Herstellung und Analyse von In Vitro Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahrensreihe ist es, dreidimensionale Zellkulturen zu erzeugen, die als in vitro Brustkrebs-Surrogate fungieren, und eine Methode zur Messung des Zellwachstums in histologischen Schnitten der Surrogate vorzustellen. Die dreidimensionale Zellkultur ist eine physiologisch relevantere Methode, um das Zellverhalten in vitro zu modellieren, als die zweidimensionale Zellkultur. Durch die Veränderung der zellulären Zusammensetzung unter experimentellen Bedingungen können diese Verfahren angepasst werden, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu beantworten und die Wirksamkeit von Therapeutikakandidaten zu bewerten.

Um die Zellen in die EZM einzubauen, geben Sie die Zellen und die ersten vier verwandten Komponenten, die in Tabelle eins im begleitenden Manuskript aufgeführt sind, auf Eis in ein zwei Millimeter großes Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie sie anschließend vorsichtig durch Pipettieren und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Überwachen Sie den pH-Wert mit dem Phenolrot im 10XD MEM, um sicherzustellen, dass die Mischung eine orange-rosa Farbe aufweist, was auf einen pH-Wert von sieben hinweist.

Wenn die Mischung gelb erscheint und der pH-Wert zu niedrig ist, fügen Sie langsam 7,5 Prozent Natriumbicarbonat tropfenweise hinzu, bis die entsprechende Farbe erreicht ist. Denken Sie daran, die Mischung auf Eis zu halten, und arbeiten Sie schnell, um eine vorzeitige EZM-Polymerisation zu verhindern. Bei festen 3D-Kulturen halten Sie den Kammerschieber auf Eis, um eine vorzeitige ECM-Polymerisation zu verhindern.

Pipettieren Sie langsam 100 Mikroliter der Zell-ECM-Mischung in jede Vertiefung des Objektträgers mit acht Vertiefungen und pipettieren Sie die Zell-EZM-Mischung an den Rändern der Vertiefung, um die Mischung besser zu verteilen. Als nächstes inkubieren Sie die Surrogate 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent CO2, um die ECM-Polymerisation zu ermöglichen. Nach fünfundvierzig Minuten geben Sie 100 Mikroliter des Nährmediums in jede Vertiefung und inkubieren Sie für die Dauer des Experiments bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2.

Wechseln Sie das Nährmedium alle zwei Tage. Eine Einschränkung der 3D-Kultur besteht darin, dass die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in das Volumen möglicherweise nicht ausreicht, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu unterstützen. Die Hinzufügung eines Bioreaktorsystems kann dazu beitragen, diese Einschränkung zu überwinden und das Wachstum zu fördern.

Um 3D-Kulturen in einem Bioreaktorsystem zu reichlich zu machen, bereiten Sie den Teil des Bioreaktorsystems, in dem sich die Surrogate befinden, steril vor und setzen Sie ihn zusammen. Injizieren Sie in einer Zellkulturhaube mit einer Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel das Zell-ECM-Gemisch in den Bereich des Perfusionsbioreaktors, der für die Aufnahme von Zellen ausgelegt ist, und fahren Sie schnell mit dem nächsten Schritt fort. Um eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen innerhalb der Surrogate zu gewährleisten, legen Sie die Bioreaktorkomponente, in der sich die Surrogate befinden, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Drehen Sie die Surrogate kontinuierlich bei 18 U/min, während Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem In-situ-Hybridisierungsofen oder einem Inkubator inkubieren, um die ECM-Polymerisation zu ermöglichen. Nach der Polymerisation und der Zugabe von Medium verbinden Sie die Bioreaktorbaugruppe mit der Pumpe. Starten Sie die mittlere Perfusion in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent CO2.

Setzen Sie die Perfusion des Mediums für die Dauer des Experiments fort, und wechseln Sie das Kulturmedium nach Bedarf für das jeweilige Versuchsdesign. Am Ende des Experiments umhüllen Sie die Surrogate mit Probenverarbeitungsgel, um die Surrogate während der Verarbeitung intakt zu halten und die histologische Schnittbestimmung zu erleichtern. Schmelzen Sie dazu das Probenverarbeitungsgel in einem 60 Grad Celsius warmen Wasserbad, bis es gebrauchsfertig ist.

Pipettieren Sie dann etwa 300 Mikroliter Probenverarbeitungsgel in den Boden eines markierten Kryomolds. Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge und einer Pinzette vorsichtig ein Surrogat aus dem Bioreaktor oder aus der Vertiefung eines Objektträgers mit acht Vertiefungen und legen Sie es in die Kryoformen, die das Gel für die Probenverarbeitung enthalten. Pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter Probenverarbeitungsgel, um das Surrogat in der Kryoform abzudecken.

Inkubieren Sie es dann 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sobald sich das Probenverarbeitungsgel verfestigt hat, entfernen Sie das Probenverarbeitungsgel, das das Surrogat enthält, aus dem Kryomold und legen Sie es in eine Gewebekassette. Wenn mehr als ein Surrogat in dieselbe Gewebekassette eingebracht werden soll, können Gewebemarkierungsfarbstoffe verwendet werden, um Proben nach der Fixierung und Verarbeitung zu unterscheiden.

Sie anschließend die Gewebekassette mit dem Surrogat für zehn bis zwölf Stunden bei Raumtemperatur in eine zehnprozentige neutral gepufferte Formel, um eine vollständige Fixierung zu ermöglichen. Übertragen Sie nach der Fixierung die Gewebekassette mit dem Surrogat auf 70 Prozent Ethanol. Die fixierte Leihmutter ist nun bereit für die Verarbeitung zu Paraffin und die anschließende histologische Schnittbildung.

Um die Zelldichte und photomikroskopische Bilder von H- und E-gefärbten Schnitten zu messen, öffnen Sie eine Bilddatei des Surrogats. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug in ImageJ und die Kanten des ECM als Richtlinie, um den Bereich des Surrogats zu umreißen, indem Sie die Maus ziehen und klicken, um Ankerpunkte zu erstellen. Wählen Sie nach der Gliederung auf der Registerkarte Analysieren die Option Messen aus.

Laden Sie als Nächstes die Bilddateien, die zum Messen der Ersatzfläche verwendet werden, in Cell Profiler hoch, indem Sie die Bilddateien in die Dateiliste ziehen. Weisen Sie dann jedem Bild, das im Modul "Namen und Typen importieren" importiert wird, einen Namen zu und wählen Sie den Bildtyp aus. Nachdem die Analysepipeline generiert wurde, starten Sie den Testmodus, und klicken Sie auf In Cell Profiler ausführen.

Und bewerten Sie gefilterte Objekte, um sicherzustellen, dass die Mehrheit der Kerne im Testbild korrekt identifiziert und die optimalen Parameter zur Identifizierung der Zellen ausgewählt werden. Die enthaltenen Kerne werden grün eingekreist. Speichern Sie dann das Projekt, beenden Sie den Testmodus und klicken Sie auf Bilder analysieren.

Hier ist ein repräsentatives Bild des H- und E-gefärbten Schnitts von einem perfundierten Surrogat, das sieben Tage lang gezüchtet wurde. Und dies ist ein repräsentatives Bild des H- und E-gefärbten Abschnitts von einem festen Surrogat, das sieben Tage lang gezüchtet wurde, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wurde. Die Zellularität ist bei den soliden Surrogaten viel geringer.

Diese Grafik zeigt den Vergleich der mittleren Anzahl kernhaltiger Zellen pro Fläche nach sieben Tagen Wachstum. Eine durchblutete und solide Leihmutter. Diese numerischen Daten stützen die Zellularität in den Mikrofotografien der H- und E-gefärbten Schnitte.

Und diese Grafik zeigt den Vergleich des Ki-67-Markierungsindex, der die Messung der Zellproliferation nach siebentägigem Wachstum von perfundierten und festen Surrogaten darstellt. Diese Daten unterstützen erneut ein stärkeres Wachstum bei perfundierten Leihmüttern. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie In-situ-Hybridisierung und Aminohistochemie an histologischen Schnitten der Surrogate durchgeführt werden, um Fragen wie RNA- und Proteinexpression zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dreidimensionale In-vitro-Gewebe-Surrogate vorbereiten und verarbeiten und Surrogatanalysen an H- und E-gefärbten histologischen Schnitten durchführen.