Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells
29. Januar 2014
Hier beschreiben wir zwei Assays zur Messung von Komplement-Aktivierung durch Antikörper gegen rote Blutzellen induziert. Der große Vorteil gegenüber den aktuellen Untersuchungen ist die quantitative und einfach zu interpretieren Natur.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen oder RBCs im Patientenserum zu bewerten. Dies wird erreicht, indem rote Blutkörperchen mit Patientenserum in Gegenwart eines blockierenden Anti-C5-Antikörpers inkubiert werden, um die Ablagerung von C4 und C3 auf der Oberfläche der RBCs zu induzieren. Anschließend werden die RBCs mit fluoreszenzmarkierten Anti-C4- und Anti-C3-Antikörpern gefärbt, und die Menge der Komplementablagerung auf den RBCs kann dann mittels Durchflusszytometrie in einer alternativen Methode analysiert werden.
Die Erythrozyten werden mit Patientenserum in Abwesenheit von Anti-C5 inkubiert, um eine komplementvermittelte Lyse zu induzieren. Der Prozentsatz der lysierten Erythrozyten kann anschließend durch Messung der von den Zellen freigesetzten Hämoglobinmenge mittels Spektrometrie bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser neuen Methode gegenüber etablierten Verfahren wie dem Hämolysetest oder dem Antiglobulintest, die in der routinemäßigen Diagnostik verwendet werden, liegt darin, dass sie quantitativer Natur ist und wir suboptimale Unterschiede in der Komplementaktivierung nachweisen können.
Elizabeth Brook, Postdoktorandin in unserem Labor, wird die Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie damit, nicht typisierte rote Blutkörperchen dreimal mit PBS zu waschen, anschließend inkubieren Sie das Pellet 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer 0,5%igen Roma-Lane-Lösung im Verhältnis 1:2. Nachdem die Zellen weitere drei Mal gewaschen wurden, lagern Sie sie als 3%ige Lösung in frischem PBS bei 4 Grad Celsius. Um die Komplementablagerung auf den Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, heizen Sie zunächst die gewünschte Menge an Patientenserum 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius zur Inaktivierung auf, während das Serum erhitzt wird. Waschen Sie die Brola-behandelten roten Blutkörperchen danach dreimal im Roal-Puffer. Nach dem letzten Waschschritt.
Suspendieren Sie das Pellet in VB-G plus plus in einer Verdünnung von 0,5 %. Geben Sie anschließend in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte 25 Mikroliter 0,5 %iger Erythrozyten, 37,5 Mikroliter frisches AB-Serum und 37,5 Mikroliter einer 200 Mikrogramm pro Milliliter Anti-C5-Lösung. Fügen Sie dann das hitzeinaktivierte Patientenserum in der entsprechenden Konzentration zu jedem Loch hinzu, ergänzen Sie gegebenenfalls mit hitzeinaktiviertem AB-Serum und führen Sie ebenfalls eine negative Kontrolle durch.
Verwenden Sie VBG plus plus, um jedes Loch auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern aufzufüllen, und inkubieren Sie die Platte danach eineinhalb bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, abgedeckt mit E IA-Folie. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, ergänzt mit 0,5 % BSA, und markieren Sie anschließend die Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter einer fluoreszenzmarkierten anti-C3- und anti-C4-Einzelklon-Antikörperlösung. Inkubieren Sie die Zellen 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln. Nach dreimaligem Waschen der Platte resuspendieren Sie die Erythrozyten in 150 Mikrolitern PBS plus 0,5 % BSA pro Probe.
Überführen Sie die Zellsuspensionen in eine neue 96-Well-Rundbodenplatte und laden Sie die Platte anschließend auf den Durchflusszytometer. Trennen Sie die Einzelzellen von den Doppelzellen mithilfe eines Forward-Scatter-Plots. Setzen Sie das Gate auf die einzelnen Erythrozyten und wählen Sie dann den geeigneten Detektionskanal für die fluoreszenten Signale aus. Quantifizieren Sie die Ergebnisse anhand der medianen Fluoreszenzintensität für die quantitative hämolytische Analyse, erhitzen und aktivieren Sie das Patientenserum und waschen Sie die mit Romaine behandelten Erythrozyten, wie zuvor gezeigt.
Danach, nach der Inkubation der Erythrozyten mit Komplement und Patientenserum, wie gerade gezeigt, jedoch ohne das Anti-C5, die Zellen fünf Minuten bei 664 ×g mit reduzierter Verzögerung abzentrifugieren. Anschließend vorsichtig 90 Mikroliter Überstand in eine neue Mikrotiterplatte überführen, wobei darauf geachtet werden muss, keine intakten Zellen zu übertragen und die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und dann die Absorption bei 414 bis 690 nm in einem Spektralphotometer messen. Die Hämolyse wird als Prozentsatz der Lyse einer Probe von Erythrozyten angegeben, die in reinem Wasser inkubiert wurden.
In dieser ersten Abbildung sind repräsentative Streudiagramme für mit Brola behandelte Erythrozyten dargestellt, bei denen eine geeignete Gating-Strategie für einzelne Erythrozyten zu sehen ist. Typischerweise fallen etwa 95 % der Erythrozyten in dieses Einzelzell-Gate. In diesen Histogrammen sind repräsentative Ergebnisse zur Wirkung der autoimmunen hämolytischen Anämie oder AHA dargestellt.
Die Komplementablagerung durch Patientenserum auf C4 und C3 zeigt wie erwartet: Je mehr Patientenserum verwendet wird, desto stärker ist die Komplementablagerung. Auffällig ist, dass die Komplementablagerung in zwei deutlich getrennten positiven Peaks auftritt. Dies liegt wahrscheinlich nicht an einer Heterogenität der Erythrozytenpopulation, da die Erythrozyten von einem einzigen Spender stammen. Obwohl die Ursache dieses Phänomens noch untersucht wird, wurden die medianen Fluoreszenzintensitäten der Proben in diesen Liniendiagrammen dargestellt, um die Reproduzierbarkeit der C4- und C3-Ablagerungsassays zu veranschaulichen.
Beachten Sie die große Variabilität bei der Ablagerung der verschiedenen AH H-Patientenproben. Schließlich können in diesen Diagrammen Daten aus einem hämolytischen Assay einer ahha-Patientenserumprobe beobachtet werden, die Autoantikörper gegen rote Blutkörperchen enthält. Die Titration mit der Serumprobe ergibt eine klare, reproduzierbare Kurve mit einem geeigneten Komplementinhibitor wie Anti-C5.
Das hämolytische Signal kann wie in dieser Grafik gezeigt titriert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Komplementaktivierung durch erythrozytenspezifische Antikörper gemessen werden kann, entweder durch die Durchflusszytometrie-Analyse der Ablagerung von C3 oder C4 oder durch einen quantitativen hämolytischen Assay.
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Übersicht
In diesem Artikel werden zwei Assays zur Messung der durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen (RBCs) induzierten Komplementaktivierung beschrieben. Die Assays sind quantitativ und einfach zu interpretieren, was Vorteile gegenüber bestehenden Methoden bietet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Hämatologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Die Aktivierung des Komplementsystems ist entscheidend für Immunantworten.
- Antikörper gegen rote Blutkörperchen können zu verschiedenen klinischen Zuständen führen.
- Aktuelle Assays weisen möglicherweise einen Mangel an quantitativer Genauigkeit auf.
- Neue Methoden zielen darauf ab, den Nachweis der Komplementaktivierung zu verbessern.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen.
- Entwicklung eines quantitativen Assays zur besseren Interpretation der Ergebnisse.
- Vergleich neuer Techniken mit etablierten diagnostischen Methoden.
Verwendete Methoden
- Inkubation von Erythrozyten mit Patientenserum und blockierenden Antikörpern.
- Färbung von Erythrozyten mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern.
- Analyse der Komplementablagerung mittels Durchflusszytometrie.
- Bestimmung der Hämoglobinfreisetzung zur Ermittlung der Erythrozytenlyse.
Hauptergebnisse
- Die neuen Assays liefern quantitative Daten zur Komplementaktivierung.
- Suboptimale Unterschiede in der Aktivierung können erfasst werden.
- Die Ergebnisse zeigen eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Die Durchflusszytometrie-Analyse ermöglicht eine detaillierte Interpretation.
Schlussfolgerungen
- Die neuen Assays vertiefen das Verständnis der Komplementaktivierung.
- Sie bieten eine zuverlässige Alternative zu bestehenden diagnostischen Tests.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Diagnose und Behandlung von Patienten verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Bewertung der antikörperinduzierten Komplementaktivierung an roten Blutkörperchen ist entscheidend für die Beurteilung der Wirksamkeit von Komplementinhibitoren und das Verständnis hämolytischer Mechanismen bei autoimmunen und alloimmunen Erkrankungen. Die beschriebenen Durchflusszytometrie- und spektrophotometrischen Assays liefern reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die den Nachweis suboptimaler Unterschiede in der Komplementaktivierung ermöglichen und somit die mechanistische Risikominderung in der Therapieentwicklung unterstützen. Diese Methoden erhöhen die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem sie qualitative Beobachtungen in messbare, übertragbare Biomarker für präklinische und klinische Entscheidungsprozesse umwandeln.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der durch Autoantikörper oder Alloantikörper auf Erythrozyten induzierten Komplementablagerung (C3/C4).
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Zielstrukturvalidierung durch direkte Messung der Antikörper-vermittelten Effektoraktivität und verringert damit mechanistische Unschärfen bei der Zielstrukturauswahl.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffportfolios, indem quantitative Daten zur Potenz der Komplementaktivierung generiert werden, die über die Weiterentwicklung oder Einstellung komplementmodulierender Therapeutika entscheiden helfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt standardisierte, quantitative Ausgaben (mittlere Fluoreszenzintensität, Hämoglobinfreisetzung), die für das Hochdurchsatz-Screening von Komplementinhibitoren oder therapeutischen Antikörpern geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Zeigt geringe Variabilität über verschiedene Serumproben von Patienten hinweg, wodurch eine zuverlässige Bewertung von Substanzen und eine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren ermöglicht wird.
- Plattformnutzen: Nutzt leicht zugängliche Geräte (Durchflusszytometer, Spektrophotometer), um wiederverwendbare Assays zur Messung komplementabhängiger biologischer Aktivität in Entdeckungsprozessen zu erstellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert pathophysiologische Mechanismen bei der autoimmunen hämolytischen Anämie (AIHA) und der alloimmunen Hämolyse und verknüpft die Zielstrukturenbindung mit der funktionellen Aktivierung des Komplementsystems.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke zwischen Entdeckung und präklinischer Validierung, indem quantitative Biomarker (Ablagerung von C3/C4, Hämolyse) bereitgestellt werden, die mit dem klinischen hämolytischen Potenzial korrelieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der komplementvermittelten Lyse und unterstützt so Sicherheitsbewertungen sowie die Modellierung von Dosis-Wirk-Beziehungen in präklinischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Assays integrieren sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Sicherheitsbewertung und liefern quantitative Nachweise der Komplementaktivierung, die zur biologischen Risikominderung und Beurteilung des therapeutischen Index beitragen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung antikörperinduzierter Komplementaktivierungspfade und klärt den Wirkmechanismus immunmodulatorischer Kandidaten auf.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Ergebnisse (Fluoreszenzintensität, spektrophotometrische Hämolyse), die einen zuverlässigen Vergleich von Testsubstanzen oder Serumproben ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte (mittlere Fluoreszenzintensität, Hämoglobinfreisetzung), die statistische Analysen und den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen in Dosis-Wirkungs-Studien erleichtern.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch krankheitsrelevante Ergebnisparameter, die der Komplementaktivierung bei AIHA und in Transfusionszusammenhängen entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, standardisierte Plattform zur Bewertung komplementabhängiger Aktivität bei Antikörpetherapeutika, Biosimilars und Komplementinhibitoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem qualitative Komplementtests in quantitative, übertragbare Messungen umgewandelt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch definierte Protokolle für die Vorbereitung von roten Blutkörperchen, die Inkubation mit Serum sowie die Detektion mittels Durchflusszytometrie oder Spektrometrie.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem komplementaktivierende Risiken früh erkannt werden, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien bei immunmodulierenden Programmen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt eine risikoadjustierte Prioritätenfestlegung, indem das Potenzial der Komplementaktivierung quantifiziert wird, was objektive Entscheidungen über die Weiterentwicklung in der Therapieentwicklung ermöglicht.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunologie, Durchflusszytometrie und der Handhabung spektrophotometrischer Assays für genaue Messungen der Komplementdeposition und Hämolyse.
- Setzt den Zugang zu Durchflusszytometern mit geeigneten Fluoreszenzkanälen sowie zu Spektrophotometern zur Hämoglobinkonzentrationsbestimmung bei 414/690 nm voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Erythrozytenpräparation (z. B. Nulltyp, mit Bromelain behandelte Erythrozyten) und der Serum-Hitzeinaktivierung, um die Assay-Konsistenz zwischen verschiedenen Anwendern und Standorten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf verschiedene Erythrozytenarten, Antigendichten oder Komplementquellen außer humanem AB-Serum.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die sorgfältige Übertragung des Überstandes, um Zellmitnahme und Luftblasen zu vermeiden, die die Genauigkeit der Hämolysequantifizierung beeinträchtigen könnten.
