Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung eines extrinsischen Membranproteins an eine Nanodisc-Membranoberfläche mittels negativer Färbetransmissionselektronenmikroskopie als ersten Schritt zur hochauflösenden Strukturaufklärung des Proteins sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in mehreren Forschungsbereichen zu beantworten, da es sich um Proteinaktivitäten handelt, die in und auf zellulären Membranen stattfinden. Der Hauptvorteil dieser Technik sind die charakteristischen Stapel von Nanodisc-Formen, wenn das Protein nicht an die Membranen binden kann.

Diese Stapel sind mit der Transmissionselektronenmikroskopie gut sichtbar. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Arzneimittelentwicklung, da Verbindungen leicht auf ihre Fähigkeit untersucht werden können, die Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen zu blockieren oder zu ermöglichen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die optimalen Bedingungen für die Bindung monotoper Proteine an Ihre Membran geben kann, bietet sie auch eine niedrig aufgelöste Struktur des Protein-Nanodisc-Komplexes.

Um das Verfahren zu beginnen, exprimieren und reinigen Sie Membrangerüstprotein wie MSP1E3D1. Anschließend werden mit einer Glasspritze und einer Metallnadel 305 Mikroliter von 25 Milligramm pro Milliliter POPC in Chloroform in einen Glaskolben mit rundem Boden abgegeben. Das Chloroform wird unter einem sanften Strom von Stickstoffgas in einem Abzug verdampft.

Trocknen Sie das restliche Lipid über Nacht in einem Vakuum-Exsikkator. Lösen Sie dann den getrockneten Lipidkuchen in 200 Mikrolitern MSP-Standardpuffer auf, der mit 100 Millimolar Natriumcholat als Reinigungsmittel angereichert ist. Die Mischung wird so lange durchströmt, bis sie transparent ist, um eine Suspension von 50 Millimolar POPC in Puffer zu erhalten.

Waschen Sie anschließend fünf Gramm hydrophobe Kügelchen mit 30 Millilitern 100%Methanol, dann mit 40 Millilitern Reinstwasser und schließlich mit 10 Millilitern MSP-Standardpuffer. Lagern Sie die Kügelchen unter 15 Millilitern Standardpuffer bei vier Grad Celsius. Kombinieren Sie dann 190 Mikroliter einer 0,124 millimolaren Lösung von MSP1E3D1 und 61,5 Mikrolitern einer 50 millimolaren Suspension von POPC in Puffer, was zu einem molaren Verhältnis von MSP zu POPC von eins zu 130 molar und einer Natriumcholatkonzentration von 25 Millimolar führt.

Das ideale Verhältnis des Lipids pro MSP variiert je nach Wahl des Lipidtyps und der MSP-Linse und muss optimiert werden, um eine homogene Vorbereitung der Nanodiscs zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang auf nassem Eis. Geben Sie dann die Lösung in ein Röhrchen mit 0,5 Gramm gewaschenen hydrophoben Bohnen pro Milliliter Rekonstitutionsmischung, um die Selbstorganisation der Nanodisc einzuleiten.

Inkubieren Sie die Mischung 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sieben bis acht Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Kügelchen nach der Inkubation durch die Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er für die Durchführung der Größenausschlusschromatographie bereit ist.

Vor der Größenausschlusschromatographie zentrifugieren Sie das Gemisch bei 13.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und entsorgen Sie das Pellet. Eine Größenausschlusschromatographiesäule wird mit MSP-Standardpuffer äquilibriert, bis die Basislinie bei 280 Nanometern stabil ist.

Injizieren Sie den Überstand auf die Säule und sammeln Sie das Produkt in 0,5-Milliliter-Fraktionen. Messen Sie die Absorption der Fraktionen bei 280 Nanometern mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Berechnen Sie die Konzentration der Nanodiscs unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für den gewählten MSP.

Um eine nicht denaturierende Gelelektrophorese durchzuführen, mischen Sie zunächst 15 Mikroliter der Probe mit fünf Mikrolitern des entsprechenden Ladepuffers. Füllen Sie den Kathodentank mit leichtem Kathodenpuffer und den Anodentank mit laufendem Puffer. Laden Sie die Probe auf ein vier bis 16%iges Bis-Tris-Gel und beginnen Sie den Lauf.

Färben Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Gelherstellers. Um mit der Herstellung eines monotopen Nanodisc-Proteinkomplexes mit fünf Lipoxygenasen als Protein zu beginnen, bereiten Sie eine Charge MSP-Standardpuffer vor, der mit 1,5 millimolarem Calciumchlorid angereichert ist. Exprimieren und reinigen Sie das 5LO-Protein.

Bereiten Sie sofort eine 100-Mikroliter-Mischung aus 0,8 mikromolaren 5LO- und 0,8 mikromolaren Nanodiscs in mit Kalzium angereichertem MSP-Standardpuffer vor. Unser Beispiel einer monotopen Proteinase, fünf Lipoxygenase, ist auf Kalziummengen angewiesen, um an die Membran zu binden. 5LO ist hochempfindlich und muss innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung verwendet werden.

Die Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Lagern Sie die resultierende Probe des Nanodisc-Proteinkomplexes bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius. Um mit der Vorbereitung für die TEM-Analyse zu beginnen, lösen Sie ein Gramm Phosphotungat-Natriumsalz in 50 Millilitern Reinstwasser bei Raumtemperatur.

Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer einmolaren Lösung von Natriumhydroxid auf 7,4 ein. Die Phosphotungat-Natriumlösung durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter filtrieren und die Lösung bei Raumtemperatur lagern. Als nächstes wird die Glimmentladung eines kohlenstoffbeschichteten Kupfergitters mit 400 Mesh für 20 Sekunden bei 30 Milliampere durchgeführt, um die Gitteroberfläche hydrophil zu machen.

Legen Sie zwischen 2,5 und fünf Mikroliter der monotopen Nanodisc-Proteinkomplexprobe auf das Gitter und lassen Sie die Probe 30 Sekunden lang ruhen. Tupfen Sie dann mit Filterpapier überschüssige Lösung vom Gitter ab. Tragen Sie sofort einen Tropfen Phosphoungat-Natriumlösung auf und lassen Sie die Lösung 30 Sekunden einwirken.

Tupfen Sie die überschüssige Lösung ab und lassen Sie das Gitter an der Luft trocknen. Führen Sie Transmissionselektronenmikroskopie mit einer beschleunigten Spannung von 120 bis 200 Kilovolt durch. Schließen Sie Bilder mit langen Stapeln von der nachfolgenden Bildverarbeitung aus.

Verwenden Sie für die ausgewählten Bilder Standardverarbeitungsmethoden, um die Klassendurchschnitte zu bestimmen und ein niedrig aufgelöstes 3D-Modell des monotopen Nanodisc-Proteins zu erstellen. Mit dieser Methode wurden leere Nanodiscs mit einem Verhältnis von Membrangerüstproteinen zu Lipiden von eins zu 130 hergestellt. Während der Größenausschlusschromatographie wurde nur ein großer Peak beobachtet und bei der blauen nativen Gelelektrophorese wurde nur eine Bande beobachtet.

Wenn die leeren Nanodiscs mit einer Phosphotungat-Natriumsalzlösung behandelt werden, wird eine Stapelung induziert. Diese langen Stapel können dann mit TEM beobachtet werden. Diese Stapelung wurde durch den Einschluss von Calciumionen in die Nanodisc-Lösung vor der Anwendung der Phosphotungat-Natriumlösung nicht gestört.

Wenn ein monotopes Protein wie die Fünf-Lipoxygenase an die Nanodisc-Oberfläche gebunden ist, wird das Stapeln durch eine stearinische Obstruktion durch das Protein behindert. Beide Seiten der Nanodisc stehen für die Bindung zur Verfügung, was die Bildung von Ein-zu-Eins- und Zwei-zu-Eins-5LO-Nanodisc-Komplexen ermöglicht. Die Probe von zwei zu einem 5LO-Nanodisc-Komplex wies eine geringere Stapelung auf als die Eins-zu-Eins-Probe.

Die 5LO-Bindung erfordert das Vorhandensein von Kalziumionen. Dies wurde durch die Beobachtung von Stapeln in einem Gemisch aus 5LO und Nanodiscs ohne Kalzium bestätigt, was darauf hindeutete, dass 5LO nicht an die Membranoberflächen gebunden hatte. Sobald das monotope Protein und die Nanodiscs vorbereitet sind, kann die Bewertung der Proteinbindung an Ihre Membran an einem Nachmittag durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Fläche des Proteins auf der Nanodisc zu schätzen, um die richtige MSP-Länge zu wählen. Bei gut abgestimmten Größen können maximal zwei extrinsische Proteine eines auf jeder Seite der Scheibe binden. Es ist auch wichtig, dass das Natriumsalz des Phosophowolframs für den negativen Stand verwendet wird, um eine maximale Stapelung zu gewährleisten, da die Bindung durch den Vergleich des Fehlens von Stapeln mit den langen Stapeln einer Probe ohne monotopes Protein bestätigt wird.

Die Verwendung der Nanodiscs anstelle von Liposomen ermöglicht den Einsatz von dynamischer Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung, um zusätzliche Fragen zur Homogenität der Probe, Größe oder Molekularstruktur zu beantworten. Die niedrig aufgelöste 3D-Struktur eines monotopen Membranproteins, das an eine Nanodisc gebunden ist, könnte ein leicht zugänglicher erster Schritt auf dem Weg zu einer hochauflösenden Struktur dieser gebundenen Proteine sein.