Name: Herstellung und Analyse von In Vitro Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von 3D-Mammakarzinom-Surrogaten in einem Perfusionsbioreaktor zur Analyse von Zelldichte und Wachstum. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante in-vitro-Modelle für Krebsforschung und Therapietests.

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Das Zentrum für metabolische Knochenkrankheit der Universität von Alabama in Birmingham führte die histologische Bearbeitung und Sektionierung von Leihmüttern durch. Southern Research (Birmingham, AL) unterstützte die Herstellung des Bioreaktorsystems. Die Finanzierung erfolgte durch das Breast Cancer Research Program (BC121367 des US-Verteidigungsministeriums.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hierin wurde ein Verfahren der 3D-Kultur beschrieben, die Komponenten des Gewebemikroumgebung beinhaltet, einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und menschliche Stromazellen Fibroblasten, in einem Volumen, das genauer Modelle menschlichen Brustkrebs für die Entwicklung eines zusammenfassenden 3D-Morphologie zu ermöglichen, . Die 3D-Kultivierungsverfahren beschrieben ist repräsentativer für menschliche Krankheiten als herkömmliche 2D-Zellkultur, dass mehrere Zelltypen werden in einem 3D-Volumen von ECM integrier...

Dreidimensionale (3D) Kulturmodelle , die genauer den Tumor Architektur und Mikroumgebung in vivo nachahmen sind wichtig für die Studien mit dem Ziel , die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu sezieren und die Wirksamkeit von Therapien Kandidaten zu testen. Tumor Dimensionalität Auswirkungen von Nährstoffen und Sauerstoff - Gradienten, die Gleichförmigkeit der Wirkstoffexposition, interstitielle Druck / Durchblutung und 3D - Architektur 1-4. Die Anwesenheit eines geeigneten stromalen Mikroumgebung trägt zur Tumor Dimensionalität und Einflüsse zell ECM Signalisierungs- und parakrine Signalisierung zwischen Stromazellen und maligne Epithelzellen. Die Auswirkungen von Tumor Dimensionalität und der Mikroumgebung auf die Zellfunktion sind gut etabliert, mit beiden Faktoren verändern Arzneimittelreaktion 1,3,5-8. Zusätzlich Zellwachstum Kinetik, Stoffwechselraten und Zellsignalisierung unterscheiden sich zwischen den zweidimensionalen (2D) Kultur und Kultur in 3D, mit diesen Faktoren affefesselndes zelluläre Antwort 1,3,8-10. In vitro kann der Tumor - Mikroumgebung Surrogat indem repräsentative ECM Bestandteile und Stroma - Zellpopulationen moduliert werden. Maligne Epithelzellen werden durch das ECM und Krebs-assoziiertes Stroma - Zellen , die entweder in einer synergistischen / protektiv Weise beeinflusst Tumorprogression oder in einer unterdrückenden Art und Weise weiter zu fördern Tumorausbreitung 5,6,10 hemmen. In jedem Zusammenhang kann das Stroma beeinflussen therapeutische Reaktion und Arzneimittelabgabe über parakrine Signalisierungs- und / oder durch interstitiellen Druck in dem Tumor Erhöhung was zu einer verringerten Medikamentenabgabe 1,6. Daher hilft die Zugabe von ECM und Stromazellen in präklinischen Modellen Aspekte des Tumors rekapitulieren, die nicht gut in 2D Kultur modelliert werden können. Hierin wird ein Verfahren Brustkrebs Surrogate zu etablieren, die eine zusammenfassender Mikro integrieren, einschließlich ECM Bestandteile und stromal Zellen in einem 3D-Volumen beschrieben. In Brustkarzinom ist die stromale Zellpopulation überwiegend wird Krebs-Fibroblasten (CAF) und dem Stroma ECM besteht aus weitgehend von Kollagen Typ zusammengesetzt I mit einem kleineren Anteil der Matrixkomponenten, die in der Basalmembran gefunden werden, einschließlich Laminin und Kollagen Typ IV 1,4,11-13. Daher werden diese Komponenten des Mammakarzinoms Mikroumgebung (dh, CAF, Kollagen I und Basalmembran) wurden in die Surrogate eingebaut. Dieses Verfahren kann verwendet werden , um feste, nicht-perfundierten 3D Surrogate (1A) zu erzeugen , oder können angepasst werden Perfusion des Mediums durch das Surrogat über ein Bioreaktorsystem (1B) aufzunehmen. Beide Ansätze werden hier beschrieben. Dieses Verfahren könnte auch auf andere stromalen Elemente modifiziert werden, wie beispielsweise Tumor-assoziierten Makrophagen, oder andere feste Tumore zu modellieren, indem die zellulären und ECM-Komponenten, gegebenenfalls anzupassen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Für das Surrogat Mammakarzinoms hier beschrieben, haben wir die MDA-MB-231 (231) Brustkrebs-Zelllinie, CAF zuvor von menschlichen Brustkarzinom 14 und eine ECM , bestehend aus 90% Kollagen I isoliert verwendet ( 6 mg / ml) und 10% Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran Material (BM). Der Ersatz wird in einem 8-Well-Kammerobjektträger (fest Surrogat) oder ein Bioreaktorsystem verwendet wird, um entweder angebaut kontinuierliche Nährstoff Perfusion zu liefern (durchbluteten Surrogat). Jede Perfusions - Bioreaktor - System , das ein Volumen von ECM enthaltenden Zellen aufnehmen kann , kann 15 verwendet werden. Als Beispiel beschreiben wir die Herstellung der Gewebe Surrogate im Bioreaktorsystem. Dieses System wurde im eigenen Haus entwickelt und ist nicht im Handel erhältlich. Weil unsere hier konzentrieren sich auf die Vorbereitung und Analyse der 3D-Gewebe Surrogate ist, haben wir nicht in umfangreichen Detail in Bezug auf die Besonderheiten der Herstellung und Montage unserer Bioreaktorsystem gegangen. Jedoch wird eine detaillierte Beschreibung vonDieses System und seine Entwicklung wurde 16 veröffentlicht. In diesem Bioreaktorsystem, ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Strömungskanal des Surrogat zu Haus verwendet wird, die von einem PDMS - Schaum unterstützt wird (gebildet Methoden ähnlich denen von Calcagnile beschriebenen et al. 17). Dieses Volumen wird von 4 Mikrokanäle (jeweils 400 &amp; mgr; m im Durchmesser) durchsetzt, die durch Medium über eine microphysiologic Pumpe kontinuierlich durchblutet werden Sauerstoff und Nährstoffe zum Ersatz zu liefern. Entsprechende Analyse der Surrogate ist entscheidend wichtige Informationen in Bezug auf die Zellfunktion in Reaktion auf die Behandlung oder andere Manipulationen zu gewinnen. Surrogates kann durch verschiedene Verfahren einschließlich der direkten Bildgebung von intaktem Surrogate mittels konfokaler Mikroskopie oder andere Mittel der nichtinvasiven Bildgebung, indirekte Zellanalyse durch Bestimmung des konditionierten Medien oder Perfusat, für sezernierte Produkte oder Analyse auf histologischen Schnitten nach der Fixierung und Verarbeitung analysiert werden, nachParaffin. Ein solcher Parameter, der auf histologischen Schnitten ausgewertet werden kann, ist die Zelldichte. Wir stellen einen Ansatz Zelldichte zu messen (dh die Anzahl von nukleierten Zellen pro Querschnittsfläche) unter Verwendung von halbautomatischen Bildverarbeitungstechniken auf Mikrophotographien von Surrogat histologischen Schnitte angewendet gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E). Die Zelldichte kann als ein Indikator der relativen Änderung der Zellzahl über die Zeit verwendet werden, oder dass die Ergebnisse von unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und Behandlungen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> Abbildung 1. 3D - Volumen und Bioreaktorsystem. A) Schematische Darstellung des Prozesses solide 3D ​​- Surrogate zu erzeugen. Top: Karikatur von festen 3D-Volumen enthalten, ECM (pink), epithelialen Karzinomzellen (gelb) und CAF (orange); Unten:. Draufsicht auf 8-Well - Kammer - Folie mit Surrogaten B) Schematische Darstellung des Prozesses 3D Surrogate durchbluteten zu erzeugen. Top: cartoon von 3D-Volumen mit Kanälen für mittlere Perfusion und enthält ECM (pink), epithelialen Karzinomzellen (gelb) und CAF (orange) zu ermöglichen; Mitte: Bild von PDMS Strömungskanal enthält PDMS Schaum (schwarzer Pfeil), um mit Zelle injiziert + ECM und drang durch polymerbeschichteten rostfreien Stahldrähten (pink Pfeil) Messung 400 &amp; mgr; m im Durchmesser; Unten:. Bild des PDMS Strömungskanal einen Surrogat und mit dem Bioreaktorsystem zu ermöglichen , für die kontinuierliche Mediumperfusion (Schlauchpumpe und Medienspeicher nicht dargestellt) C) Bilder von Verarbeitungsschritten für sowohl feste als auch perfundiert Surrogate nach Kultur enthält. Links: Bild des cryomold Probenverarbeitung Gel und Surrogat enthält; Mitte: Bild eines Paraffinblock eine feste und verarbeitet Surrogat enthält; Rechts:. Bild von einem Glasträger mit einem H &amp; E-gefärbten histologischen Schnitt eines Ersatz <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">um anzuzeigen</a>Größere Version der Figur.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin + 2,21&nbsp; mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten, 100&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten, 35&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Produkte</td> 229638 <td>Für die PDMS-Schaumbildung&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>9" Glaspipette</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-678-20D</td><td>Steril</td></tr><tr><td>10 ml Pipette</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>Steril</td></tr><tr><td>1.000 & Mikro; l Piptettenspitzen</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td><td>Steril gefiltert</td></tr><tr><td>200 & Mikro; l Pipettenspitzen</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>Steril gefiltert</td></tr><tr><td>10 & Mikro; l Pipettenspitzen</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>Sterile gefilterte</td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229422</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>Steriles</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>keimfrei</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>PDMS-Elastomer und Härtungsmittel. Wird für unseren hauseigenen Bioreaktor verwendet.</td></tr><tr><td>PDMS-Schaum</td><td></td><td></td><td>Aus eigenem Haus für den Einsatz in unserem hauseigenen Bioreaktor.</td></tr><tr><td>Hochkonzentriertes Rinderkollagen Typ I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133-A</td><td>FibriCol ~10 mg/ml</td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor Reduziertes Matrigel (Basalmembran)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Basalmembranmaterial</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularbiologischer Qualität</td><td>Fisher</td><td>BP2819-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammer-Gleitsystem&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td><td>8-Well-Bioreaktor</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>aus eigener Herstellung.</td></tr><tr><td>Rückfederung 304 Edelstahl Beschichtet mit PTFE-Polymer</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T19</td><td>Edelstahldrähten zur Erzeugung von Mikrokanälen in unserem hauseigenen Bioreaktorsystem. 0,016"</td></tr><tr><td>Durchmesser BioPharm Plus platingehärteter Silikonpumpenschlauch, L/S 14</td><td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>Für den Einsatz in unserem hauseigenen Bioreaktorsystem. Schlauch-ID: 1,6 mm, Schlauchtülle: 1/16 Zoll</td></tr><tr><td>2-Stopp-Schlauchsätze, PVC nicht aufgeweitet, 1,52&nbsp; mm ID</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>Für den Einsatz in unserem hauseigenen Bioreaktorsystem (mit mikroperistalischer Pumpe).&nbsp;</td></tr><tr><td>Sechskanalige Präzisions-Mikroperistaltikpumpe</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74906-04</td><td>Zur Verwendung mit unserem hauseigenen Bioreaktorsystem</td></tr><tr><td>Tuberculin Syringes</td><td>BD Medical</td><td>309625</td><td>26 Gauge 3/8 Zoll Nadel; Sterile</td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td><td>5,5-Zoll-Mini-Röhrenrotator</td></tr><tr><td></td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>Ausrüstungsoption für die Leihmutterrotation. Verwendung mit Karussell für 50 ml Röhrchen (Modellnummer 260753)</td></tr><tr><td>50 ml Röhrchenkarussell</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>Verwendung mit Mini-Röhrchenrotator</td></tr><tr><td>Bambino&nbsp; Hybridisierungsofen</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>Ausrüstungsoption für die Surrogatrotation</td></tr><tr><td>HistoGel für die Probenverarbeitung</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Gel für die Probenverarbeitung, beschrieben in Schritt 5.2</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Gewebemarkierungsfarbstoff</td><td>Cancer Diagnostics, inc.&nbsp;</td><td>03000P</td><td>Kann zur Markierung von Surrogaten verwendet werden&nbsp; so dass mehrere Proben in eine Gewebekassette aufgenommen werden können&nbsp;</td></tr><tr><td>Klappbare Gewebekassetten&nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>GoldSeal Objektträger Thermo</td><td>Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof (100%), USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>Klärer</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>Bläuelösung</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL-Aufnahme Medien</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und analyse von<em&gt; in vitro</em&gt; three dimensional mammakarzinoms surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Dreidimensionale (3D) Kultur ist eine physiologisch relevante Methode Zellverhalten in vitro als zweidimensionale Kultur zu modellieren. Karzinome, Brustkarzinome, einschließlich, sind komplexe 3D-Gewebe von Krebs besteht Epithelzellen und Stromazellen Komponenten, einschließlich Fibroblasten und extrazelluläre Matrix (ECM). Doch die meisten in vitro - Modelle von Mammakarzinom nur von Krebs epithelialen Zellen bestehen, Weglassen des Stromas und damit die 3D - Architektur eines Tumors in vivo. Entsprechende 3D-Modellierung von Karzinomen ist wichtig für eine genaue Verständnis der Tumorbiologie, Verhalten und Ansprechen auf die Therapie. Jedoch wird die Dauer der Kultur und das Volumen von 3D-Modellen durch die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffe in der Kultur beschränkt. Hierin zeigen wir ein Verfahren, bei dem Mammakarzinom Epithelzellen und Stromazellen Fibroblasten in ECM integriert sind ein 3D Brustkrebs Surrogat zu erzeugen, das Stroma enthält und als kultiviert werden,solide 3D-Struktur oder durch eine Perfusionsbioreaktorsystem System unter Verwendung von Sauerstoff und Nährstoffe zu liefern. Nach Einrichtung und einer anfänglichen Wachstumsperiode Surrogate können für die präklinische Drogentests verwendet werden. Alternativ können die zelluläre und Matrixkomponenten des Surrogat modifiziert werden, um eine Vielzahl von biologischen Fragen anzugehen. Nach der Kultur werden fixiert und Surrogate, in einer Weise zur Auswertung von Parametern von Interesse für die Behandlung der klinischen Brustkarzinom Proben, ähnlich zu Paraffin verarbeitet. Die Auswertung eines solchen Parameters, der Dichte der Zellen vorhanden ist, erklärt, wobei ImageJ und CellProfiler Bildanalysesoftwaresysteme Photomikrographien von histologischen Schnitten von Surrogaten angewendet werden, um die Anzahl von nukleierten Zellen pro Fläche zu quantifizieren. Dies kann als ein Indikator für die Veränderung der Zellzahl über die Zeit oder der Veränderung der Zellzahl verwendet werden, die aus unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und Behandlungen.

Sowohl feste und durchbluteten Surrogate 3D Brustkrebs wurden wie oben beschrieben hergestellt und gezüchtet für 7 Tage. Anschließend wurden Surrogate fixiert, verarbeitet zu Paraffin, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, wie oben beschrieben. Die Zahl der kernhaltigen Zellen pro Fläche (beide 231-Zellen und CAF) jedes Surrogat wurde gemessen. Wie in Figur 12 repräsentativ Photomikrographien der H &amp; E-gefärbten Schnitten zeigen eine höhere Konzentration...

Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung von 3D-Brustkrebs-Surrogaten, die mit einem Perfusionsbioreaktorsystem kultiviert werden können, um Sauerstoff und Nährstoffe zu liefern. Nach dem Wachstum werden Surrogate fixiert und zu Paraffin verarbeitet, um die interessierenden Parameter zu bewerten. Die Auswertung eines solchen Parameters, der Zelldichte, wird erläutert.

Herstellung und Analyse von<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahrensreihe besteht darin, dreidimensionale Zellkulturen zu erzeugen, die als in-vitro-Ersatzmodelle für Brustkrebs dienen, und eine Methode zur Messung des Zellwachstums in histologischen Schnitten dieser Ersatzmodelle vorzustellen. Die dreidimensionale Zellkultur ist eine physiologisch relevantere Methode zur Modellierung des Zellverhaltens in vitro im Vergleich zur zweidimensionalen Zellkultur. Durch die gezielte Veränderung der zellulären Zusammensetzung unter experimentellen Bedingungen kann diese Verfahrensreihe an eine Vielzahl biologischer Fragestellungen angepasst werden und ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Wirkstoffe.Um die Zellen in die ECM einzubetten, geben Sie die Zellen und die ersten vier in Tabelle 1 der begleitenden Veröffentlichung aufgeführten Komponenten auf Eis in ein 2-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Komponenten anschließend vorsichtig durch Pipettieren und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Überwachen Sie den pH-Wert mithilfe des Phenolrots im 10XD MEM, um sicherzustellen, dass die Mischung eine orangerote Farbe aufweist, was einem pH-Wert von sieben entspricht.Wenn die Mischung gelb erscheint und der pH-Wert zu niedrig ist, geben Sie langsam 7,5 %iges Natriumbikarbonat tropfenweise hinzu, bis die gewünschte Farbe erreicht ist. Denken Sie daran, die Mischung auf Eis zu halten und schnell zu arbeiten, um eine vorzeitige ECM-Polymerisation zu verhindern. Bei festen 3D-Kulturen halten Sie die Kammerobjektträger auf Eis, um eine vorzeitige ECM-Polymerisation zu verhindern.Pipettieren Sie langsam 100 Mikroliter der Zell-ECM-Mischung in jede Vertiefung der acht-Vertiefungs-Kammerplatte und geben Sie die Zell-ECM-Mischung auch entlang der Ränder der Vertiefung hinzu, um eine gleichmäßigere Verteilung zu gewährleisten. Anschließend inkubieren Sie die Modelle bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent CO2 für 45 Minuten, um die ECM-Polymerisation zu ermöglichen. Nach 45 Minuten fügen Sie 100 Mikroliter des Kulturmediums zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren weiterhin bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent CO2 für die gesamte Dauer des Experiments. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle zwei Tage. Eine Einschränkung der 3D-Kultur besteht darin, dass die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in das Volumen möglicherweise unzureichend ist, um die Zellviabilität zu gewährleisten. Der Einsatz eines Bioreaktorsystems kann helfen, diese Einschränkung zu überwinden und das Wachstum zu verbessern.Um 3D-Kulturen in einem Bioreaktorsystem zu perfundieren, bereiten Sie den Teil des Bioreaktorsystems, der die Surrogate enthält, steril vor und montieren Sie ihn. In einer Zellkulturhaube injizieren Sie mit einer Spritze und einer 26-Gauge-Nadel die Zell-ECM-Mischung in den Bereich des Perfusionsbioreaktors, der für die Zellen vorgesehen ist, und fahren Sie anschließend umgehend mit dem nächsten Schritt fort. Um eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen innerhalb der Surrogate sicherzustellen, stellen Sie die Bioreaktorkomponente, die die Surrogate enthält, in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.Drehen Sie die Surrogate kontinuierlich mit 18 U/min, während sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem In-situ-Hybridisierungs-Ofen oder einem Inkubator zur ECM-Polymerisation inkubiert werden. Nach der Polymerisation und Zugabe des Mediums verbinden Sie die Bio-Reaktor-Anordnung mit der Pumpe. Beginnen Sie die Medium-Perfusion in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2.Führen Sie die Medium-Perfusion während des gesamten Experiments fort und wechseln Sie das Kulturmedium nach Bedarf entsprechend dem spezifischen experimentellen Design. Am Ende des Experiments geben Sie die Surrogate in Verarbeitungsgel für Proben ein, um die Integrität der Surrogate während der Verarbeitung zu erhalten und die histologische Schnittführung zu erleichtern. Um dies durchzuführen, schmelzen Sie das Verarbeitungsgel für Proben in einem Wasserbad mit 60 Grad Celsius, bis es gebrauchsfertig ist.Dann pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter Spezimenaufarbeitungsgel in den Boden einer beschrifteten Kryoschale. Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge und einer Pinzette vorsichtig einen Surrogat aus dem Bioreaktor oder aus der Vertiefung einer Acht-Loch-Kammerobjektträgers und geben Sie ihn in die Kryoschalen, die das Spezimenaufarbeitungsgel enthalten. Pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter Spezimenaufarbeitungsgel, um den Surrogat in der Kryoschale zu bedecken.Anschließend 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Sobald das Probenaufbereitungsgel erstarrt ist, das die Surrogat enthaltende Probenaufbereitungsgel aus der Kryoschablone entfernen und in eine Gewebekassette geben. Wenn mehr als eine Surrogat in dieselbe Gewebekassette gegeben werden soll, können Gewebemarkierungsfarbstoffe verwendet werden, um die Proben nach Fixierung und Aufarbeitung zu unterscheiden.Platzieren Sie anschließend die Gewebekassette mit dem Surrogat für zehn bis zwölf Stunden bei Raumtemperatur in einer 10 %igen neutralen gepufferten Formalinlösung, um eine vollständige Fixierung zu gewährleisten. Nach der Fixierung überführen Sie die Gewebekassette mit dem Surrogat in 70 %igen Ethanol. Das fixierte Surrogat ist nun bereit für die Verarbeitung in Paraffin und die anschließende histologische Schnittführung.Um die Zelldichte und die foto-mikroskopischen Bilder von H- und E-gefärbten Schnitten zu messen, öffnen Sie eine Bilddatei des Surrogats. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug in ImageJ und die Ränder der ECM als Orientierungshilfe, um den Bereich des Surrogats durch Ziehen der Maus und Klicken zum Setzen von Ankerpunkten abzugrenzen. Sobald der Bereich umrissen ist, wählen Sie unter dem Reiter Analysieren die Option Messen aus.Als Nächstes laden Sie die Bilddateien, die zur Messung der Surrogatfläche verwendet wurden, in Cell Profiler hoch, indem Sie die Bilddateien in die Dateiliste ziehen. Weisen Sie dann jedem importierten Bild im Modul „Namen und Typen importieren“ einen Namen zu und wählen Sie den Bildtyp aus. Sobald die Analyse-Pipeline erstellt wurde, starten Sie den Testmodus und klicken Sie in Cell Profiler auf „Ausführen“.Und bewerten Sie die gefilterten Objekte, um sicherzustellen, dass der Großteil der Kerne im Testbild korrekt identifiziert wird und die optimalen Parameter zur Zellidentifizierung gewählt sind. Die eingeschlossenen Kerne werden grün umkreist. Speichern Sie anschließend das Projekt, verlassen Sie den Testmodus und klicken Sie auf „Bilder analysieren“.Hier ist ein repräsentatives Bild eines H- und E-gefärbten Schnitts von einem sieben Tage lang kultivierten perfundierten Surrogat zu sehen. Und dies ist ein repräsentatives Bild eines H- und E-gefärbten Schnitts von einem sieben Tage lang mit Mediumwechsel alle zwei Tage kultivierten festen Surrogat. Die Zellzahl ist bei den festen Surrogaten deutlich geringer.Dieses Diagramm zeigt den Vergleich der mittleren Anzahl kernhaltiger Zellen pro Fläche nach sieben Tagen Wachstum. Eine perfundierte und eine feste Ersatzstruktur. Diese numerischen Daten unterstützen die Zellularity in den Fotomikrografien der mit H und E gefärbten Schnitten.Und dieses Diagramm zeigt den Vergleich des Ki-67-Labelling-Index, der ein Maß für die Zellproliferation nach sieben Tagen Wachstum von perfundierten und soliden Surrogaten darstellt. Diese Daten unterstützen erneut ein stärkeres Wachstum in perfundierten Surrogaten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die in-situ-Hybridisierung und die Amino-Histochemie an histologischen Schnitten der Surrogate durchgeführt werden, um Fragen zur RNA- und Proteinexpression zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale in-vitro-Gewebemodelle herstellt und aufbereitet sowie die Analyse dieser Modelle an H-und-E-gefärbten histologischen Schnitten durchführt.

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Forschung

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Biotechnik

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Herstellung und Analyse von

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