Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die invasive Fähigkeit von Krebszellen mithilfe eines dreidimensionalen Invasionsassays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Krebszellen zunächst in einer Basalmembranmatrix kultiviert werden. Die zelluläre Invasion in die Matrix wird anschließend über einen Zeitraum von fünf oder mehr Tagen mittels Lichtmikroskopie beobachtet.

Im letzten Schritt werden die Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern markiert, um die Lokalisation der Proteine von Interesse zu bestimmen. Letztendlich können die Rate der Invasion von Krebszellen und die resultierenden Veränderungen in der Proteinexpression mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Analyse untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Transwell-Kammer-Invasionsassay besteht darin, dass der 3D-Matrigel-Invasionsassay die in-vivo-Umgebung, in der wachsende Krebszellen voranschreiten, besser nachahmt.

Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Krebstherapie, wo neue Proteine identifiziert werden können, die an der Invasion und Metastasierung von Krebs beteiligt sind. Vor Beginn des Kultivierungsverfahrens stellen Sie die Basalmembran-Matrix, eine P-200-Pipette und Pipettenspitzen über Nacht bei vier Grad Celsius auf Eis. Am nächsten Tag verwenden Sie die Spitze der eiskalten 200-Mikroliter-Pipette, um 50 Mikroliter der Matrix in einer spiralförmigen Anordnung über den Boden einer Konfokal-Nummer-eins-Glasbodenkultur (Glass Bottom Dish) zu verteilen.

Legen Sie die Schale dann für mindestens 30 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, während die Matrix ihre Verfestigung durchläuft. Verdauen Sie die Zellen mit Trypsin, sobald sich bei einer 70 bis 80 % konfluenten 100-Millimeter-Platte die Zellen zu lösen beginnen. Inaktivieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern Medium und überführen Sie die Zellsuspension anschließend in ein 15-Milliliter-Konischglas. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 100 × g und 4 Grad Celsius, während sich die Zellen absetzen.

Geben Sie jeweils 50 Mikroliter Matrix in ein 1-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Schale mit Basalmembranmatrix und stellen Sie die Röhrchen auf Eis, sobald die Zellen durch die Zentrifugation abgeschlossen sind. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie anschließend. Suspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter Medium und zählen Sie sie danach.

Überführen Sie 2,5 × 10⁴ Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und ergänzen Sie die Zellsuspension mit Medium auf ein Endvolumen von 50 µl. Geben Sie anschließend 50 µl eiskalte Basalmembranmatrix im Verhältnis 1:1 zu den Zellen, sodass ein Endvolumen von 100 µl erreicht wird. Pipettieren Sie die Matrix-Zell-Mischung vorsichtig auf die bereits erhärtete Basalmembranmatrix und lassen Sie die Zellen im Zellkulturgehäuse in der Matrix einbetten.

Nach 30 Minuten den Matrix mit zwei Milliliter Medium abdecken und die Schale für die Dauer des Experiments zurück in den Inkubator stellen, wobei das Medium täglich gewechselt wird. Verwenden Sie für die Dauer des Experiments einmal täglich das 10×-Objektiv eines Lichtmikroskops, um 20 Differenzinterferenz-Kontrastbilder der in der Basalmembranmatrix suspendierten Kolonien aufzunehmen. Analysieren Sie die Bilder verblindet, um die sternförmige Bildung der Zellkolonien zu bestimmen.

Eine Kolonie gilt als stellat, wenn eine oder mehrere Ausstülpungen vom Zellkörper aus beobachtet werden. Um die morphogenetischen Merkmale der 3D-Kolonien zu untersuchen, nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf ein Eisbad. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Kolonie anschließend dreimal mit je zwei Milliliter kalter PBS.

Nach der letzten Wäsche die Zellen in zwei Milliliter 20 % Aceton, 80 % Methanol-Lösung 20 Minuten bei vier Grad Celsius fixieren und anschließend die Schalen auf Raumtemperatur zurückbringen. Sobald die Basalmembran-Matrix Raumtemperatur erreicht hat, das Fixansmittel abpipettieren und die Platte dreimal wie gerade gezeigt mit PBS waschen. Nach der letzten Wäsche unspezifische Bindungsstellen an den Zellen mit zwei Milliliter 3 % BSA mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur blockieren.

Anschließend inkubieren Sie die Zellen mit den gewünschten primären Antikörpern, die in 3 % BSA verdünnt sind, bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde entfernen Sie die Lösung mit dem primären Antikörper, nachdem Sie dreimal mit PBS die nicht gebundenen Antikörper abgewaschen haben. Geben Sie dann den sekundären Antikörper, der in 3 % BSA in der geeigneten Verdünnung gelöst ist, hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach dem Abwaschen des nicht gebundenen sekundären Antikörpers mit PBS färben Sie die Zellkerne in zwei Millilitern Hoeschst 33342 in PBS fünf Minuten lang im Dunkeln.

Anschließend wird das nicht gebundene Hext fünfmal mit PBS von den Zellen gewaschen. Nach dem fünften Waschschritt wird Puffermedium direkt auf die Matrix-Zell-Mischung gegeben und vorsichtig mit einem Glasdeckel abgedeckt, um Störungen der Integrität der Basalmembranmatrix-Zell-Mischung zu vermeiden. Die Probe wird über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop bei den geeigneten Laserwellenlängen für die in diesen Bildern verwendeten Antikörper aufgenommen.

Es werden MDA MB 2 3 1-Zellen gezeigt, die eine 3D-Matrix invadieren. Die Zellen wurden am ersten Tag in die Matrix eingebettet und bildeten ab dem dritten Tag invasive sternförmige Strukturen aus. Am fünften Tag war eine vollständige Invasion der Matrix zu beobachten.

Die Anzahl der gebildeten sternförmigen Kolonien wurde anschließend gezählt und als Prozentsatz der Gesamtanzahl der invasiven und nicht-invasiven Kolonien pro Petrischale angegeben. Da die Messungen zudem täglich über fünf Tage hinweg durchgeführt wurden, konnte die Invasionsrate ebenfalls anhand dieser immunfluoreszenten Bilder bewertet werden. Repräsentative invasive sternförmige Kolonien von MDA MB 2 3 1-Zellen, die einen Verlust der Membranintegrität sowie eine diffuse Lokalisation des Basalmembranproteins Laminin fünf zeigen, stehen im deutlichen Kontrast zu dem, was in den MDA MB 2 31-Brustkrebszellen beobachtet wird.

Das Laminin fünf wurde in einer intakten Basalmembranschicht lokalisiert, die das Gedächtnis der unbehandelten, nicht malignen MCF 10 A-Zellen umgibt. Nach diesem Verfahren kann eine Kokultur mit Stromazellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Krebszellen nach ihrer Entwicklung im Mikromilieu mit Stromazellen kommunizieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg, um die Invasion und Migration von Krebszellen zu untersuchen, wobei beide Prozesse für die metastatische Ausbreitung von Krebszellen erforderlich sind.