Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Injektion von sterbenden Zellen oder DNA in embryonale Mausherzen. Um Zellfett zu untersuchen oder die Genexpression lokal zu manipulieren, wird dies erreicht, indem zunächst die Embryonen einer trächtigen Maus präpariert und das embryonale Herz freigelegt werden. Als nächstes werden DNA-Farbstoffe oder -Zellen in die Zielregion des Herzens injiziert.

Nachdem der Embryo inkubiert wurde, wird das Herz entnommen und in Kultur gelegt. Schließlich wird das Schicksal der injizierten oder markierten Zellen mikroskopisch bestimmt. Letztendlich wird das Schicksal von injizierten, markierten oder genetisch veränderten Zellen durch konfokale Mikroskopie oder Licht- und Epifluoreszenzmikroskopie überwacht, um die funktionelle Bedeutung bestimmter Gene und Zellen während der Herzentwicklung aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie der Transgenese in der Maus besteht darin, dass wir lokal und präzise Laborzellen injizieren oder in vivo genetisch verändern können. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen in der richtigen Umgebung. Dieses Verfahren wird von mir und Emily aar, einer Doktorandin aus einem Labor, demonstriert.

Nach der Vorbereitung von Geräten, Reagenzien und Lösungen gemäß dem Textprotokoll werden E 9,5 und E 10,5 Embryonen von einer euthanasierten schwangeren Maus entnommen, indem Sie zuerst 70% Ethanol verwenden, um den Brustkorb zu sterilisieren, einen ventralen Mittellinienschnitt vornehmen, um den Bauch zu öffnen und das Gebärmutterhorn zu entfernen, bevor Sie es in PBS bei Raumtemperatur übertragen. Nach zwei weiteren Wäschen in PBS geben Sie es in eine mit Silikon gefüllte Petrischale. Bei M 16 medium wird das Gebärmutterhorn mit Insektennadeln an die Silikonschicht geheftet, so dass die vaskularisierte Seite der Gebärmutter darunter liegt.

Schneiden Sie dann mit einer feinen Pinzette die Oberfläche der Gebärmutter ab und verschließen Sie den Milchbaum einen Millimeter unter der Oberfläche. Spreizen Sie die Wände der Laubschale und holen Sie den Embryo vorsichtig in den Dottersack. Lagern Sie es vor der Zellinjektion in M 16, Medium bei 37 Grad Celsius, um Injektionen durchzuführen.

Verwenden Sie zunächst eine Hamilton-Spritze, um eine Glaspipette von hinten mit DNA oder Zellen zu füllen, und schütteln Sie die Pipette, um Blasen zu entfernen. Setzen Sie die Pipette an der Spitze auf den Mikroinjektionshalter und stellen Sie den Injektor gemäß den folgenden Einstellungen ein. Als nächstes stecken Sie den Embryo durch den Dottersack an den Silikonboden, ohne den eigentlichen Embryo zu berühren.

Identifiziere dann die Region des Herzens und öffne den Sack knapp über dieser Region. Fügen Sie vier Stifte um den Embryo hinzu, um Bewegungen während der Zellinjektion zu verhindern. Positionieren Sie die Pipettenspitze mit dem Mikromanipulator, der auf manuell eingestellt ist, langsam in einem Winkel von 45 Grad über dem Perikard, direkt über dem Bereich des Herzens, der injiziert werden soll.

Bewegen Sie die Pipette in den interessierenden Bereich, lösen Sie die Injektion aus und nehmen Sie die Pipette so schnell wie möglich heraus. Stellen Sie sicher, dass das Herz nach der DNA- oder Zellinjektion richtig schlägt. Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Injektionsprotokolls zur Untersuchung des Übergangs von Epithel zu Mesenchym und E 9.5 A VC wurde ein S-H-R-N-A injiziert, das ein Protein herunterreguliert, das für den endothelialen mesenchymalen Übergang von Endokardzellen erforderlich ist. Dem Kontrollembryo wurde ein leerer Rückgratvektor injiziert, ebenso wurden aus HUES-Zellen stammende endotheliale Prävalvularzellen, die GFP exprimieren, unter der Kontrolle des SOX-Neun-Promotors in den A-VC bei E 10,5 injiziert, gefolgt von einer 48-stündigen explantierten Herzkultur.

Diese Zellen erwerben Marker für EMT, wie z. B. Periostin, ähnlich wie die endogenen Endokardzellen. Die hier gezeigten Ex-vivo-Ansätze sind relativ einfach, aber auf eine maximale kurzfristige Nachbeobachtungszeit von 48 bis 72 Stunden beschränkt. Das im Textprotokoll beschriebene ultraschallgesteuerte Injektionsverfahren bietet jedoch einen technisch anspruchsvolleren Ansatz, jedoch mit der Option einer langen, auch postnatalen Nachsorge in utero.

Hier ist die In-utero-Injektion von Farbstoff- oder viralen Vektoren zur Markierung von Zellen in bestimmten Herzregionen dargestellt. Mit dieser Methode kann eine spezifische Markierung von Epikardzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Viren erreicht und die Methode mit Zellen oder alternativen Injektionsmitteln erweitert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Methode wie die Bryokultur durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Langzeitwirkung eines Gens, eines Moleküls oder das Auslesen von Longlistings, wie z.B. die Morphogenese des Gewebes nach seiner Entwicklung, zu beantworten.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der kardialen Entwicklungsbiologie und Genetik. Es ermöglicht uns, die Welt der neuen Gene zu erforschen und das Schicksal menschlicher Zellen im richtigen embryonalen Kontext zu untersuchen. Dies ist sehr nützlich, wenn keine transgene Mauslinie verfügbar ist.