 × g für 2 min) waschen. </li><li> Hinzufügen fluoreszenzmarkierten anti-C3 und C4 monoklonalen anti-Antikörper oder deren Fab-Fragmente in PBS + 0,5% BSA bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml (um die Agglutination zu verringern). Hier speziell entwickelte Anti-C3-Alexa Fluor 488 und Anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonale Antikörper verwendet werden, die Wahl der these fluoreszierenden Markierungen erlaubt die gleichzeitige Detektion von C3 und C4 durch FACS. </li><li> Inkubiere 30-45 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. </li><li> Wash Erythrozyten 3x mit PBS + 0,5% BSA. </li><li> Resuspendieren RBC 150 ul in PBS + 0,5% BSA und pipettieren sie in eine neue Platte (auf der Glasperlen loswerden, bevor FACS Analyse). </li><li> FACS-Analyse durchführen. Separate Einzelzellen von Dubletten in einem Streu Plotten FSC-A; setzen das Tor zu den einzelnen Erythrozyten, wählen Sie die entsprechende Detektionskanal für die Fluoreszenz-Signale (z. B. FITC und APC). </li><li> Quantifizieren Ergebnisse mit dem Median der Fluoreszenzintensität. </li></ol> Hinweis: Es ist möglich, eine Isotyp-Kontrolle (zB Fluoreszenz-markierten anti-IL-6-Maus-IgG1) zu verwenden. Es wird jedoch empfohlen, um eine echte Negativkontrolle zB durch Inkubation von Erythrozyten ohne Patientenserum (nur AB-Serum) oder ohne Ergänzung Quelle (hitzeinaktiviertem AB-Serum und Hitze-inaktiviertes Patientenserum) gehören, eind dann färben diese mit der gleichen anti-C3-Alexa Fluor 488 und Anti-C4-Alexa Fluor 647-Antikörper. Dies ergibt eine weitere gültige Steuer als eine Isotyp-Kontrolle im Falle der roten Blutzellen 12, wobei diese verschiedenen Steuerungen geben typischerweise die gleichen, negativen Ergebnis. 3. Quantitative hämolytisch-Assay <ol><li> Wärme-Inaktivierung die erforderliche Menge von Patientenseren (oder andere anti-RBC Antikörper Quelle) durch Erhitzen der Probe 30 min bei 56 ° C. </li><li> Wash Erythrozyten 3x VBG - und einmal mit VBG + +. </li><li> Pipettieren Sie die folgenden Komponenten in einem Rundbodenplatte mit einer Glasperle (für die richtige Durchmischung): 35 ul 3% Erythrozyten, 25 ul frisch AB-Serum (Komplement-Quelle) und 1-50% Patientenserum. Richtige für Unterschiede im Serum-Konzentration mit hitzeinaktiviertem AB-Serum. In VBG + +, um eine endgültige Volumen von 150 ul / gut. Schließen ELISA-Platte mit Folie. </li><li> Bei 37 ° C für 1,5 bis 2 h mit Schütteln. </li><li> Centrifuge Platte bei 664 × g für 5 min mit reduzierten Verzögerung (z. B. Verzögerung zu Punkt in 2-3 min). </li><li> Vorsichtig pipettieren, 90 ul Überstand in eine neue Mikrotiterplatte. Es ist wichtig, in diesem Schritt, um Luftblasen zu verhindern und um zu verhindern, entlang intakten Zellen zu übernehmen. </li><li> Messen Sie A414/690 in einem geeigneten Spektrophotometer. </li><li> Ausdruck der Lyse in Prozent Lyse einer Probe RBCs mit reinem Wasser. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die obigen Tests sind reproduzierbar und stabil. Sie sind einfach durchzuführen und es ist möglich, sie mit vielen Proben gleichzeitig (in einer 96-well-Platte) durchzuführen. Daher würde dieser Ansatz auch für ein vollautomatisches System, z. B. eine ELISA-Robotersystem. Im Gegensatz zu den gegenwärtig verwendeten Techniken sind diese Assays quantitativ und dies wird in der Studie über die Wirkung von Komplement-Inhibitoren helfen zB. Außerdem ist die objektive Interpretation, welche eine Verbesserung...

Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) durch Transfusion von roten Blutkörperchen, die ein Antigen, das nicht auf Empfänger RBCs vorhanden ist exprimieren, induziert werden. Diese Allo-Antikörper können schwere akute hämolytische Transfusionsreaktionen aufgrund der Aktivierung auf die nach der Transfusion 5 ergänzen verursachen. In Auto-Immun-hämolytische Anämie (AIHA) haben die Patienten Auto-Antikörper gegen ihre eigenen roten Blutkörperchen. Dies führt zu einer beschleunigten Clearance der Zellen durch die Interaktion von IgG mit Fc &amp;ggr; RBC-Rezeptoren auf Phagocyten in der Milz und / oder im Falle von Autoantikörpern in der Lage, mittels Komplement-Komplement-Rezeptoren in der Leber 6,7 aktivieren gebunden. Fulminante Komplement-Aktivierung intravaskulären Hämolyse was ist selten, aber oft tödlich. Beschleunigte ergänzen vermittelten RBC Zerstörung entweder durch Allo-oder Autoantikörpern führt zu akuter Anämie und damit potenziell tödlichen Hypoxie induziert. Die Autoantikörper in AIHA sind in warmen und kalten Antikörper eingestuft, dependinG auf der optimalen Temperatur sie Erythrozyten (37 ° C oder geringer) zu binden. Die warmen Antikörper sind in der Regel von IgG-Isotyp und die kalten Antikörper vom IgM-Isotyp 8,9. AIHA kann sekundär zB lymphoprolyferative Erkrankungen, Bindegewebserkrankungen, soliden Tumoren, Infektionen oder Medikamente sein, aber in 50% der Fälle ist idiopathischen AIHA 9. Detektion Gammaglobuline (zB. IgG oder IgM) und Komplement gebunden Patienten RBCs mittels einer semiquantitativen direkten Antiglobulin (Coombs)-Test (DAT) durchgeführt. In dem DAT-Patienten RBCs mit Anti-IgG-oder Anti-C3d inkubiert. Das Auftreten von RBC Agglutination zeigt die Anwesenheit von Komplement-Komponenten befestigt oder IgG-Bindung. Nachweis von Allo-oder Autoantikörpern im Serum des Patienten wird mittels der indirekten Antiglobulintest (IAT) durchgeführt. In der IAT werden Bromelain behandelten Test RBCs mit Patientenserum inkubiert, gewaschen und dann mit anti-h inkubiertuman IgG. Im Falle haben RBCs mit Anti-RBC-IgG, die in dem Patientenserum Agglutination auftritt sensibilisiert. IgM-Antikörper gegen Erythrozyten wird direkt an Agglutination nach der Inkubation von Bromelain-behandelten Test Erythrozyten mit Patientenserum führen. RBC Agglutination in der direkten Coombs-Test oder im IAT wird optisch entweder mit dem Auge in einem Reagenzglas oder durch das Laden der Probe auf einer kleinen Sephadexsäule Trennung agglutinierten Erythrozyten-und Einzel nach Größe 1 bewertet. Ein anderes häufig verwendetes Verfahren zur Komplementaktivierung auf RBCs messen, ist der hämolytischen Assay 1, bei dem die Kapazität von Patientenserum (Komplement-vermittelte) Hämolyse von Bromelain behandelten RBC 10 zu induzieren, beurteilt. Der Test wird als positiv festgestellt, wenn der Überstand nach dem Zentrifugieren wird rot wegen freigesetzte Hämoglobin gefärbt und als negativ zu sein, wenn es farblos bleibt. Sowohl das Coombs-Test und der Test sind hämolytische semiquantitative, da die höchste serum Verdünnung bezeichnet, in dem der Test ist immer noch positiv. Der Coombs-Test und dem hämolytisch-Assay sind robust Tests, die routinemäßig in der Diagnostik eingesetzt werden. Da diese Tests sind semiquantitative und abhängig von der Erfahrung des Technikers Durchführung des Assays sie geeignet ist, subtile Unterschiede der Komplementaktivierung auf Erythrozyten zu untersuchen sind nicht, wie erforderlich, wenn die Bewertung der Wirksamkeit von Komplement-Inhibitoren. Daher entwickelten wir zwei quantitative Tests, um die Komplement-Aktivierung von (Auto-) Antikörper gegen Erythrozyten, die wir in diesem Papier beschreiben, zu bestimmen. Zuerst wird ein Test, um die Ablagerung von Komplement-Aktivierung Fragmente C3 und C4 auf RBCs (1A) messen wir entwickelt. In diesem Test werden menschliche Bromelain behandelten Typ 0 RBCs mit hitzeinaktiviertem Patientenserum (anti-RBC Antikörper Quelle), frisch AB-Serum (Komplement-Quelle) und Anti-C5-Antikörper (Eculizumab) inkubiert. Während dieser inc.ubation wird C3 und C4 Abscheidung auftreten, wenn das Patientenserum enthält ergänzen Aktivierung anti-RBC Antikörper. Um RBC Lyse durch nachgeschaltete Komplementaktivierung verhindern eine Sperr Anti-C5-monoklonaler Antikörper wird hinzugefügt. Als nächstes wird C3 und C4 Abscheidung auf der RBCs durch FACS unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmenten Umsetzung mit C3 und C4, die jeweils detektiert. Gating auf einzelne Erythrozyten ist wichtig, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Vorteile dieses Verfahrens beinhalten, dass ein kleines Volumen des Patientenmaterials erforderlich ist, Komplementaktivierung in einer frühen Stufe der Kaskade bewertet wird und das Verfahren ist reproduzierbar und quantitativ. Ein weiterer Vorteil der Blick auf beide C3 und C4 ist, dass eine Unterscheidung zwischen der klassischen und Lektin-Weg-Aktivierung (sowohl C3-und C4-Deposition) und den alternativen Weg der Aktivierung (nur C3 Deposition) hergestellt werden. Die Verwendung von Bromelain behandelten Erythrozyten statt unbehandelten roten Blutkörperchen erhöht die Empfindlichkeit der alszu sagen. Der zweite Test basiert auf der gegenwärtig verwendeten hämolytischen Assay (Fig. 1B) auf. Menschen Bromelain-behandelten Typ-0-Erythrozyten werden mit Hitze-inaktiviertem Patientenserum (anti-RBC Antikörper-Quelle) und frischem AB-Serum (Komplement-Quelle) inkubiert. Wenn Komplement von Patienten anti-RBC-Antikörper aktiviert, wird eine dosisabhängige RBC-Lyse auftreten, was zu der Hämoglobin freizusetzen. Die Menge an freigesetztem Hämoglobin wird durch Messen seiner Absorption bei 414 nm im Überstand nach Abzentrifugieren der intakten und fragmentierten Erythrozyten quantifiziert. Die Extinktion korreliert mit der Menge der Hämolyse aufgetreten. Im Gegensatz zu den derzeit verwendeten Assay erlaubt eine objektive, quantitative Wert der Hämolyse, die sehr gut reproduzierbar und unabhängig von der Person, die Interpretation des Assays ist das Protokoll. Eine Anwendung dieser Methoden ist in 11, wobei die mögliche Verwendung von C1-Inhibitor als Komplement-Inhibitor in AIHA war s beschriebentudied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Diese Chemikalie unterliegt der Arzneimittelregulierung.</td></tr><tr><td>Natrium Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Diese Chemikalie unterliegt der Arzneimittelregulierung.</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 Amin-Reaktivfarbstoff</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 Amin-Reaktivfarbstoff</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmazeutika</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Es kann jedes FACS verwendet werden, das über die entsprechenden Laser verfügt.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer (z.B. Multiskan-Spektrum)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Jedes Spektralphotometer mit dem richtigen Wellenlängenbereich kann verwendet werden</td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Jede kompatible FACS-Analysesoftware kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Bromelain&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

methoden für die quantitative bestimmung von antikörper-induzierte komplementaktivierung auf red blood cells

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) kann dazu führen, Aktivierung, was zu einer beschleunigten Genehmigungs über Komplement-Rezeptoren in der Leber (extravaskulären Hämolyse) oder die zu intravaskulären Lyse von Erythrozyten zu ergänzen. Alloantikörper (zB ABO) oder Autoantikörper gegen RBC-Antigene (wie in der Autoimmun-hämolytische Anämie, AIHA zu sehen), die zur Aktivierung ergänzen sind potenziell schädlich und kann - vor allem, wenn die zu intravaskulären Lyse - tödlichen ein. Derzeit Komplement-Aktivierung durch (auto)-Antikörpern auf Erythrozyten in vitro mit Hilfe der Coombs-Test reflektierende Ergänzung Abscheidung auf RBC oder durch eine nicht-quantitative Assay hämolytische reflektieren RBC Lyse 1-4 bewertet. Um jedoch die Wirksamkeit von Inhibitoren Ergänzung zu bewerten, ist es zwingend erforderlich, um quantitative Techniken haben. Hier beschreiben wir zwei solche Techniken. Zuerst wird ein Test zur C3 und C4 Abscheidung auf rote Blutzellen, die von Antikörpern in Patientenserum induziert wird erkennen vorgepräsentierte. Hierzu ist die FACS-Analyse mit Fluoreszenz-markierten anti-C3-oder Anti-C4 Antikörper verwendet. Als nächstes wird eine quantitative hämolytischen Assay beschrieben. In diesem Assay Komplement-vermittelte Hämolyse von Patientenserum induziert ist die Nutzung der spektrophotometrischen Nachweis des freigesetzten Hämoglobins gemessen. Diese beiden Tests sind sehr reproduzierbare und quantitative erleichtert Untersuchungen der Antikörper-induzierten Komplementaktivierung.

2A zeigt eine repräsentative Streudiagramm für Erythrozyten. FSC-A-Grundstück (P1) - Geeignet für Einzel Gating Erythrozyten in de FSC-W zu sehen. In der Regel rund 95% der roten Blutkörperchen, gehören zu dieser P1-Gate (Einzelzellen), aber wenn ein hoher Prozentsatz der Patientenserum verwendet wird, kann diese auf 70-80% sinken, vor allem, wenn anti-RBC IgM im Serum des Patienten vorhanden ist. Repräsentative Ergebnisse für die Wirkung von Patientenserum auf AIHA C4 Absch...

Hier beschreiben wir zwei Assays zur Messung von Komplement-Aktivierung durch Antikörper gegen rote Blutzellen induziert. Der große Vorteil gegenüber den aktuellen Untersuchungen ist die quantitative und einfach zu interpretieren Natur.

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen oder RBCs im Patientenserum zu bewerten. Dies wird erreicht, indem rote Blutkörperchen mit Patientenserum in Gegenwart eines blockierenden Anti-C5-Antikörpers inkubiert werden, um die Ablagerung von C4 und C3 auf der Oberfläche der RBCs zu induzieren. Anschließend werden die RBCs mit fluoreszenzmarkierten Anti-C4- und Anti-C3-Antikörpern gefärbt, und die Menge der Komplementablagerung auf den RBCs kann dann mittels Durchflusszytometrie in einer alternativen Methode analysiert werden.Die Erythrozyten werden mit Patientenserum in Abwesenheit von Anti-C5 inkubiert, um eine komplementvermittelte Lyse zu induzieren. Der Prozentsatz der lysierten Erythrozyten kann anschließend durch Messung der von den Zellen freigesetzten Hämoglobinmenge mittels Spektrometrie bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser neuen Methode gegenüber etablierten Verfahren wie dem Hämolysetest oder dem Antiglobulintest, die in der routinemäßigen Diagnostik verwendet werden, liegt darin, dass sie quantitativer Natur ist und wir suboptimale Unterschiede in der Komplementaktivierung nachweisen können.Elizabeth Brook, Postdoktorandin in unserem Labor, wird die Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie damit, nicht typisierte rote Blutkörperchen dreimal mit PBS zu waschen, anschließend inkubieren Sie das Pellet 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer 0,5%igen Roma-Lane-Lösung im Verhältnis 1:2. Nachdem die Zellen weitere drei Mal gewaschen wurden, lagern Sie sie als 3%ige Lösung in frischem PBS bei 4 Grad Celsius. Um die Komplementablagerung auf den Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, heizen Sie zunächst die gewünschte Menge an Patientenserum 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius zur Inaktivierung auf, während das Serum erhitzt wird. Waschen Sie die Brola-behandelten roten Blutkörperchen danach dreimal im Roal-Puffer. Nach dem letzten Waschschritt.Suspendieren Sie das Pellet in VB-G plus plus in einer Verdünnung von 0,5 %. Geben Sie anschließend in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte 25 Mikroliter 0,5 %iger Erythrozyten, 37,5 Mikroliter frisches AB-Serum und 37,5 Mikroliter einer 200 Mikrogramm pro Milliliter Anti-C5-Lösung. Fügen Sie dann das hitzeinaktivierte Patientenserum in der entsprechenden Konzentration zu jedem Loch hinzu, ergänzen Sie gegebenenfalls mit hitzeinaktiviertem AB-Serum und führen Sie ebenfalls eine negative Kontrolle durch.Verwenden Sie VBG plus plus, um jedes Loch auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern aufzufüllen, und inkubieren Sie die Platte danach eineinhalb bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, abgedeckt mit E IA-Folie. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, ergänzt mit 0,5 % BSA, und markieren Sie anschließend die Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter einer fluoreszenzmarkierten anti-C3- und anti-C4-Einzelklon-Antikörperlösung. Inkubieren Sie die Zellen 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln. Nach dreimaligem Waschen der Platte resuspendieren Sie die Erythrozyten in 150 Mikrolitern PBS plus 0,5 % BSA pro Probe.Überführen Sie die Zellsuspensionen in eine neue 96-Well-Rundbodenplatte und laden Sie die Platte anschließend auf den Durchflusszytometer. Trennen Sie die Einzelzellen von den Doppelzellen mithilfe eines Forward-Scatter-Plots. Setzen Sie das Gate auf die einzelnen Erythrozyten und wählen Sie dann den geeigneten Detektionskanal für die fluoreszenten Signale aus. Quantifizieren Sie die Ergebnisse anhand der medianen Fluoreszenzintensität für die quantitative hämolytische Analyse, erhitzen und aktivieren Sie das Patientenserum und waschen Sie die mit Romaine behandelten Erythrozyten, wie zuvor gezeigt. Danach, nach der Inkubation der Erythrozyten mit Komplement und Patientenserum, wie gerade gezeigt, jedoch ohne das Anti-C5, die Zellen fünf Minuten bei 664 ×g mit reduzierter Verzögerung abzentrifugieren. Anschließend vorsichtig 90 Mikroliter Überstand in eine neue Mikrotiterplatte überführen, wobei darauf geachtet werden muss, keine intakten Zellen zu übertragen und die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und dann die Absorption bei 414 bis 690 nm in einem Spektralphotometer messen. Die Hämolyse wird als Prozentsatz der Lyse einer Probe von Erythrozyten angegeben, die in reinem Wasser inkubiert wurden.In dieser ersten Abbildung sind repräsentative Streudiagramme für mit Brola behandelte Erythrozyten dargestellt, bei denen eine geeignete Gating-Strategie für einzelne Erythrozyten zu sehen ist. Typischerweise fallen etwa 95 % der Erythrozyten in dieses Einzelzell-Gate. In diesen Histogrammen sind repräsentative Ergebnisse zur Wirkung der autoimmunen hämolytischen Anämie oder AHA dargestellt.Die Komplementablagerung durch Patientenserum auf C4 und C3 zeigt wie erwartet: Je mehr Patientenserum verwendet wird, desto stärker ist die Komplementablagerung. Auffällig ist, dass die Komplementablagerung in zwei deutlich getrennten positiven Peaks auftritt. Dies liegt wahrscheinlich nicht an einer Heterogenität der Erythrozytenpopulation, da die Erythrozyten von einem einzigen Spender stammen. Obwohl die Ursache dieses Phänomens noch untersucht wird, wurden die medianen Fluoreszenzintensitäten der Proben in diesen Liniendiagrammen dargestellt, um die Reproduzierbarkeit der C4- und C3-Ablagerungsassays zu veranschaulichen.Beachten Sie die große Variabilität bei der Ablagerung der verschiedenen AH H-Patientenproben. Schließlich können in diesen Diagrammen Daten aus einem hämolytischen Assay einer ahha-Patientenserumprobe beobachtet werden, die Autoantikörper gegen rote Blutkörperchen enthält. Die Titration mit der Serumprobe ergibt eine klare, reproduzierbare Kurve mit einem geeigneten Komplementinhibitor wie Anti-C5.Das hämolytische Signal kann wie in dieser Grafik gezeigt titriert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Komplementaktivierung durch erythrozytenspezifische Antikörper gemessen werden kann, entweder durch die Durchflusszytometrie-Analyse der Ablagerung von C3 oder C4 oder durch einen quantitativen hämolytischen Assay.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der klassische Weg wird durch Antikörper aktiviert und gipfelt in Ziel-Zell-Lyse. Die...

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren...

Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Dieses Video zeigt eine Technik zur Bewertung der komplementvermittelten bakteriziden Aktivität von Antikörpern, die im Serum vorhanden sind. Dieser Ansatz kombiniert isoliertes Serum mit pathogenen Bakterien und exogenen Komplementproteinen. Nach der Inkubation werden die Bakterien auf einer Agarplatte gezüchtet und die produzierten Kolonien quantifiziert, um den bakteriziden Serumtiter zu messen.

Ein bakterizider Serumassay für die komplementvermittelte bakterizide Aktivität von Antikörpern

Das Video zeigt einen Hämagglutinations-Inhibitions-Assay zum Nachweis von Serum-Antikörpern gegen spezifische Antigene. Die Bestätigung der Hämagglutinationshemmung in der Testvertiefung und der Hämagglutination in der Kontrollvertiefung wird durch unterschiedliche visuelle Muster erreicht. Dieser Assay spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Immunantwort, der Wirksamkeit von Impfstoffen und der Untersuchung von Virusinfektionen in der Virologie und Immunologie.

Der Hämagglutinationshemmungsassay zum Nachweis von Serumantikörpern gegen ein Zielantigen

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Antikörper-vermittelte Aktivierung von T-Zell-Effektorfunktionen misst. Die Zugabe eines Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-spezifischen monoklonalen Antikörpers zu transfizierten Säugetierzellen, die HA exprimieren, führt zur Bildung von Immunkomplexen mit HA. Nach der Einführung von gentechnisch veränderten T-Zellen, die Fc-Rezeptoren und einen Luciferase-Reporter exprimieren, werden die T-Zellen durch die Antikörper-HA-Komplexe aktiviert, und diese...

Messung der Aktivierung von Fc-vermittelten Effektorfunktionen durch HA-Antikörper

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten. Fluoreszenzmarkierte Mikrosphären, die an einen Antigen-Antikörper-Komplex konjugiert sind, werden mit einer aus der Muttermilch isolierten Zellsuspension kombiniert, um eine Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose durch die phagozytischen Leukozyten zu induzieren. Nach der Markierung der Zellen mit Antikörpern gegen das gemeinsame Leukozytenantigen (CD45) wird die...

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose durch Phagozyten

Der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ist ein In-vitro-Assay, der isolierte primäre Monozyten aus dem peripheren Vollblut von Säugetieren verwendet, um die Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelte Phagozytose zu bewerten.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Das Ziel dieser Methode ist es, die CR1-Dichte in den Erythrozyten eines jeden Probanden zu bestimmen, indem man mit drei Probanden vergleicht, deren Erythrozyten-CR1-Dichte bekannt ist. Die Methode verwendet Durchflusszytometrie nach Immunfärbung der Erythrozyten der Probanden durch einen monoklonalen Anti-CR1-Antikörper, der mit einem verstärkten System mit Phycoerythrin (PE) gekoppelt ist.

Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie

Die Erfassung dynamischer Veränderungen in der Proteinaktivierung entkernter roter Blutkörperchen stellt methodische Herausforderungen dar, wie z.B. die Konservierung dynamischer Veränderungen akuter Stimuli für eine spätere Bewertung. Das vorgestellte Protokoll beschreibt Probenvorbereitungs- und Färbetechniken, die die Konservierung und Analyse relevanter Proteinveränderungen und den anschließenden Nachweis ermöglichen.

Immunfärbungsbasierter Nachweis dynamischer Veränderungen in Erythrozytenproteinen

Wir haben Verbesserungen und aktualisierte Methoden für den bestehenden Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) entwickelt, bei dem Makrophagen verwendet werden, um die klinische Relevanz von Erythrozyten-Alloantikörpern in der Transfusionsmedizin und Immunologie besser vorhersagen zu können. Dieser Assay wird als Monozyten-Makrophagen-Assay (M-MA) bezeichnet.

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Lernen Sie quantitative Methoden zur Bestimmung antikörperinduzierter Komplementaktivierung auf Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie und spektrometrischer Hämoglobinmessung. Diese Techniken ermöglichen präzise diagnostische Aussagen.

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

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