Name: Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung membranbindender Proteine mit Negativfärbung-Transmissionselektronenmikroskopie an Nanodiscs. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen für die Strukturbiologie.

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Die Autoren danken der schwedischen Research Council, Stockholm County Council, und KI Mittel für ihre Unterstützung. Die Expression und Reinigung von MSP wurde am Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se) durchgeführt. Die Autoren möchten sich auch Dr. Pasi Purhonen und Dr. Mathilda Sjöberg für die gemeinsame Nutzung ihrer technischen Know-how und für ihre rechtzeitige Unterstützung zu danken.

1. Herstellung von Nanoscheiben <ol><li> Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein 8, 35 <ol><li> Express das His-Tag MSP1E3D1 in den E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 Stamm in Flaschen. Bereiten Sie eine 50-ml-Übernachtstarterkultur mit LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Kanamycin bei 37 ° C. Verdünnen Sie die über Nacht Starterkultur in 2 l Terrific Broth-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin. </li><li> Wachsen die Zellen bei 37 ° C , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) erreicht ca. 3 die Proteinexpression bei 18 ° C Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h mit 0,5 mM Induce. </li><li> Vorbereitung der Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl und 10% Glycerol). 1 mM TCEP unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Nach 3 h Induktion bei 18 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 4500 xgund 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die geernteten Zellen und resuspendieren sie in Lyse-Puffer bei einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen. </li><li> Lyse der Zellen durch gepulste Beschallung (Wiederholungsrate: 4 s ON, 4 s AUS) für 3 min bei 80% Amplitude. </li><li> Zentrifugation der Lysate 20 min bei 49.000 xg und 4 ° C. Entsorgen Sie das Pellet aus dieser Zentrifugation. </li><li> Injizieren Sie den Überstand in einen 5-ml - Ni + chelatbildende Säule zu einem automatisierten Flüssigkeits - Chromatographie - System angeschlossen vorzugsweise bei 4 ° C gehalten. </li><li> Vor dem Elutionsschritt (Schritt 1.1.9), Waschen der Säule mit Puffer 1-3, um alle Proteine ​​zu entfernen, außer dem His-Tag MSP. Überwachen Sie den Proteingehalt bei 280 nm den Reinigungsprozess zu folgen; die UV-Aufzeichnung bei 280 nm sollte nach jeder Wäsche auf den Ausgangswert zurück. <ol><li> Waschen mit Waschpuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 1% Triton, pH 8,0. </li><li> Waschen mit Waschpuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM Imidazol und 50 mM Natriumcholat, pH 8,0. </li><li> Waschen mit Waschpuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 50 mM Imidazol, pH 8,0. </li></ol></li><li> Eluieren die MSP mit 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl und 500 mM Imidazol, pH 8,0. </li><li> Ändern des Pufferstandardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl und 0,5 mM EDTA) MSP durch Gelfiltration 8, 35; die Ausbeute pro Charge sollte um 7 mg L -1. </li></ol></li><li> Herstellung von Phospholipid-Stammlösung <ol><li> Hinzufügen 305 &amp; mgr; l von 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (POPC) , gelöst in Chloroform bei einer Konzentration von 25 mg / mL in einem Becherglas und verdampfe das Chloroform indem sie mit einem leichten Stickstoffstrom gespült . Trocknen Sie das Lipid über Nacht in einem Vakuumexsikkator. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um das Lösungsmittel aus dem Lipid zu entfernen, die sich am Boden des Becherglases eine dünne Lipidfilm verläßt.</li><li> Resuspendieren Lipidkuchen in 200 ul MSP Standardpuffer, enthaltend 100 mM Natriumcholat durch Vortexen das Rohr, bis die Lösung transparent wird; Dies wird eine Lösung mit einer Konzentration von POPC 50 mM bereitzustellen. HINWEIS: In der Regel sollte das molare Verhältnis von Lipid zu Detergens an dieser Stelle 1: 2 (Lipid: Detergens) 8. Diese Lipid-Detergens-Mischung kann für fast 2 Monate bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Herstellung von hydrophoben Perlen für Waschmittel Entfernung <ol><li> Platz 5 g Perlen (Trockengewicht) in einem 50-ml-Röhrchen. </li><li> Waschen der Kügelchen mit 30 ml 100% igem Methanol und dann mit 40 ml Reinstwasser. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 10 ml MSP Standardpuffer. Schließlich speichern Sie die Perlen mit 15 ml MSP Standardpuffer bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Nanodisc Rekonstitution <ol><li> Dispense 190 &amp; mgr; l MSP1E3D1 (0,124 mM) in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 61,5 ul von Phospholipid-Stammlösung (50 mM POPC) auf das gleiche Rohr. Inkubieren Sie die Rekonstitution Mischung auf nassem Eis für 1 Stunde. ANMERKUNG: Dies entspricht einem molaren Verhältnis von 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> In hydrophobe Kügelchen in einer Konzentration von 0,5 g Kügelchen pro ml Rekonstitution Mischung die Selbstorganisationsprozess zu initiieren. Inkubieren in einem Rotations Inkubator für 16 h bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 13.000 xg und 4 ° C, um die Ausfällungen und Aggregate zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und der Überstand speichern. </li><li> Äquilibrieren der Grßenausschluß-Chromatographie-Säule (montiert auf einem automatisierten Flüssigkeits-Chromatographie-System) mit Puffer MSP-Standard, bis die Absorption bei 280 nm stabil ist. Injizieren Sie den Überstand in die Kolonne und sammeln Sie die Peakfraktionen. </li><li> Messung der Konzentrationen von Nanoscheiben in den Peak-Fraktionen bei 280 nm. Verwenden des molaren Extinktionskoeffizienten von MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm -1 M -1) für die Berechnung der Konzentration nanodisc. Beachten Sie dasAnzahl von Lipiden pro nanodisc kann allein durch eine Kombination von radiomarkiertem Lipiden und Phosphatanalyse 4 oder durch Phosphat - Analyse gemessen werden. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung des monotopen Protein 5-Lipoxygenase 35 <ol><li> Bereiten Sie eine Nacht Starterkultur. Supplement 50 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin. Beimpfen des Mediums mit E. coli BL21 (DE3) , der das Plasmid des 5-Lipoxygenase - Gens (ALOX5) enthält. Verdünne die über Nacht Starterkultur in Expressionsmedium , enthaltend 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, 0,2% D-Glucose, 0,1 %, 5 &amp; mgr; M FeSO 4 und 100 &amp; mgr; g / ml Ampicillin. Die Zellen wachsen , bis die OD 600 ~ 0,5 bei 25 ° C. Induzieren Proteinexpression mit 0,2 mM IPTG für 16 h bei 20 ° C 35. </li><li> Ernte durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 × g und 4 ° C und den Überstand verwerfen. Wiegen Sie das Pellet am Boden des Röhrchens enthält die geernteten Zellen und Resuspendieren der geernteten Zellen in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% Glycerin und 1 mM TCEP), enthaltend Proteaseinhibitor und 0,5 mg / ml Lysozym 35 in einem Verhältnis von 2 ml Lysepuffer pro g Zellen. </li><li> Lyse der Zellen durch Beschallung für 5 x 15 s bei 80% Amplitude. Entfernen der Zelldebris durch Zentrifugation für 10 min bei 7000 xg und 4 ° C. Führen Ammoniumsulfatfällung bis 30 - 60% Sättigung 35 , die Proteine in der Lösung auszufällen. Zentrifuge für 15 min bei 16.000 xg und 4 ° C. HINWEIS: Die 5LO Pellet schnell eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden kann für bis zu 6 Monate. </li><li> Das Pellet mit 20 ml Lyse-Puffer und zentrifugieren für 15 min bei 40.000 xg und 4 ° C. </li><li> Inkubieren der Überstand auf<html> eine ATP-Agarose-Säule bei 4 ° C für 30 min. Die Säule wird einmal mit einem Säulenvolumen Lysepuffer enthaltend 0,5 M NaCl. Eluieren die 5LO mit 20 mM ATP in Lysepuffer , enthaltend 10 &amp; mgr; M FeSO 4 und 20 ug / ml Katalase. Führen Gelfiltrationschromatographie , um das ATP 35 entfernen. HINWEIS: Die 5LO instabil ist und sollte sofort nach der Reinigung verwendet werden. Ansonsten empfiehlt es sich bei dem Schritt des Ammoniumsulphatfällung zu stoppen (siehe Hinweis nach Schritt 2.1.3). </li></ol> 3. Herstellung der Nanodisc-Protein-Komplex <ol><li> Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 100 &amp; mgr; l-Komplex. Mischungs 0,8 uM ND und 0,8 uM 5LO mit der 1 mM Ca 2+ in dem MSP Standardpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA und 1,5 mM CaCl 2) und Inkubation für 10 min auf Eis. ANMERKUNG: Die Probe kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C 35 gespeichert werden. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Die Analyse der Proben <ol><li> Die Gel-Elektrophorese <ol><li> Nicht-denaturierenden Elektrophorese <ol><li> Mischungs 15 &amp; mgr; l der Probe mit 5 &amp; mgr; l Ladepuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) Glycerin und 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 und laden sie auf ein 4 - 16% bis-Tris-Gel-Elektrophorese durchzuführen. </li><li> Füllen der Kathodentank mit Lichtkathodenpuffer (50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8, und 0,002% Coomassie G-250) und die Anodentank mit Laufpuffer (50 mM Bis-Tris und 50 mM Tricin, pH 6,8). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von </li><li> Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn die Coomassie Front das Ende des Gels erreicht. </li><li> Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll. </li></ol></li><li> denaturierende Elektrophorese <ol><li> Mischungs 40 &amp; mgr; l der Probe mit 10 &amp; mgr; l Beladungspuffer, enthaltend SDS (0,05% (w / v) Bromphenolblau, 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) Glycerin; 10% (w / v) SDS; und 10 mM 2-Mercaptoethanol) und laden Sie es auf einem 4 - 20% Tris Glycin-Gelelektrophorese durchzuführen. </li><li> Füllt die Kathoden- und Anodentanks mit Laufpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM Glycin und 0,1% (w / v) SDS). Starten Sie die Trennung durch eine konstante Spannung bei 150 V unter Verwendung von </li><li> Stoppen Sie die elektrophoretische Trennung, wenn der Ladefarbstofffront das Ende des Gels erreicht. </li><li> Stain das Gel mit einem Standard-Coomassie-Blau-Protokoll. </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung der NAPT-Lösung <ol><li> Man löst 1 g Phosphorwolframat Natriumsalz in 50 ml Wasser durch Rühren bei Raumtemperatur eine 2% ige (w / v) saure Lösung zu ergeben. </li><li> Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH. Entfernen der Teilchen mit einer 0,22 um-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Probe für die TEM-Analyse <ol><li> Glimmentladungsspektrometer Kohlenstoff beschichteten Kupfergitter (400 mesh) für 20 s bei 30 mA die Gitter hydrophilen vor der Adsorption der Probe zu machen. Place 3,5 &amp; mgr; l der Probe (0,8 &amp; mgr; M in Bezug auf die Nanoscheiben) auf dem Gitter und inkubiere für 30 s. HINWEIS: Das Volumen angewendet kann zwischen 2,5 und 5 &amp; mgr; l variieren, in Abhängigkeit von der Probenkonzentration. Ein geeigneter Konzentrationsbereich für Nanoscheiben ist 0,5-1 uM. </li><li> Abtupfen überschüssige Lösung Filterpapier. </li><li> Unmittelbar färben das Gitter mit einem Rückgang von 2% NAPT für 30 s. Abtupfen überschüssige Lösung und lassen Sie das Gitter an der Luft trocknen. </li><li> Bewerten Sie die Gitter durch TEM. Ein Mikroskop mit 120-200 keV Beschleunigungsspannung ausreicht, um das Ausmaß der Stapelung zu schätzen. HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll wird ein kalibrierter Transmissions-Elektronenmikroskop verwendet wurde, ausgerüstet mit einem 200 keV Feldemissionsquelle. </li><li> Notieren Sie sich die TEM-Aufnahmen. Für die Bilder lange Stapel zeigt, verarbeiten nicht weiter; Bilder zeigen den Komplex von Nanoscheiben, mit extrinsischen Protein, das ein paar enthaltenShort-Stacks, aber die meisten Teilchen sind in der Anlage. Nehmen Sie mehrere Bilder und verarbeiten diese nach Standardmethoden Klasse-Mittelwerte und eine niedrige Auflösung, 3-dimensionale Modell des Komplexes zu erhalten. HINWEIS: Für die Sammlung von negativen Fleckdaten, Gitter an mindestens drei verschiedenen Tagen hergestellt wurden. Für jeden Tag, frische Probe Inkubationen (wie in Schritt 3.1) gemacht wurden, bevor die Negativfärbung angewendet wurde. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Verfahren kann in drei Teile unterteilt werden: die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben, die Herstellung von Protein-nanodisc Komplexe und die negative Färbung für die TEM dieser Komplexe. Jeder Teil wird separat in Bezug auf Beschränkungen der Technik, wichtige Schritte, und nützliche Änderungen gerichtet. Die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben. Kritische Schritte und Einschränkungen in der Herstellung und Verwendung von Nanoscheiben. Für die Herstellung...

In der medizinischen Forschung wird viel Aufmerksamkeit auf Membranproteine ​​fokussiert, entweder intrinsisch oder extrinsisch, in einer Vielzahl von Lipid-Wechselwirkungen beteiligt. Arbeiten mit lipidinteragierenden Proteinen enthält entweder einen Ersatz zu den Lipiden der Auswahl wie Detergenzien, amphipols 1 oder kleinen Proteinen 2 oder eine Membran Ersatz zu finden , die das Protein löslich und aktiv hält. Lipoic Membran Ersatzstoffe sind Liposomen und Nanoscheiben (ND) , 3, 4. Nanoscheiben sind nahezu native Membranplattformen durch Engineering der Proteinteil entwickelt, ApoA-1, der High-Density-Lipoprotein (HDL) natürlich im Blut auftreten. ApoA-1 ist ein 243-Rest-langen Kette von kurzen amphipathische α-Helices und hat eine lipidfreie lösliche Konformation. In vitro , wenn in Gegenwart von Lipiden, zwei Kopien des Proteins Apo A-1 spontan neu ordnen die hydr einzukreisenophobic Acylkette Teil eines Lipid - Doppelschicht - Patch 5. Ausgeführt Versionen von ApoA-1 sind in der Regel Membrangerüstproteine ​​(MSP) genannt, und eine wachsende Zahl sind als Plasmide oder als gereinigte Proteine ​​im Handel erhältlich. Wiederholungen oder Deletionen der α-Helices in ApoA-1 Ergebnis in mehr 6 oder kürzer 7 Membrangerüstproteine. Dies wiederum macht es möglich , Scheiben etwa 6 nm 7-17 nm 8 im Durchmesser zu bilden. Es gibt verschiedene Arten von Anwendungen für den Nanoscheiben 3, 9. Die am häufigsten verwendete Anwendung ist für die Stabilisierung eines integralen Membranproteins 8, überprüft zuvor 3, 9 eine nahezu native Membranumgebung. Ein weniger erforschten Einsatz ist eine nanoskalige Membranoberfläche für die Studie zur Verfügung zu stellenperiphere Membranproteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Abschnitt 1 des Protokolls visualisiert unter das Verfahren für die Herstellung von Nanoscheiben, bestehend aus Phospholipiden und Membrangerüstprotein. Die Probenvorbereitung ist ein Engpass bei den meisten Methoden. Methodenspezifische Proben können bestimmte Informationen hinzufügen, aber sie auch Vergleiche der Ergebnisse schwierig. Daher ist es einfacher, wenn Proben multimodal und kann in verschiedenen Verfahren unmittelbar verwendet werden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Nanoscheiben ist die geringe Größe der nanodisc im Vergleich zu Liposomen (zB können die Proben direkt verwendet werden für sowohl TEM und nicht-denaturierenden Gelelektrophorese, wie in dem vorliegenden Protokoll). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Vesikeln und Liposomen sind seit langem verwendet worden, um die Funktion von membraninteragierende Proteine ​​zu verstehen. Für Strukturuntersuchungen und Visualisierung, ein Beispiel für die Strukturbestimmung eines Transmembranproteins in Liposomen verfügbar ist 18. keine hochauflösende 3D-Struktur eines monotopen Membranprotein auf einer Liposomenmembran eingebettet hat sich jedoch noch nicht veröffentlicht worden ist, soweit wir wissen. Gold - Nanopartikel oder Antikörper können verwendet werden , um Proteine zu visualisieren , um Liposomen oder Vesikel Bindung TEM 19. Obwohl diese Sonden sehr spezifisch sind, könnten sie mit membranbindende Proteine ​​stören, indem die Membran-Bindungsstelle Verschleierung oder Bereiche von Interesse mit den flexiblen Teilen maskieren. Gold-markierte Antikörper oder komplexierten Proteine ​​könnten wahrscheinlich auf einem Agarosegel analysiert werden, aber dies würde die Kosten des Experimentes zu erhöhen. Obwohl Liposomen eine hervorragende Plattform sind, kann man nicht, dass der Pop sicher sein,ulation hat ein bestimmtes Verhältnis Protein pro Liposom, eine Funktion , die 20 durch die Verwendung von Nanoscheiben untersucht werden kann. In einem Liposom, Cofaktoren und Substrate können in dem löslichen Innenraum eingefangen werden. Substanzen, die Membran-löslich sind das gleiche Schicksal für beide Arten von Membran-Mimetika teilen. Dennoch, wie die Doppelschicht-Bereich kleiner in Nanoscheiben ist, wird eine geringere Menge an Substanz erforderlich, um die Membranen nanodisc zu sättigen. Verständnis der Proteinfunktion durch die Bestimmung der Atomstruktur seit vielen Forschungsgebieten wesentlich gewesen. Verfahren zur Proteinstrukturbestimmung umfassen Röntgen 21; Kernspinresonanz (NMR) 22, 23; und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 24 bei kryogenen Temperaturen, Kryo - EM. Die Auflösung von Kryo-EM hat in letzter Zeit stark verbessert, vor allem durch den Einsatz von direkten Elektronen detektoren 25, 26. Die Makromoleküle werden in dünnen, glasigen Eis 27 in einer nahezu nativen Zustand abgebildet. Jedoch aufgrund der geringen Kontrast von biologischen Molekülen, werden sie hart im Größenbereich von 100 zu erfassen - 200 kDa. Für geeignet bemessene Proben kann die Datenerfassung aus , und das Verfahren der einzelnen Partikels Rekonstruktion werden kann , eine Struktur zu erhalten , 28 angewendet werden. Jedoch ist die Bestimmung der Proteinstruktur durch TEM ein mehrstufiger Prozess. Es beginnt in der Regel mit der Auswertung der Probe Monodispersität durch negative Flecken TEM 29 Salze von Schwermetallen wie phosphotungsten (PT) 30 oder Uran 31 verwendet wird . Rekonstruktion eines niedrigauflösenden Modell der negativ gefärbten Makromolekül ist in der Regel gemacht und kann wichtige Informationen über die molekulare Struktur 29 erhalten wird . Parallel zu,Datenerfassung mit Kryo-EM starten kann. Es sollte darauf geachtet werden, wenn die negative stain TEM Daten Auswertung der Fehlinterpretation von Artefaktbildung zu vermeiden. Ein besonderes Artefakt ist die Wirkung des PT Fleck auf Phospholipide und Liposomen 32, was zur Bildung von langen Stangen ähnlich Stapeln von Münzen von der Seite 33. Solche &quot;Rouleau&quot; oder &quot;Stapel&quot; (im Folgenden als &quot;Stapel&quot; bezeichnet) wurden für die HDL 34, früh beobachtet und später auch für die 35 - Nanoscheiben. Die Stapelung und Überarbeitung von Membranen können aus vielen Gründen auftreten. Beispielsweise kann es durch Co-Faktoren wie Kupfer induziert werden, durch TEM - Bildgebung in einem Fleck Ammoniummolybdat 36 gezeigt. Eine Fraktion der Membranlipide in Liposome enthielten eine Iminodiessigsäure Kopfgruppe Metall Komplexierung durch EDTA nachahmt, wodurch Liposomen nach Zugabe von Kupferionen Stapeln <sup class = &quot;xref&quot;&gt; 36. Stacking könnte auch durch eine Protein-Protein - Wechselwirkung durch ein Protein in oder auf den Lipid - Doppelschichten (die Beize verwendet wird nicht erwähnt) 37. Die Stapelbildung von Phospholipiden von PT wurde schon früh beobachtet; jedoch hat später Arbeit konzentrierte sich auf die Beseitigung oder die Abschaffung dieses Artefaktbildung 38. Hier schlagen wir eine Methode Vorteil der NAPT-induzierten nanodisc zu nehmen für die Untersuchung von membranbindenden Proteinen, die durch TEM Stapeln. Kurz gesagt, Protein auf der Nanoscheiben Bindung würde die Nanoscheiben aus Stapeln verhindern. Obwohl die Gründe für die Stapelung nicht klar sind, wurde es 39 vorgeschlagen , dass zwischen den Phospholipiden und der Phosphorylgruppe von PT, wodurch die Scheiben zu kleben aneinander (1A) eine elektrostatische Wechselwirkung ist. Die Hypothese hinter unserem Protokoll ist, dass, wenn ein Protein an ein nanodisc bindet, die meisten der Phospholipid-Oberfläche nicht Availa ist<html> Ble für die Interaktion mit dem PT aufgrund der sterischen Hinderung durch das Protein. Dies würde verhindern , dass der Stapelbildung (1B). Zwei Schlussfolgerungen gezogen werden können. Erstens bedeutet die Verhinderung der Stapelung, dass das Protein von Interesse an die Membran gebunden ist. Zweitens kann das Protein-ND - Komplex mit Standard - Einzelpartikelverarbeitungsverfahren 24, 40 eine grobe Morphologie des Komplexes zu erhalten behandelt werden. Darüber hinaus können Analysen durch Methoden wie nicht denaturierenden Gelelektrophorese oder dynamische Lichtstreuung durchgeführt werden. Um diese Hypothese zu belegen, haben wir die Membran-bindende Protein 5-Lipoxygenase (5LO), die 41 in vielen Entzündungskrankheiten beteiligt ist, 42. Dieses 78-kDa - Protein erfordert Ionen Calcium zu seiner Membran 43 zu binden. Obwohl diese Membranassoziation ausgiebig unter Verwendung von Liposomen untersucht wurdes = &quot;Xref&quot;&gt; 44, 45, 46 und Membranfraktionen 47, können diese nicht für die TEM - Analyse und Strukturbestimmung verwendet werden. Die Herstellung von Nanoscheiben beginnt mit MSP mit Lipid in dem Detergens Natriumcholat resuspendiert Mischen. Nach der Inkubation auf Eis für 1 h wird das Detergens aus der Rekonstitution Mischung unter Verwendung eines adsorbierenden Harzes langsam entfernt. Diese Art von Material wird häufig von Polystyrol in kleine Kügelchen geformt gemacht. Sie sind relativ hydrophob und haben eine starke Präferenz für Waschmittel - Bindung im Vergleich zu Lipiden 48. Nachdem die hydrophoben Kügelchen zu entfernen und die Durchführung Klärung Zentrifugation werden die Nanoscheiben durch Grßenausschlußchromatographie (SEC) gereinigt. Die gereinigten Nanoscheiben sind mit einem monotopen Membranprotein gemischt (und ggf. Co-Faktoren) in einem äquimolaren Verhältnis (oder mehrerer Verhältnisse für eine Titration) und an r linksEACT (15 min). Die Analyse mittels TEM wird durch Anlegen ul-Probenmengen auf glow-entladen, mit Kohlenstoff beschichteten Gitter und dann, indem eine negative Färbung mit NAPT durchgeführt. Die gleiche Probe aus, wenn die Aliquots auf die TEM Gitter aufgetragen wurden, können für die Analyse durch nicht-denaturierende PAGE oder SDS-Gelelektrophorese sowie durch verschiedene Arten von Aktivitätsmessungen verwendet werden, wobei keine wesentlichen Änderungen.

<table><tbody><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glühaustrag</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Gitter: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Größenausschluss Chromatographie: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bakterien: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bakterien: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufreinigungsmatrix: ATP Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Aufreinigungsmatrix: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipid: POPC</td><td>Avanti polare Lipide</td><td>850457C</td><td>25 mg/ml in Chloroform</td></tr><tr><td>Hydrophobe Kügelchen: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Spritzenvorsatzfilter: 0,2 &mu; m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Färbung: Natriumphosphotungat tribasisches Hydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Waschmittel: Natriumcholathydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholat</td><td></td><td></td><td>500 mM Natriumcholat. In milQ-Wasser resuspendieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Lipid Stock</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM Natriumcholat, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. <bt />Bei 4 & deg; C für eine Woche; oder Lager -80 > C für einen Monat, nachdem die Lösung mit Stickstoff gespült wurde.</td></tr><tr><td>MSP Standardpuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Bei 4 μC lagern.</td></tr><tr><td>Nicht denaturierender Elektrophorese-Anodenpuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8</td></tr><tr><td>Nicht denaturierender Elektrophorese-Kathodenpuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricin, pH 6,8, 0,002 % Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Nicht denaturierender Elektrophorese 4x Probenbeladungspuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10 % (w/v) Glycerin, 0,001 % Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturierungselektrophorese Laufpuffer</td><td></td><td></td><td>Inhouse-Rezeptur: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM Glycin, 0,1 % (w/v)</td></tr><tr>SDS-Denaturierungselektrophorese<td>5x Probenbeladung Puffer</td><td></td><td></td><td>Inhouse-Rezeptur: 0,05 % (w/v) Bromphenolblau, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20 % (v/v) Glycerin, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-Mercaptoethanol</td></tr><tr><td>Terrific Bouillon</td><td></td><td></td><td>Trypton - 12,0 g, Hefeextrakt - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 und 0,72 M K2HPO4, Glycerin - 4 mL. Trypton, Hefeextrakt und Glycerin wurden auf 900 mL aufbereitet und separat autoklaviert. KH2PO4 und K2HPO4 wurden separat vorbereitet und autoklaviert. Beide wurden vor der Verwendung des Mediums gemischt.</td></tr></tbody></table>

verfahren zum visualisieren und analysieren membran interagierender proteine ​​durch transmissionselektronenmikroskopie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotope Proteine üben ihre Funktion aus, wenn sie an eine Membranoberfläche gebunden sind, und solche Wechselwirkungen hängen von der spezifischen Lipidzusammensetzung und von der Verfügbarkeit von genügend Fläche ab, um die Funktion zu erfüllen. Nanodiscs werden verwendet, um eine Membranoberfläche mit kontrollierter Größe und Lipidgehalt bereitzustellen. In Abwesenheit von gebundenen extrinsischen Proteinen erscheinen mit Natriumphosphotungat gefärbte Nanodiscs von der Seite mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) als Münzstapel. Dieses Protokoll ist daher so konzipiert, dass es das Stapeln absichtlich fördert. Folglich kann die Verhinderung des Stackings als Bindung des membranbindenden Proteins an die Nanodisc interpretiert werden. In einem weiteren Schritt können die TEM-Bilder der Protein-Nanodisc-Komplexe mit Standard-Einzelpartikelmethoden bearbeitet werden, um niedrig aufgelöste Strukturen als Grundlage für höher aufgelöste KryoEM-Arbeiten zu erhalten. Darüber hinaus liefern die Nanodiscs Proben, die entweder für die TEM- oder die nicht-denaturierende Gelelektrophorese geeignet sind. Zur Veranschaulichung der Methode wird die Ca2+-induzierte Bindung von 5-Lipoxygenase auf Nanodiscs vorgestellt.

Die Methode, die wir vorschlagen, ist abhängig von der Herstellung von Nanoscheiben Bindung der Membranoberfläche für monotopen Membran-Protein bereitzustellen. Da es keine Transmembranprotein in die Lipid - Doppelschicht nanodisc eingebettet ist, werden die Nanoscheiben hier als &quot;leere Nanoscheiben&quot; (2A) bezeichnet. Diese weisen ein berechnetes Molekulargewicht von 256 kDa für eine Zusammensetzung von zwei MSP1E3D1 Gerüstproteine und etwa 260 Moleküle von POPC...

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung eines extrinsischen Membranproteins an der Oberfläche einer Nanodisc-Membran mittels negativer Kontrast-Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen, als ersten Schritt hin zur Strukturaufklärung des Proteins mit hoher Auflösung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in mehreren Forschungsbereichen zu beantworten, da sie Proteinfunktionen betrifft, die in und an zellulären Membranen stattfinden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in den charakteristischen Stapeln von Nanodisc-Formen, die entstehen, wenn das Protein nicht an die Membranen binden kann.Diese Stapel sind mittels Transmissionselektronenmikroskopie deutlich sichtbar. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Arzneimittelentwicklung hinein, da Verbindungen leicht daraufhin getestet werden können, ob sie die Wechselwirkungen von Membranproteinen blockieren oder ermöglichen können. Obwohl diese Methode Einblicke in die optimalen Bedingungen für die Bindung eines monotopen Proteins an Ihre Membran ermöglicht, liefert sie zudem eine Struktur mit niedriger Auflösung des Protein-Nanodisc-Komplexes.Um das Verfahren zu beginnen, exprimieren und reinigen Sie ein membranständiges Gerüstprotein wie MSP1E3D1. Danach geben Sie mithilfe einer Glas-Spritze mit Metallnadel 305 Mikroliter einer Lösung von 25 Milligramm pro Milliliter POPC in Chloroform in einen runden Glaskolben. Verdampfen Sie das Chloroform unter einem schwachen Strom von Stickstoffgas in einer Abzugshaube.Trocknen Sie das verbleibende Lipid über Nacht in einem Vakuum-Exsikkator. Lösen Sie den getrockneten Lipidkuchen anschließend in 200 µL MSP-Standardpuffer, angereichert mit 100 mmolaren Natriumcholat als Detergens, auf. Vortexen Sie die Mischung, bis sie transparent ist, um eine Suspension von 50 mmolaren POPC im Puffer zu erhalten.Waschen Sie danach fünf Gramm hydrophobe Perlen mit 30 Milliliter 100 % Methanol, anschließend mit 40 Milliliter ultrareinem Wasser und schließlich mit 10 Milliliter MSP-Standardpuffer. Lagern Sie die Perlen unter 15 Milliliter Standardpuffer bei vier Grad Celsius. Kombinieren Sie anschließend 190 Mikroliter einer 0,124 Millimolar-Lösung von MSP1E3D1 mit 61,5 Mikrolitern einer 50 Millimolar-Suspension von POPC in Puffer, um ein molares Verhältnis von MSP zu POPC von eins zu 130 und eine Natriumcholat-Konzentration von 25 Millimolar zu erhalten.Das ideale Verhältnis von Lipid pro MSP variiert je nach Wahl des Lipidtyps und MSP-Lens und muss optimiert werden, um eine homogene Zubereitung von Nanodisks zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang auf feuchtem Eis. Geben Sie anschließend die Lösung in ein Gefäß, das 0,5 Gramm gewaschene hydrophobe Bohnen pro Milliliter der Rekonstitutionsmischung enthält, um die Selbstassemblierung der Nanodisks einzuleiten.Die Mischung 16 Stunden bei vier Grad Celsius mit sieben bis acht Umdrehungen pro Minute inkubieren. Nach der Inkubation die Beads durch Schwerkraft absetzen lassen. Das Überstand auf vier Grad Celsius aufbewahren, bis die Gelpermeationschromatographie durchgeführt wird.Vor der Größenauschlusschromatographie die Mischung bei 13.000 g zehn Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Das Überstand aufgießen und den Pellet verwerfen. Eine Größenauschlusschromatographie-Säule mit MSP-Standardpuffer äquilibrieren, bis die Basislinie bei 280 Nanometern stabil ist.Das Überstand auf die Säule injizieren und das Produkt in Fraktionen von 0,5 Milliliter sammeln. Die Absorption der Fraktionen bei 280 Nanometern mit einem UV/Vis-Spektrophotometer messen. Die Konzentration der Nanoscheiben unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für das gewählte MSP berechnen.Um eine nichtdenaturierende Gelelektrophorese durchzuführen, mischen Sie zunächst 15 Mikroliter der Probe mit fünf Mikrolitern des geeigneten Lade-Puffers. Füllen Sie den Kathodenbehälter mit hellem Kathodenpuffer und den Anodenbehälter mit Laufpuffer. Laden Sie die Probe auf ein 4–16 %-Bis-Tris-Gel auf und beginnen Sie den Lauf.Färben Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Herstellung eines nanodisc-monotopen Protein-Komplexes mit fünf Lipoxygenase als Protein zu beginnen, bereiten Sie eine Charge MSP-Standardpuffer vor, die mit 1,5 Millimolar Calciumchlorid angereichert ist. Expressieren und reinigen Sie das 5LO-Protein.Bereiten Sie unverz&uuml;glich ein 100-Mikroliter-Gemisch aus 0,8 Mikromolar 5-LO und 0,8 Mikromolar Nanodisks in kalziumangereichertem MSP-Standardpuffer vor. Unser Beispiel f&uuml;r eine monotopische Proteinase, die f&uuml;nf Lipoxygenase, ist abh&auml;ngig von Kalziummengen, um an die Membran zu binden. 5-LO ist sehr empfindlich und muss innerhalb weniger Stunden nach der Herstellung verwendet werden.Die Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Die erhaltene Probe des Nanodisc-Proteinkomplexes bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius lagern. Um die Vorbereitung für die TEM-Analyse zu beginnen, ein Gramm Natriumphosphowolframat in 50 Milliliter ultrareinem Wasser bei Raumtemperatur auflösen.Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung auf 7,4 ein. Filtern Sie die Natriumphosphotungstat-Lösung durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Anschließend führen Sie eine Glimmentladung eines mit Kohlenstoff beschichteten Kupfergitters mit 400 Maschen für 20 Sekunden bei 30 Milliampere durch, um die Gitteroberfläche hydrophil zu machen.Tragen Sie zwischen 2,5 und fünf Mikrolitern der Probe des nanodiskotropen Protein-Komplexes auf das Gitter auf und lassen Sie die Probe 30 Sekunden einwirken. Anschließend entfernen Sie mit Filterpapier überschüssige Flüssigkeit vom Gitter. Geben Sie unmittelbar danach einen Tropfen Natriumphosphowolframat-Lösung hinzu und lassen Sie die Lösung 30 Sekunden einwirken.Entfernen Sie die überschüssige Lösung und lassen Sie das Objektträgergitter an der Luft trocknen. Führen Sie die Transmissionselektronenmikroskopie mit einer Beschleunigungsspannung von 120 bis 200 Kilovolt durch. Schließen Sie Aufnahmen, die lange Stapel zeigen, von der anschließenden Bildverarbeitung aus.Verwenden Sie für die ausgewählten Bilder Standardverfahren zur Bestimmung der Klassenmittelwerte und zur Erstellung eines 3D-Modells des monotopen Proteins im Nanodisk mit niedriger Auflösung. Mit dieser Methode wurden leere Nanodisks mit einem Verhältnis von eins zu 130 von Membran-Strukturproteinen zu Lipiden hergestellt. Während der Größenausschlusschromatographie wurde nur ein Hauptpeak beobachtet, und in der blauen Native-Gelelektrophorese zeigte sich nur ein einzelnes Band.Wenn die leeren Nanodisken mit einer Phosphowolframat-Natrium-Salzlösung behandelt werden, kommt es zur Stapelung. Diese langen Stapel können anschließend mittels TEM beobachtet werden. Diese Stapelung wurde nicht durch die Zugabe von Calciumionen in die Nanodisken-Lösung vor der Applikation der Phosphowolframat-Natrium-Lösung gestört.Wenn ein monotopisches Protein wie die 5-Lipoxygenase an die Oberfläche eines Nanodisks gebunden ist, wird das Stapeln durch sterische Behinderung durch das Protein verhindert. Beide Seiten des Nanodisks stehen für die Bindung zur Verfügung, wodurch die Bildung von Eins-zu-eins- und Zwei-zu-eins-5LO-Nanodisk-Komplexen ermöglicht wird. Die Probe mit Zwei-zu-eins-5LO-Nanodisk-Komplexen zeigte weniger Stapelung als die Eins-zu-eins-Probe.Die Bindung von 5-LO erfordert die Anwesenheit von Calciumionen. Dies wurde durch die Beobachtung von Aggregation in einer Mischung aus 5-LO und Nanodisks ohne Calcium bestätigt, was darauf hindeutete, dass 5-LO nicht an die Membranoberflächen gebunden hatte. Sobald das monotope Protein und die Nanodisks hergestellt sind, kann die Untersuchung der Proteinbindung an Ihre Membran an einem Nachmittag durchgeführt werden, sofern dies ordnungsgemäß erfolgt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Fläche des Proteins auf dem Nanodisc abzuschätzen, um die korrekte MSP-Länge auszuwählen. Bei gut angepassten Größen können maximal zwei extrinsische Proteine binden, jeweils eines auf jeder Seite der Scheibe. Ebenso wichtig ist es, das Natriumsalz von Phosphotungstensäure für die negative Färbung zu verwenden, um eine maximale Stapelung sicherzustellen, da die Bindung durch den Vergleich der Abwesenheit von Stapeln mit den langen Stapeln einer Probe ohne ein monotoptes Protein bestätigt wird.Die Verwendung von Nanodisks anstelle von Liposomen ermöglicht die Anwendung der dynamischen Lichtstreuung und der Röntgen-Kleiwinkelstreuung, um zusätzliche Fragen bezüglich der Probeneinhomogenität, Größe oder molekularen Struktur zu beantworten. Die 3D-Struktur eines monotonen Membranproteins, das an einen Nanodisk gebunden ist, in niedriger Auflösung könnte ein leicht zugänglicher erster Schritt auf dem Weg zur hochauflösenden Struktur solcher gebundenen Proteine sein.

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