Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Nehmen Sie IgM-opsonisierte rote Blutkörperchen (SRBCs) mit IgM-Antikörpern, die an die Zelloberflächenantigene gebunden sind.

Fügen Sie serumhaltige Komplementproteine außer C5 hinzu.

Der C1-Komplex bindet an die Antikörper und wird aktiv.

Aktiviertes C1 spaltet C4 und C2 und bildet eine C3-Konvertitase, die dann C3 spaltet und C3b auf den SRBCs ablagert.

Ohne C5 zerfällt C3b zu C3bi.

Fügen Sie die SRBCs einer Makrophagenkultur hinzu.

C3bi bindet an den Makrophagenrezeptor und löst die SRBC-Phagozytose aus.

Fügen Sie eine hypotonische Lösung zur Lyse hinzu und entfernen Sie nicht internalisierte SRBCs.

Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren und das SRBC-Hämoglobin freizusetzen.

Führen Sie ein Erkennungsreagenz ein.

In Anwesenheit von Harnstoff katalysiert Hämoglobin die Oxidation von Diaminofluoren durch Wasserstoffperoxid, wodurch ein farbiges Produkt entsteht.

Misse die Absorption des farbigen Produkts, die proportional zu den phagozytosierten SRBCs ist.

Dieser Test modelliert die Phagozytose von antikörpermarkierten Bakterien mithilfe von opsonisierten SRBCs, um bakterielle Ziele nachzuahmen.

Für einen Opsonisierungstest wird bei Zimmertemperatur 2 mal 10 bis zum achten Schaf, rote Blutkörperchen, oder SRBCs, mit 50 Mikrolitern Kaninchen-Anti-SRBC-Immunglobulin M oder IgM für 30 Minuten inkubiert.

Anschließend werden die opsonisierten SRBCs 30 Minuten lang mit 50 Mikrolitern C5-defizienten menschlichen Serum bei 37 Grad Celsius inkubiert, um die C3b- und C3b-Inhibitor-Komplementfragmente an den IgM-beschichteten SRBCs zu fixieren.

Als Nächstes wird das Medium aspiriert und 100 Mikroliter 1 mal 10 zu den sieben opsonisierten SRBCs pro Milliliter Medium zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte mit 1 mal 10 zu den vierten über Nacht kultivierten Maus-Makrophagen pro Bohrloch hinzugefügt.

Inkubieren Sie die SRBC-Mausmakrophagen-Kokultur für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und entfernen Sie anschließend die ungebundenen SRBCs durch Waschen mit 100 Mikrolitern Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer für 1 Minute.

Nachdem die ungebundenen SRBCs entfernt wurden, spülen Sie mit 100 Mikrolitern Medium. Lysieren Sie die verbleibenden Zellen mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat und behandeln Sie die Lysate mit 50 Mikrolitern 2,7-Diaminofluoren, ergänzt mit 3 % Wasserstoffperoxid und 6 Molarharnstoff.

Anschließend misst man die Absorption der hämoglobinkatalysierten Fluoren-Blau-Formation auf einem Spektrophotometer bei 620 Nanometern.

Verwenden Sie eine Standardkurve mit 620 Nanometer-Absorptionswerten und bekannter Anzahl von SRBCs, um die Anzahl der opsonisierten SRBCs zu bestimmen, die phageozytisiert werden.