Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Invasionsfähigkeit von Krebszellen mit Hilfe eines dreidimensionalen Invasionsassays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst Krebszellen in einer Basalmembranmatrix kultiviert werden. Die zelluläre Invasion der Matrix wird dann fünf oder mehr Tage lang lichtmikroskopisch beobachtet.

Im letzten Schritt werden die Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern markiert, um die interessierenden Proteine zu lokalisieren. Letztendlich können die Rate der Invasion von Krebszellen und die daraus resultierenden Veränderungen in der Proteinexpression durch Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie dem Transwell-Kammer-Invasionsassay besteht darin, dass der 3D-Major-Gel-Invasionsassay die In-vivo-Umgebung, die Krebs beim Wachstum löst, besser nachahmt.

Die Implikation dieser Technik ist für die Krebstherapie, bei der in Studien neue Proteine identifiziert werden können, die an der Krebsinvasion und Metastasierung beteiligt sind. Bevor Sie mit dem Kulturvorgang beginnen, legen Sie die Basalmembranmatrize, eine P 200-Pipette und Pipettenspitzen über Nacht bei vier Grad Celsius auf Eis. Verteilen Sie am nächsten Tag mit der Spitze der eiskalten 200-Mikroliter-Pipette 50 Mikroliter der Matrix spiralförmig auf dem Boden einer konfokalen Glasbodenschale mit Nummer eins.

Stellen Sie dann die Schale für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Zellkultur-Inkubator, während sich die Matrix verfestigt. Trypsin-Augen, eine 70 bis 80 % konfluente 100-Millimeter-Platte mit Zellen, sobald sich die Zellen abzulösen beginnen. Inaktivieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern Medium und überführen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 100 g und vier Grad Celsius, während sich die Zellen nach unten drehen.

Aliquotieren Sie 50 Mikroliter Matrix in ein Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Schale mit Basalmembranmatrix und legen Sie die Röhrchen auf Eis, wenn die Zellen sich fertig gedreht haben. Saugen Sie den Überstand an, ohne das Pellet zu stören, und reaktivieren Sie ihn anschließend. Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Medium und zählen Sie sie als nächstes.

2,5 mal 10 zu den vierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Zellsuspension mit Medium auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern auffüllen. Geben Sie dann die 50 Mikroliter eiskalte Basalmembranmatrix im Verhältnis eins zu eins zu den Zellen für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern. Plattieren Sie die Matrix-Zell-Mischung vorsichtig auf die erstarrte Basalmembranmatrix und lassen Sie die Zellen in die Matrix im Zellkultur-Inkubator eingebettet werden.

Nach 30 Minuten bedecken Sie die Matrix mit zwei Millilitern Medium und stellen Sie die Schale wieder in den Inkubator, wobei Sie das Medium für die Dauer des Experiments täglich wechseln, verwenden Sie das 10-fach-Objektiv eines Lichtmikroskops einmal täglich für die Dauer des Experiments, um 20 differentielle Interferenzen zu erfassen. Kontrastbilder der in der Basalmembranmatrix suspendierten Kolonien. Analysieren Sie die Bilder blind, um die Sternbildung der Zellkolonie zu bestimmen.

Eine Kolonie gilt als sternförmig, wenn eine oder mehrere Projektionen des Steroids von Zellen beobachtet werden. Um die morphogenen Eigenschaften der 3D-Kolonien zu untersuchen, nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie auf eine Schale mit Eis. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Kolonie dann dreimal mit zwei Millilitern kaltem PBS.

Fixieren Sie die Zellen nach dem letzten Waschen 20 Minuten lang in zwei Millilitern 20%iger Aceton- und 80%Methanollösung bei vier Grad Celsius und bringen Sie das Geschirr dann wieder auf Raumtemperatur. Sobald die Basalmembranmatrix Raumtemperatur erreicht hat, aspirieren Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, wie gerade gezeigt. Blockieren Sie nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung an die Zellen mit zwei Millilitern 3%BSA für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Dann inkubieren Sie die Zellen in den interessierenden Primärantikörpern, verdünnt in 3 % BSA bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde entfernen Sie die Primärantikörperlösung, nachdem Sie den ungebundenen Primärantikörper dreimal mit PBS weggewaschen haben, fügen Sie den in 3%BSA gelösten Sekundärantikörper in der entsprechenden Verdünnung hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach dem Abwaschen des ungebundenen Sekundärantikörpers mit PBS färben Sie die Zellkerne in zwei Millilitern hext 3, 3, 2, 5, 8 in PBS für fünf Minuten im Dunkeln.

Dann waschen Sie das ungebundene Hext fünfmal mit PBS aus den Zellen. Geben Sie nach dem fünften Waschen das Eindeckmedium direkt auf die Matrix zur Zellmischung und decken Sie das Eindeckmedium vorsichtig mit einem Glasdeckglas ab, um Störungen der Integrität der Basalmembranmatrix und der Zellmischung zu vermeiden. Trocknen Sie das Gericht über Nacht bei Raumtemperatur und nehmen Sie dann Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop bei den entsprechenden Laserwellenlängen für die in diesen Bildern verwendeten Antikörper auf.

MDA MB 2 3 1 Zellen, die in eine 3D-Matrix eindringen, sind dargestellt. Die Zellen betteten sich am ersten Tag in die Matrix ein und begannen am dritten Tag, invasive Sternstrukturen zu bilden. Am fünften Tag konnte eine vollständige Invasion der Matrix beobachtet werden.

Die Anzahl der gebildeten Sternkolonien wurde dann gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl der invasiven und nicht-invasiven Kolonien pro Schale ausgedrückt. Da die Messungen fünf Tage lang täglich durchgeführt wurden, konnte die Invasionsrate auch in diesen Immunfluoreszenzbildern bewertet werden. Repräsentative invasive Sternkolonien von MDA MB 2 3 1 Zellen, die einen Verlust der Membranintegrität und der diffusen Lokalisation des Basalmembranproteins laminin five aufweisen, stehen in starkem Kontrast zu dem, was in den MDA MB 2 31 Brustkrebszellen beobachtet wurde.

Das Laminin fünf wurde auf einer intakten Basalmembranschicht lokalisiert, die das Gedächtnis der unbehandelten nicht-malignen MCF 10 A-Zellen umschließt. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Co-Kultur mit Stromazellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Krebszellen nach ihrer Entwicklung in der Mikroumgebung mit Stromazellen interagieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg für die Erforschung der Krebsinvasion und -migration, die beide für die metastasierende Ausbreitung von Krebszellen erforderlich sind.