Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Ziel dieses experimentellen Systems ist es, den Beitrag spezifischer Proteine zum invasiven Prozess zu charakterisieren. Beginnen Sie mit der retroviralen Transduktion von Zellen mit dem fluoreszierenden Protein von Interesse. Erstellen Sie auch die 3D-Matrix des Matrigel-Proteins in Transwell-Inserts und bereiten Sie eine Zellsuspension in der entsprechenden Verdünnung vor.

Messen Sie mit dem Matrigel-Transwell-System die Transmigrationsreaktion auf den Chemolockstoff mit Testmedikamenten oder -behandlungen, fahren Sie mit der Visualisierung und Analyse der Zellinvasion durch konfokale Mikroskopie fort. Letztendlich können die Ergebnisse das Ausmaß und die Art der Zellinvasion in die dreidimensionale Proteinmatrix bestimmen. Die Stärke dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem traditionellen Transwell-Invasionsassay liegt in ihrer Fähigkeit, sowohl quantitative als auch qualitative Daten über die Zellinvasion in eine dreidimensionale Proteinmatrix zu übertragen.

Meine Mitarbeiterin, Diane Creighton, wird nun die Methode zur Kultur retroviraler Verpackungszellen in DMEM mit 10 % FBS für 48 Stunden demonstrieren. Transfizieren Sie die Zellen mit retroviraler DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. 24 Stunden inkubieren, die Vertiefungen zweimal mit Medium spülen, dann 1,5 Milliliter 10 % F-P-S-D-M-E-M pro Vertiefung hinzufügen und 48 Stunden lang inkubieren, um die Packung Retrovirus zu sammeln.

Übertragen Sie das Gewebekulturmedium in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie, um alle Zellen auszupelletieren, und ernten Sie das Supinat in ein sauberes Röhrchen. Lagern Sie diesen Retrovirus-Bestand bei minus 80 Grad Celsius. Um nun retro-transduzierte Zellen zu erhalten, entfernen Sie das Medium aus einer Übernachtkultur und fügen Sie einen Milliliter Retrovirus-Stamm hinzu, der mit Polygrün ergänzt ist.

Nach einer sechsstündigen Inkubation geben Sie zwei Milliliter 10%F-B-S-D-M-E-M in die Vertiefung und legen Sie die Platten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Füllen Sie das Medium über Nacht auf und fügen Sie nach 24 Stunden geeignete selektive Medien hinzu, wenn die Zellen konfluent geerntet werden, und sortieren Sie auf Fluoreszenz mit nicht transduzierten Zellen als Referenz. Sammeln Sie Zellen mit einer Fluoreszenz, die größer ist als bei nicht transduzierten Zellen, und frieren Sie Aliquots bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung ein.

Diese Methode stützt sich auf die Expression fluoreszierender Proteine zur Visualisierung und ermöglicht es, Einblicke in die Beiträge einzelner Zellen zu bestimmen. Thor Complete Matri Gel auf Eis und dann eins zu eins in eiskaltem PBS verdünnen. Setzen Sie nun die unbeschichteten Transwells in eine 24-Well-Gewebekulturplatte ein.

Pipettieren Sie dann vorsichtig 100 Mikroliter verdünntes Matri-Gel in die Vertiefungen und erstarren Sie bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die fluoreszenzmarkierten Zellsuspensionen in ihrem normalen Wachstumsmedium vor. Wenn das Matri-Gel erstarrt ist, drehen Sie die Transwells um und pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension auf den Ausgang an der Unterseite des Filters.

Decken Sie die Transwells vorsichtig mit dem Boden einer 24-Well-Gewebekulturplatte ab und berühren Sie jedes Tröpfchen der Zellsuspension. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang im umgekehrten Zustand, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Drehen Sie nun die Platten mit der richtigen Seite nach oben und waschen Sie jeden Transwell, indem Sie zweimal in einen Milliliter serumfreies Medium tauchen.

Positionieren Sie dann den Transwell in einer dritten Vertiefung, die alle Medikamente oder Behandlungsreagenzien enthält. Die Wirkstoffe pipettieren vorsichtig 100 Mikroliter Medien, die einen Chemo-Lockstoff enthalten, in den Transwell auf der verfestigten Matrigel-PBS-Mischung. Inkubieren Sie drei bis fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um nicht fluoreszierende Zellen abzubilden, die in Matrigel eindringen.

Legen Sie die Transwells in frische 24-Well-Schalen und pipettieren Sie. Ein Milliliter vier mikromolare Calcium AM-Lösung auf jedem Matri-Gel-Pfropfen, so dass er über die Seiten fließen und von oben und unten abfärben kann. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Atmosphäre. Dann Aufnahme durch konfokale Mikroskopie.

Diese erste Lifestyle-Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von Invasionsmodi. Jedes Transwell wird in ein frisches 24-Well-Platten-Overlay, ein Milliliter 4 % Paraformaldehyd 0,2 % Triton X 100, überführt und eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit einem Milliliter fügen PBS 30 Minuten lang RNAs A hinzu und waschen dann zweimal mit PBS zur Visualisierung bei 0,01 Milligramm pro Milliliter.

Propidiumiodid in PBS verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen lassen. Dreimal mit PBS waschen. In diesem Stadium kann der Propidiumiodid-Fleck transwells mindestens einen Monat lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt werden.

Die zweite Zellfärbemethode erfordert eine Fixierung, ermöglicht aber eine schnellere Quantifizierung der Invasion: Unter Verwendung eines inversen konfokalen Mikroskops, das mit einer kleinen Menge an restlichem PBS auf ein großes Deckglas über einem 20-fachen Objektiv ohne Eintauchen platziert wird, und erfassen Sie optische Schnitte alle 10 bis 15 Mikrometer von der Unterseite des Matrigel-Plugs. Quantifizieren Sie das Ausmaß der Invasion anhand einzelner optischer Schnitte. Konstruieren Sie auch dreidimensionale Objekte unter Verwendung geeigneter Software, wie z.B. Geschwindigkeit in dieser Reihe von optischen Schnitten, Zellen wurden mit Calcium am gefärbt

Erwartungsgemäß nimmt die Anzahl der Zellen, die aus dem Filter nach oben eindringen, mit zunehmender Entfernung ab. Diese Invasion kann quantifiziert werden. Dreidimensionale Rekonstruktionen der Zellinvasion bieten eine visuelle Darstellung der Art der Invasion.

Werden Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert, so können die Positionen jeder Farbzelle in dreidimensionalen Rekonstruktionen visualisiert werden, wie in dieser Seitenansicht gezeigt. Darüber hinaus können Schnitte durch die Rekonstruktion Einblicke in molekulare Mechanismen bieten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen Zellinvasions-Assay verwenden können, um mehr Informationen über den Ausweichprozess zu erhalten, als mit den Standardmethoden erhalten werden können.