Name: Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Matrix-Invasion von Tumorzellen mit Matrigel-Transwell-System und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode liefert quantitative und qualitative Daten zur Zellinvasion für die Krebsforschung.

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Die Finanzierung dieser Forschung ist von Cancer Research UK.

1. Retrovirale Markierung von Zellen mit fluoreszierenden Proteinen <ol><li> Platte retroviralen Verpackung Zellen (zB Phoenix) bei 0,25 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 6-well Gericht in 10% fötalem Rinderserum (FBS) / DMEM. </li><li> Transfektion von Zellen mit retroviralen DNA 48 Stunden später Zellen mit Effectene nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Spülen Sie die Taschen zweimal mit Medium 24 Stunden später, dann fügen Sie 1,5 ml 10% FBS / DMEM pro Loch. </li><li> Sammeln verpackt Virus in Zellkulturmedium 48 Stunden später durch Pipettieren und die Übertragung auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation bei 1600 rpm für 5 min auf Pellet alle Zellen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen und lagern bei -80 ° C. </li><li> Cells um retroviral transduziert werden werden mit 1,5 x 10 5 Zellen pro Loch einer 6-Well Schale überzogen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die Medien aus den Zellen und add 1 ml Virus-Aktie mit 4 ul Polybren (2 mg / ml) in jede Vertiefung ergänzt. Ersetzen Platten im Brutschrank. </li><li> Nach Inkubation für 5-6 Stunden, 2 ml 10% FBS / DMEM in jede Vertiefung und Platten sind in 37 ° C ersetzt inbubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie die Medien und damit Zellen 24 Stunden vor dem Zusatz von geeigneten selektiven Medien. </li><li> Wenn konfluent (das hängt von der Wachstumsrate der Zellen, und die Effizienz der retroviralen Transduktion, sondern nimmt in der Regel 4 bis 14 Tage), trypsinize Zellen und sort für die Fluoreszenz unter Verwendung von nicht-transduzierten Zellen als Referenz, zu sammeln und Pool-Zellen mit Fluoreszenz größer als nicht-transduzierten Zellen und frieren Aliquots bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol> 2. Inverse Matrigel Invasion Assays <ol><li> Langsam tauen ein Aliquot von kompletten Matrigel (dh mit Wachstumsfaktoren) auf Eis (Abbildung 1A). </li><li> Nach dem Auftauen, verdünnter Matrigel 1:1 in eiskaltem PBS (zusammen mit allen anderen zusätzlichenBehandlungen mit 2x-Konzentration in der PBS vor der Verdünnung; Abbildung 1B). Um es einfacher zu Matrigel vor der Polymerisation Griff, alle Kunststoffprodukte (zB Tipps, Rohre, etc.) sollte eiskalt sein. </li><li> Legen Sie so viele 8 Mikron Porengröße 6,5 mm Durchmesser unbeschichteten Transwells als in den Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatten erforderlich, dann vorsichtig Pipette 100 ul der verdünnten Matrigel in die Vertiefungen und Urlaub für ~ 30 min bei 37 ° C inkubieren sich zu verfestigen (Abbildung 1C). </li><li> Während dieser Zeit bereiten eine oder mehrere fluoreszenzmarkierten Zellsuspensionen auf zwischen 1 bis 4 x 10 5 Zellen pro ml, je nach Zelllinie, aus jedem vorbehandelten Zustand (e. g. SiRNA, medikamentöse Behandlung) in ihr normales Wachstum Medium (Abbildung 1D). </li><li> Wenn die Matrigel erstarrt ist, kehren die Transwells und Pipette 100 ul der Zellsuspension auf der nach oben weisenden Unterseite des Filters (Abbildung 1E). </li><li> Sorgfältig decken die Transwells mit der Basis eines 24-Well-GewebeKultur Teller, den Kontakt mit jedem Tropfen der Zellsuspension (Abbildung 1F). </li><li> Die Platte in den invertierten Zustand für 4 Stunden für Zelladhäsion (Abbildung 1G) zu ermöglichen. </li><li> Nach dieser Zeit werden die Platten right-side-up und waschen jedes Transwell durch sequentielle Eintauchen in 2 x 1 ml serumfreiem Medium (Abbildung 2A). </li><li> Verlassen Sie die Transwells in einem dritten auch mit Drogen oder Behandlungen erforderlich (Abbildung 2B). </li><li> Gently Pipette 100 ul 10% FBS / DMEM plus Lockstoff (e. g. EGF bei 25 ng / ml) in die Transwell auf der Oberseite des erstarrten Matrigel / PBS-Mischung, ersetzen Sie den Deckel ab und inkubieren für 3-5 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 (Abbildung 2C). </li></ol> 3. Färbung und Visualisierung <ol><li> Zellen, die fluoreszierende Proteine ​​können die folgenden Schritte vor der konfokalen Mikroskopie überspringen </li><li> Um das Bild nicht fluoreszierenden Zellen eindringen Matrigel, Ort Transwells in frischen 24-Well-Gerichte und Pipette 1 ml 4 uMCalcein AM Färbelösung übereinander Matrigel-Stecker, so dass sie übergreifen den Seiten und Flecken von oben und unten. Calcein AM (Acetoxymethylester von Calcein) ist ein Live-Cell-Farbstoff, färbt die ganze Zellen grün und erfordert keine Fixierung. </li><li> Inkubieren 1 Stunde bei 37 ° C in 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre, an welcher Stelle Zellen sind voll gefärbt und bereit, durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden. </li><li> Alternativ können nicht-fluoreszierenden Zellen eindringen Matrigel fixiert und gefärbt werden, wie unten in 3,5 bis 3,9 beschrieben. </li><li> Übertragen Sie jede Transwell einen frischen 24-Well-Platte. Overlay 1 ml 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden. </li><li> Entfernen Fixiermittel und 3 x waschen mit 1 ml PBS. </li><li> Entfernen zytoplasmatische RNA mit 30 min RNase-Behandlung mit 100 pg / ml RNase. Wash 2 mal mit PBS. </li><li> Für die Visualisierung hinzu 0,01 mg / ml Propidiumiodid (PI) in PBS verdünnt und lassen bei Raumtemperatur in den dark für 0,5 Stunden. 3 x waschen mit PBS. In diesem Stadium, gebeizt PI Transwell bei Raumtemperatur im Dunkeln für mindestens 1 Monat aufbewahrt werden. </li><li> Präzise bildgebenden Verfahren durch konfokale Mikroskopie sind abhängig von verfügbaren Ressourcen. Mit Hilfe eines invertierten konfokalen Mikroskop, Ort Transwell mit einer kleinen Menge an Rest-PBS auf große Deckglas (sicherstellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind) über nicht-Immersions-20 X objektiv und erfassen optische Schnitte alle 10-15 um von der Unterseite der Matrigel-Plug. Individuelle optische Schnitte können verwendet werden, um das Ausmaß der Invasion (Abbildung 3A) zu quantifizieren oder in 3-dimensionale Objekte mittels geeigneter Software wie Volocity (Abbildung 3B) zu bauen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Z-Serie von optischen Schnitten ist in Abbildung 3A gezeigt. In diesem Fall wurden die Zellen mit Calcein AM angefärbt und die Anzahl der Zellen eindringen aus dem Filter zu sehen, mit Abstand zu verringern. Die Quantifizierung der invasion kann durch die Analyse des Verhältnisses von Calcein AM positive Pixel, negative Punkte bei jedem Intervall, oder über die Fixierung / Färbemethode oben beschriebene Zählen PI positiven Kerne an jeder Position möglich. Ein Vorteil von Calcein AM Färbung ist, dass 3-dimensionale Rekonstruktion der Zellinvasion zusammengebaut mit einer Software wie Volocity, was eine visuelle Darstellung der Modus der Invasion (Abbildung 3B) werden. Wenn Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert sind, dann die Positionen der einzelnen Farben Zelle kann in 3-dimensionale Rekonstruktion visualisiert, entweder von der Seite (Abbildung 3C) oder durch Schnitte durch die Rekonstruktion (Abbildung 3D) angesehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritte beim Aufbau einer inversen Invasion Assay beteiligt. A) Matrigel ECM auf Eis aufgetaut. B) Matrigel ist 1:1 mit PBS, das jede medikamentöse Behandlung mit der doppelten Endkonzentration verdünnt. C) Transwell-Einsätze sind in Mikrotiterplatten gegeben und Matrigel in jede pipettiert. D) Zellsuspensionen hergestellt in der gewünschten Konzentration. E) Nach dem Matrigel gesetzt hat, die Platte umgedreht ist und entfernt werden, werden die Zellen auf die Unterseite Filter der Transwell-Einsätze vernickelt. F) In der invertierten Position ist das mehrlagig Platte vorsichtig über Transwell-Einsätze platziert, in Kontakt mit der Zellsuspension. G) Zellen werden dürfen, um den Filter für 4 Stunden einzuhalten. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Fortführung der Schaltplan für die inverse Invasion Assay. A) Wenn Zellen eingehalten haben, tauchen jede Transwell in serum-freien Medien zweimal zu verlieren Zellen zu entfernen. B) Ort gewaschen Transwell in eine endgültige und mit Medien sowie Behandlungen nach Bedarf. C) Medien mit Lockstoff (zB 10% fötalem Rinderserum) mit Behandlungen nach Bedarf wird vorsichtig auf Matrigel geschichtet. ENT "&gt; <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repräsentative Bilder der Ergebnisse der inversen Invasion Assay. A) Optische Schnitte von Zellen mit Calcein gefärbten AM eindringenden Matrigel, aufgenommen bei 15 mu m Abständen durch konfokale Mikroskopie. B) Rekonstruktion eines 3-dimensionalen Rekonstruktion der Zelle Invasion aus einem Stapel von konfokalen Z-Serie Bilder von der Seite angesehen. Wiedergabe aus Lit. 10. C) Dreidimensionale Rekonstruktion des GFP und RFP-markierter Zellen eindringen Matrigel von der Seite betrachtet. D) Optischer Schnitt durch die 3-dimensionale Rekonstruktion der GFP und RFP-markierter Zellen. Wiedergabe aus Lit. 10.

<ol><li>Olson, M. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in cancer cell motility.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).</li>
<li>Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+factors+that+sustain+glioma+invasion+and+paracrine+biology+in+the+brain+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hallmarks+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hallmarks of Cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Croft, D. R., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+conversion+between+rounded+and+elongated+modes+of+cancer+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement.</a> Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).</li>
<li>Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).</li>
<li>Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos-transformation+activates+genes+associated+with+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Fos-transformation activates genes associated with invasion.</a> Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).</li>
<li>Scott, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Matrigel Invasion Assays wurden traditionell mit Zellen auf eine Schicht aus extrazellulären Matrix-Proteins mit Lockstoff-induzierten Motilität in Richtung und durch einen Filter am unteren Rand platziert gesetzt. Invasivität wurde als Funktion der, wie viele Zellen könnte auf der Unterseite des Filters gezählt werden gewertet. Obwohl praktisch gibt es kaum einen Unterschied mit dem &quot;inverse&quot; Invasion Assay beschrieben, gibt es wesentlich mehr Informationen über den Prozess der Invasion, die durch die Visuali...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) </td><td> GIBCO </td><td> 21969 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> GIBCO </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> 200 mM L-Glutamin (100x) </td><td> GIBCO </td><td> 25050-032 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> AL-118 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> 6.5mm Transwells, 8,0 um Porengröße </td><td> Corning </td><td> 3422 </td></tr><tr><td> Komplette Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Calcein AM </td><td> Invitrogen </td><td> C1430 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 19101 </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> Konfokale microcope </td><td> Leica </td><td> SP2MP </td></tr></tbody></table>

modeling and imaging 3-dimensional collective zellinvasion

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Ein charakteristisches Merkmal von Krebs Malignität Invasion und Metastasierung 1. In einigen Krebsarten (e. g. Gliom 2), lokale Invasion in das umgebende gesunde Gewebe ist die Ursache von Krankheit und Tod. Für andere Krebsarten (e. g. Brust, Lunge, etc.), Wird der Prozess der Metastasierung ist, in die Tumorzellen von einem Primärtumor Masse zu bewegen, zu kolonisieren distalen Seiten und letztendlich zum Organversagen beitragen, dass führt schließlich zu Morbidität und Sterblichkeit 3. Es wurde geschätzt, dass der Invasion und Metastasierung verantwortlich für 90% der Krebstodesfälle 4 sind. Als Ergebnis gab es reges Interesse bei der Identifizierung der molekularen Prozesse und kritische Protein Mediatoren der Invasion und Metastasierung für die Zwecke der Verbesserung von Diagnose und Behandlung 5 gewesen. Eine Herausforderung für Krebsforscher ist Invasionsassays hinreichend ähneln den in-vivo-Situation zu entwickelngenaue Krankheit Modellierung 6 zu ermöglichen. Zweidimensionale Zellmotilität Assays sind nur informativ über einen Aspekt der Invasion und berücksichtigen nicht die extrazelluläre Matrix (ECM)-Protein Umbau, die auch ein kritisches Element zu nehmen. In jüngster Zeit hat die Forschung unser Verständnis von Tumorzellinvasion verfeinert und gezeigt, dass einzelne Zellen kann durch längliche oder runde Modi 7 zu bewegen. Darüber hinaus hat es eine größere Wertschätzung des Beitrags der kollektiven Invasion in die Zellen eindringen in Stränge, Platten und Clustern, insbesondere in hoch differenzierten Tumoren, die epithelialen Eigenschaften beizubehalten, um die Ausbreitung von Krebs 8 wurden. Wir präsentieren eine raffinierte Methode 9 für die Prüfung der Beiträge der Kandidaten-Proteine, um kollektive Invasion 10. Insbesondere durch technische separate Pools von Zellen auf verschiedene fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, ist es möglich, molekular sezieren die Aktivitäten und Proteins in führenden Zellen im Vergleich zu denen in folgenden Zellen erforderlich erforderlich. Die Verwendung von RNAi stellt die molekulare Werkzeug, um experimentell zu zerlegen die Prozesse in einzelne Zelle Invasion sowie in verschiedenen Positionen der kollektiven Invasion beteiligt. In diesem Verfahren, Mischungen von fluoreszenzmarkierten Zellen auf dem Boden eines Transwell einfügen zuvor mit Matrigel ECM-Protein gefüllt sind vernickelt, dann erlaubt, &quot;nach oben&quot; durch den Filter und in den Matrigel Invasion. Rekonstruktion der z-Serie Bildstapeln durch konfokale Bildgebung erhalten, in dreidimensionale Darstellungen ermöglicht Visualisierung von kollektiv eindringenden Stränge und Analyse der Darstellung von fluoreszenzmarkierten Zellen in führenden gegenüber folgenden Positionen.

Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser widerspiegeln<em&gt; In vivo</em&gt; Situation als zweidimensionale Beweglichkeit Assays. Mit Matrix-Invasion Assays mit konfokale Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zellen, detaillierte Informationen über die Invasion Modi und die einzelnen Beiträge zu den führenden im Vergleich zu folgenden Zellen kombiniert erreicht werden kann.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Ein definierendes Merkmal der Malignität von Krebs ist die Invasion und Metastasierung 1. Bei einigen Krebsarten (z. B. Gliomen 2) erfolgt die lokale Invasion in das umgebende gesunde ...

Dieses experimentelle System zielt darauf ab, den Beitrag spezifischer Proteine an dem invasiven Prozess zu charakterisieren. Beginnen Sie mit der retroviralen Transduktion von Zellen mit dem fluoreszierenden Protein der Untersuchung. Erstellen Sie außerdem die dreidimensionale Matrix aus Matrigel-Protein in Transwell-Einsätzen und bereiten Sie eine Zellsuspension in der geeigneten Verdünnung vor.Mithilfe des Matrigel-Transwell-Systems wird die Transmigrationsreaktion auf das Chemoattractans unter Zugabe von Testsubstanzen oder Behandlungen gemessen, um anschließend die Zellinvasion mittels konfokaler Mikroskopie zu visualisieren und zu analysieren. Letztendlich können so Ausmaß und Art der Zellinvasion in eine dreidimensionale Proteinmatrix bestimmt werden. Die Stärke dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie dem klassischen Transwell-Invasionsassay liegt in ihrer Fähigkeit, sowohl quantitative als auch qualitative Daten zur Zellinvasion in eine dreidimensionale Proteinmatrix bereitzustellen.Meine Kollegin, Diane Creighton, wird nun die Methode demonstrieren: Kultivieren Sie retrovirale Verpackungszellen in DMEM mit 10 % FBS für 48 Stunden. Transfizieren Sie die Zellen mit retroviraler DNA gemäß den Herstelleranweisungen. Inkubieren Sie 24 Stunden lang, spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit Medium aus und geben Sie anschließend 1,5 Milliliter 10 % FBS-DMEM pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie weitere 48 Stunden, um das verpackte Retrovirus zu sammeln.Überführen Sie das Zellkulturmedium in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie, um eventuelle Zellen zu pelletieren, und gewinnen Sie das Überstand in ein sauberes Röhrchen. Lagern Sie diesen Retrovirus-Stammsatz bei minus 80 Grad Celsius. Entfernen Sie nun das Medium aus einer Übernachtkultur von retrotransduzierten Zellen und geben Sie ein Milliliter Retrovirus-Stammsatz, ergänzt mit Polygreen, hinzu.Nach einer sechsstündigen Inkubation zwei Milliliter 10 % FBS-DMEM in die Vertiefung geben und die Platten in einen 37 °C warmen Inkubator stellen. Über Nacht das Medium erneuern und nach 24 Stunden, sobald Konfluenz erreicht ist, das geeignete selektive Medium zugeben, die Zellen ernten und bezüglich der Fluoreszenz unter Verwendung nicht transduzierter Zellen als Referenz sortieren. Zellen mit einer höheren Fluoreszenz als die nicht transduzierten Zellen sammeln und Aliquots bei −80 °C für die spätere Verwendung einfrieren.Diese Methode beruht auf der Expression fluoreszierender Proteine zur Visualisierung und ermöglicht Einblicke in die Beiträge einzelner Zellen. Dann das komplette Matrigel auf Eis auftauen und im Anschluss im Verhältnis 1:1 mit eiskaltem PBS verdünnen. Danach die unbehandelten Transwells in eine 24-Loch-Gewebekulturplatte einsetzen.Danach vorsichtig 100 Mikroliter verdünntes Matri-Gel in die Vertiefungen pipettieren und bei 37 Grad Celsius verfestigen lassen. In der Zwischenzeit die fluoreszenzmarkierten Zellsuspensionen in ihrem normalen Wachstumsmedium vorbereiten. Sobald das Matri-Gel erstarrt ist, die Transwell-Kammern umdrehen und 100 Mikroliter der Zellsuspension auf die dem Ausgang zugewandte Unterseite des Filters pipettieren.Decken Sie die Transwell vorsichtig mit der Unterseite einer 24-Loch-Gewebekulturplatte ab, wobei jeder Tropfen der Zellsuspension berührt wird. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang im umgekehrten Zustand, um die Zellanheftung zu ermöglichen. Drehen Sie die Platten nun wieder in die normale Position und waschen Sie jedes Transwell, indem Sie es zweimal in je ein Milliliter serumfreies Medium eintauchen.Danach den Transwell in eine dritte Vertiefung bringen, die Arzneimittel oder Behandlungsreagenzien enth&auml;lt. Vorsichtig 100 Mikroliter Medium mit Chemoattraktans &uuml;ber der erstarrten Matrigel-PBS-Mischung in den Transwell pipettieren. F&uuml;r drei bis f&uuml;nf Tage bei 37 Grad Celsius mit 5&nbsp;% Kohlendioxid inkubieren, um nichtfluoreszierende Zellen zu bildm&auml;&szlig;ig erfassen, w&auml;hrend sie in Matrigel eindringen.Transwells in frische 24-Loch-Platten geben und pipettieren. Ein Milliliter vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung auf jeden Matri-Gel-Plug geben, sodass sie über die Seiten läuft und den Plug von oben und unten anfärbt. Eine Stunde bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Anschließend mittels konfokaler Mikroskopie abbilden.Diese erste lebende Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von Invasionstypen. Überführen Sie jeden Transwell in eine neue 24-Loch-Platte, geben Sie einen Milliliter 4 % Paraformaldehyd mit 0,2 % Triton X-100 hinzu und inkubieren Sie eine halbe Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen mit jeweils einem Milliliter PBS fügen Sie RNase A für 30 Minuten hinzu, waschen anschließend zweimal mit PBS und führen die Visualisierung mit 0,01 Milligramm pro Milliliter durch.Propidiumiodid in PBS verdünnen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln belassen. Dreimal mit PBS waschen. Zu diesem Zeitpunkt können die mit Propidiumiodid gefärbten Transwell-Kammern mindestens einen Monat lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt werden.Die zweite Zellfärbemethode erfordert eine Fixierung, ermöglicht jedoch eine schnellere Quantifizierung der Invasion. Platziere mit einem invertierten konfokalen Mikroskop den Transwell mit einer geringen Menge restlichem PBS auf eine große Deckglasplatte über ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung ohne Immersionsflüssigkeit und erfasse optische Schnitte in Abständen von jeweils 10 bis 15 Mikrometern, ausgehend vom Boden des Matrigel-Plugs. Quantifiziere das Ausmaß der Invasion anhand einzelner optischer Schnittbilder. Erstelle außerdem dreidimensionale Objekte mithilfe geeigneter Software wie Velocity aus dieser Serie optischer Schnitte, wobei die Zellen mit Calciumam gefärbt wurden.Wie erwartet nimmt die Anzahl der Zellen, die durch den Filter eindringen, mit zunehmender Distanz ab. Dieses Eindringen kann quantifiziert werden. Dreidimensionale Rekonstruktionen des Zelleindringens bieten eine visuelle Darstellung der Eindringungsart.Wenn Zellen durch die Expression fluoreszierender Proteine markiert sind, können die Positionen der Zellen jeder Farbe in dreidimensionalen Rekonstruktionen wie in dieser Seitenansicht dargestellt werden. Zusätzlich können Schnitte durch die Rekonstruktion Einblicke in molekulare Mechanismen bieten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieser Zellinvasionsassay genutzt werden kann, um mehr Informationen über den Ausweichprozess zu erhalten, als mit den Standardmethoden möglich ist.

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Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Quelle: Guyon, J., et al. Ein 3D-Sphäroidmodell für Glioblastome. J. Vis. exp. (2020)Das Video zeigt die Erstellung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion. Sphäroide werden aus menschlichen Hirntumorzellen gebildet und in eine Kollagenmatrix eingebettet. Die Tumorzellen an der Peripherie der Sphäroiden nehmen einen invasiven Phänotyp an, sezernieren Proteasen, um das Kollagen abzubauen, und dringen vor, um in die umgebende Matrix einzudringen.

Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Fluoreszenz beschriften Kollagen, das weiter für beide fix und Live-Darstellung von 3D-Zellkulturen verwendet werden kann. Wir bieten auch ein optimiertes Protokoll endogene Proteine ​​des Zytoskeletts von Zellen in 3D-Umgebungen kultiviert visualisieren.

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

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Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

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Die Mikroumgebung von Tumoren ist ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und-einmarsches. Um die Fortschreibung des Karzinoms zu imitieren, wird eine biologisch relevante menschliche Matrix benötigt. Dieses Protokoll führt eine Verbesserung für den in vitro dreidimensionalen spheroizider Invasionsuntergang ein, indem es eine menschliche, auf Gelotem basierende Matrix verwendet. Das Protokoll führt auch eine computergestützte Zellinvasion ein.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Hier wird ein Protokoll für die Herstellung eines sphäroiden Bildgebungsgeräts vorgestellt. Dieses Gerät ermöglicht eine dynamische oder Längsfluoreszenzbildgebung von Krebszellsphäroiden. Das Protokoll bietet auch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse der Krebszellinvasion.

Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Erfahren Sie die 3D-Matrix-Invasion von Tumorzellen mit Matrigel-Transwell-System und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode liefert quantitative und qualitative Daten zur Zellinvasion für die Krebsforschung.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

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