Ein bakterizider Serumassay für die komplementvermittelte bakterizide Aktivität von Antikörpern

Entnehmen Sie eine seriell verdünnte Serumprobe, die monoklonale Antikörper gegen Lipopolysaccharide oder LPS enthält – eine äußere Membrankomponente gramnegativer Bakterien.

Führen Sie gramnegative Bakterien ein. Serum-Antikörper binden an bakterielles LPS.

Fügen Sie Komplementproteine hinzu. Der C1-Komplex bindet an LPS-gebundene Antikörper und bildet ein enzymatisch aktives C1.

Aktiviertes C1 spaltet C4 und C2, um C3-Konvertase zu bilden, die C3 spaltet, um C5-Konvertase zu bilden. Die Konvertase spaltet C5, um C5b zu produzieren, das C6 und C7 rekrutiert. Der resultierende Komplex fügt sich in die äußere Membran ein und verbindet sich mit C8 und multiplem C9, wodurch eine Pore gebildet wird.

Eine Schädigung der äußeren Membran destabilisiert die innere Membran und führt zu einer Zelllyse.

Die Mischung auf eine Agarplatte geben und verteilen. Inkubieren für Bakterienwachstum. Überlagern Sie die Platte mit Agar, der Triphenyltetrazoliumchlorid oder TTC enthält, das durch mikrobielle Dehydrogenasen reduziert wird und den Bakterienkolonien eine rote Farbe verleiht.

Die Anzahl der Kolonien nimmt mit der Probenverdünnung zu, was auf eine verminderte bakterizide Aktivität bei niedrigerer Antikörperkonzentration hinweist.

Zu Beginn inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang in einem warmen Wasserbad bei 56 Grad Celsius, um die Testproben zu erhitzen. Besorgen Sie sich eine Assay-Platte und 20 Mikroliter Assay-Puffer für die Spalten 1 bis 12 der Reihen A bis G. Geben Sie 20 Mikroliter Assay-Puffer in die Spalten 1 und 2 der Reihe H. Laden Sie 30 Mikroliter jeder Testprobe in doppelter Ausführung in Reihe H der Assay-Platte.

Um mit der dreifachen Serienverdünnung der Testproben zu beginnen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus den Vertiefungen 3H bis 12H zu entnehmen. Übertragen Sie die Proben in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe G und pipettieren Sie 8 bis 10 Mal auf und ab, um die Probenvertiefung zu mischen. Entnehmen Sie dann 10 Mikroliter aus diesen Vertiefungen, geben Sie sie in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe F und pipettieren Sie 8 bis 10 Mal auf und ab, um zu mischen. Diesen seriellen Verdünnungsprozess durch Reihe A fortsetzen. Nach dem Mischen der Vertiefungen in Reihe A werden 10 Mikroliter aus den Vertiefungen 3A bis 12A entnommen und entsorgt, so dass das endgültige Volumen in allen Vertiefungen 20 Mikroliter beträgt.

Entnehmen Sie ein Fläschchen mit gefrorenem Zielbakterienfond und tauen Sie ihn bei Raumtemperatur auf. Verdünnen Sie dann die Bakterien in 20 ml Assay-Puffer entsprechend dem vorgegebenen optimalen Verdünnungsfaktor. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter verdünnte Bakterien in jede Vertiefung der Assay-Platte.

Entnehmen Sie eine Durchstechflasche mit gefrorenem Kaninchenbaby und eine Durchstechflasche mit gefrorenem, hitzeinaktiviertem BRC. Verwenden Sie fließendes kaltes Wasser, um die Durchstechflaschen auf Raumtemperatur aufzutauen. Mischen Sie dann 100 Mikroliter Hitze und hitzeinaktiviertes BRC mit 400 Mikrolitern Assay-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter dieser 20%igen hitzeinaktivierten BRC-Lösung in alle Vertiefungen in Spalte 1. Mischen Sie 1 Milliliter natives BRC mit 4 Millilitern Assay-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter dieses 20%igen Gemisches in alle Vertiefungen in den Spalten 2 bis 12. Legen Sie die Platte 10 bis 15 Sekunden lang auf einen Plattenschüttler, um die Assay-Platte vorsichtig zu mischen.

Inkubieren Sie die Assay-Platte zwei Stunden lang in einem mikrobiologischen Inkubator. Entfernen Sie in der Zwischenzeit die Deckel von zwei LB-Agarplatten und legen Sie die Platten mit der bedruckten Seite nach oben für 40 bis 60 Minuten zum Trocknen in eine biologische Sicherheitswerkbank. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, überführen Sie die Assay-Platte auf nasses Eis und inkubieren Sie sie 10 bis 20 Minuten lang, um die Reaktion zu stoppen. Mischen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette die Vertiefungen in Reihe H und geben Sie 10 Mikroliter des Reaktionsgemisches auf den Boden einer LBA-Platte. Kippen Sie die Platte sofort und lassen Sie die Spots etwa 1,5 bis 2 Zentimeter laufen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Zeilen G, F und E, und markieren Sie sie über der vorherigen Zeile. Inkubieren Sie die LBA-Platten bei Raumtemperatur, bis die Lösung in die LBA-Platten aufgenommen wird. Legen Sie dann die Deckel auf die Platten und geben Sie sie kopfüber in einen mikrobiologischen Inkubator, um sie über Nacht zu inkubieren.

Am nächsten Tag geben Sie 25 ml Overlay-Agar bei 55 Grad Celsius mit 100 Mikrogramm pro Milliliter TTC und 0,1 % Natriumazid auf jede LBA-Platte. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die überlebenden Bakterien eine rote Farbe entwickeln können. Verwenden Sie dann eine Digitalkamera, um die Platten zu fotografieren. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und verwenden Sie die integrierte Kolonieaufzählungssoftware von NIST, um die Bilder zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben.