Name: Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Zellen, Farbstoffe oder DNA in embryonale Mäuseherzen injizieren, um Zellschicksal und Genexpression lokal zu manipulieren. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der Herzentwicklung.

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Die Autoren danken der Stiftung Leducq (Mitralklappe) und die Agence Nationale pour la Recherche (ANR gewähren Specistem) für die Finanzierung dieser Forschung.

1. Vorbereitung Tierverfahren Holen Sie die Genehmigung aus einem Tierethikkommission und folgen den Richtlinien des Instituts für die Arbeit mit dem Virus, HuESC und / oder iPSC (wenn zutreffend), sowie Maus Handhabung, den Erhalt Maus-Embryonen und die Durchführung Maus Chirurgie. Für den Zeit Paarungen, wird der Tag des Steckers als embryonalen Tag (E) 0,5 / 0,5 Tage post-coitum. <ol><li> Mikroinjektion Nadeln: Für ex utero Mikroinjektion, mit einer Pipette Puller / Schweißkantenformer, um eine 1 oder 10 um interne Spitzendurchmesser und eine scharfe und Kegelspitzenform, DNA oder Zellen injizieren bzw. bekommen ziehen Glaspipetten (1,2 mm Außendurchmesser Borosilikat-Kapillaren). Für Ultraschall-vermittelte Injektionen, Nutzung angepasst sterile Nadeln, die eine Außen / Innendurchmesser (OD / ID) von 1,14 mm/0.53 mm, mit einer 50/35 um OD / ID-Spitze haben. </li><li> Silicon-gefüllten Petrischalen: Bereiten Silizium, wie in der Anleitung beschrieben. Füllenein sauberes Glas 60 mm Durchmesser Petrischale mit einer Elastomerschicht von ca. 1 cm. Luftblasen vermeiden. </li><li> Instrumente: Halten Sie alle chirurgischen Instrumente steril vor und während des Verfahrens. </li><li> DNA-Präparation: In 3 ug DNA und 12 ul Opti-MEM in einem Rohr. In 3 ul Lipofectamine 2000 und 12 ul Opti-MEM in einem anderen Rohr. Inkubation für 5 min bei RT und beide Lösungen. Verwenden Sie sofort. </li><li> Zellpräparation: Eine Suspension von 10 6 Zellen / ml DMEM (Dulbecco-Eagle Medium, High Glucose und 50% Rattenserum). 50 ul Zellsuspension ist genug für 8-10 Embryonen. </li><li> Dye Zubereitung: Verwenden Sie das grün fluoreszierende CDCFDA-SE bei 25 mg / ml DMSO. Es werden 20 ul Aliquots und bei -20 ° C Verdünnt 1:100 / 1:200 in steriler Kochsalzlösung oder PBS vor dem Gebrauch. </li><li> Virus Zubereitung: Einen kommerziellen 3. Generation PGK-GFP-exprimierenden Lentiviren mit einem Titer von ~ 10 9 -10 10 transducing Einheiten / ml DMEM. Für die Herstellung von Lentiviren finden Tiscornia et al. 14. Persönliche Schutzausrüstung tragen und sicher zu verwenden und zu entsorgen Virus. </li></ol> 2. Sammlung von E9.5 und E10.5 Embryonen für Ex-vivo-Injection <ol><li> Euthanize eine schwangere Maus an embryonalen Tag 9,5 bzw. 10,5. </li><li> Sterilisieren der Brust und Bauch der Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt, um den Bauch zu öffnen und rufen Sie die Uterushorn bei RT in PBS und übertragen sie nach zwei Waschungen mit PBS auf eine silikongefüllte Petrischale mit M16-Medium. </li><li> Pin das Uterushorn mit Insektenstifte auf die Silikonschicht, so dass die vaskularisierte Seite des Uterus ist an der Unterseite. </li><li> Schneiden Sie die Oberfläche des Uterus mit einer feinen Pinzette, und eine Kappe der Decidua bei 1 mm unter der Oberfläche. </li><li> Abrufen vorsichtig das Embryo im Dottersack von Ausbreiten die Wände der Decidua. </li><li> Bewahren Sie die Embryonen bei 37 °, C in M16 Medium vor der Zellinjektion. Für die Injektion wird jedem Embryo auf der Siliconschale mit M16-Medium gefüllt, auf 37 ° C vorgewärmt über </li></ol> 3. DNA oder Zellinjektion unter einem Stereomikroskop <ol><li> Füllen Sie die Glaspipette von der Rückseite mit einer Hamilton-Spritze und schütteln Sie die Pipette, um Blasen an der Spitze zu entfernen. </li><li> Stellen Sie die Pipette auf die Mikroinjektion Halter; stellen Sie den Haltedruck bis 50 (DNA) oder 30 (Zellen) hPa, und der Einspritzdruck auf 150 (DNA) bis 300 (Zellen) hPa. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,2 sec (DNA) oder 0.5 (Zellen). Diese Einstellungen kann sich je nach Art der Mikroinjektor und Pipetten variieren. </li><li> Pin der Embryo auf die Silikon unten durch den Dottersack, ohne den Embryo richtig. Beobachten Sie die Region des Herzens, und öffnen Sie den Sack gerade über diese Region. </li><li> In 4 Pins um den Embryo, jede Bewegung während der Zellinjektion zu verhindern. </li><li> Mit dem Mikromanipulator (auf manuell eingestellt), slowly-Position der Pipettenspitze in einem Winkel von 45 ° über dem Herzbeutel, nur über dem Bereich des Herzens, die injiziert werden soll (Fig. 1). </li><li> Bewegen der Pipette in der Region von Interesse und die Injektion auslösen. Nehmen Sie die Pipette so schnell wie möglich. Stellen Sie sicher, das Herz richtig nach DNA / Zellinjektion zu schlagen. </li></ol> 4. Embryo, Isoliert Herz und Explantation Kultur <ol><li> Kultur die E9.5-Embryonen in 25% M2 Medium und 75% Rattenserum, Penicillin / Streptomycin, bei 37 ° C vorgewärmt und mit 40% O 2 sauerstoffhaltigen ergänzt. </li><li> 2 ml Kulturmedium in einem 25 ml Glasrohr, sanft fügen Sie den Embryo, und sauerstoff mit 40% O 2 vor dem Aufschrauben der Kappe auf dem Rohr. Inkubieren bis zu 36 Stunden bei 37 ° C unter Rotieren oder Schütteln (30 U / min). </li><li> Bei der gewünschten Zeitpunkt (zB 24 Std.), sezieren die Herzen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, ohne sie zu berühren die Herzen, indem Sie zuerst decapitating die Embryonen; das Herz ist einfach zu Verbrauch durch Herausziehen mit der distalen Ausflusstrakt. </li><li> Kultur der isolierten Herzen für einen anderen 36-48 h in DMEM mit 50% FCS auf einer Matrigel-beschichteten Einsatz in einer 12-Well-Platte gesetzt. Siehe Dyer &amp; Patterson (2013) für ein verbessertes Protokoll von Herz Kultur 15. </li><li> Machen Sie keine Explantation der Region von Interesse. Als ein Beispiel, sezieren die atrioventrikuläre Kanal (AVC) und Kultur, die sie für 48 Stunden auf Kollagen Typ-1-Gel-16. </li></ol> 5. Ultraschall-gesteuerte Injektion in der Herz-I n utero <ol><li> Aufbau der Ultraschallgerät und Mikroinjektor: <ol><li> Verwenden Sie die hochauflösenden Ultraschallsystem mit einem 40-MHz-Wandler und die Mikroinjektion Setup auf einer Schiene. </li><li> Stellen Sie das Injektionsvolumen auf der Mikroinjektor bei 69 nl pro Injektion. Siehe Mikroinjektion im Handbuch des Herstellers für die Programmierung der Mikroinjektor. </li></ol></li><li> Herstellung des microinjection Einrichtung und Injektion: <ol><li> Stellen Sie ein Glas in der Mikropipette Mikroinjektor. Um eine effiziente Injektion erste Schicht durch Ansaugen bis zum Maximalvolumen gewährleisten die Innenseite der Pipette mit Mineralöl. Dann wieder auswerfen das Öl, so dass 1-2 mm von Öl in der Nadel. </li><li> Saugen Sie den Injektions, bis die maximale Lautstärke erreicht ist. Achten Sie darauf, dass die Oberflächen mit der Nadelspitze zu berühren, da dies die Spitze stumpf und machen Injektion schwieriger. </li><li> Zur Stabilisierung des Uterushorns, die die Embryonen während der Injektion mit einem modifizierten Petri-Schale mit einem Loch in der Mitte (2,5 cm Durchmesser), die durch eine dünne Silikonmembran mit einem kleinen Spalt in der Mitte geschnitten bedeckt, und positionieren sie über der Inzisionsstelle . Stabilisierung der Petrischale auf der Maus Handhabungstabelle durch Positionieren 3-4 Klumpen von Ton unter den Rändern der Schale. </li></ol></li><li> Injektionsverfahren: <ol><li> Rasieren Sie den Bauch einer schwangeren Maus (an der gewünschten embryonalen Stadium) vor anesthesia um Haare zu entfernen. Behandeln Sie den Bauch mit einem chemischen Haarentfernungsmittel, um restliche Haare zu entfernen und zu sterilisieren mit 70% Ethanol. </li><li> Anesthetize eine schwangere Maus mit Sauerstoff / Isofluran über eine Gesichtsmaske. Verwenden 3-5% Isofluran in 100% Sauerstoff für die anfängliche Anästhesie, während der Rest des Verfahrens, gefolgt von 1-1,5%. Stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend sanft kneifen die Pfoten und / oder Schwanz betäubt. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Maus Handhabung Tabelle (eingestellt auf 37 ° C erwärmen) und decken die Augen mit Schmierstoff zu Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. </li><li> Bewerben Elektroden-Gel auf den Elektroden und kleben Sie die Pfoten an den Elektroden, die Herzfrequenz, Atemfrequenz und EKG-Monitor. Positionieren Sie eine rektale Thermometer auf Körpertemperatur zu überwachen. </li><li> Überprüfen Sie zunächst, dass die Maus schwanger durch die Visualisierung und das Zählen der Embryonen durch Ultraschall ist. Bewerben Ultraschall-Gel auf den Bauch und positionieren Sie den Scankopf über der Blase. Für Konsistenz, visualisieren die erste Blase,und zählen Embryonen in der linken und rechten Uterushörner, ausgehend von der Position der Blase. Stellen Sie sicher, dass embryonale Herzen sind normalerweise schlagen. </li><li> Wenn die Maus schwanger ist, positionieren Sie den Petrischale über der Zukunft Einschnittstelle mit Ton. Drücken Sie die Schale leicht auf den Bauch, so dass das Gericht ist in direktem Kontakt. </li><li> Entfernen Sie die Schale und den Bauch wieder zu sterilisieren. Machen Sie eine 1,5-2 cm ventralen Mittellinie Schnitt von etwa 0,75 bis 1 cm über der Vagina, um den Bauch und Bauchfell zu öffnen. Verletzung innerer Organe zu vermeiden. </li><li> Exteriorisieren den linken oder rechten Uterushorn mit einer Pinzette, ziehen sanft es durch die Silizium-Membran der Schale, und stabilisieren das Gericht auf der Ton wieder. Verhindern umfangreichen Ziehen oder Manipulation, da dies Blutungen Uteringefäße und vorzeitigen Tod des weiblichen und / oder Embryonen führen. </li><li> Zählen Sie die Embryonen wieder angemessene Aufzeichnungen, von denen Embryonen injiziert zu gewährleisten. </li><li> Bewerben Ultraschall-Gel auf der uterine Hörner auf Bild, um das Herz und die Austrocknung zu verhindern. </li><li> Bild die erste Embryo injiziert werden. Überprüfen normalen Schlagen des embryonalen Herzens und Aufzeichnungen der Schädel-Schwanz-und Links-Rechts-Orientierung des Embryos. Falls erforderlich, die Position des Uterushorn leicht auf die richtige Ausrichtung zu gewährleisten. Wenn dies erweist sich als schwierig, fahren Sie mit der nächsten Embryo. </li><li> Punktion des Uterus sorgfältig mit dem Mikroinjektionsnadel, die Nadel in einem Winkel von 45 ° über dem Embryo zu positionieren, leicht außerhalb des Herzbeutels (3). Für die Kennzeichnung von epikardialen Zellen, Bild das Herz im Vierkammerblick und die Position der Nadel, so dass es auf die atrioventrikuläre Nut (Abbildung 3) zeigt. Wenn der Winkel eingestellt werden muss, ziehen Sie die Nadel und neu zu positionieren. Sie den Winkel mit der Nadel in die Gebärmutter nicht einstellen, da sich hierdurch die Nadel brechen. Vermeiden Stechen anderen Geweben, wie Gliedmaßen oder Plazenta. </li><li> Bewegen Sie die Nadelauf den Herzwand und durchstechen Sie es mit einem sanften, aber schnellen Bewegung. In der Regel wird es einigen Widerstand, aber bewegt die Nadel zu schnell kann sich der Nadelspitze, um das Herz selbst punktieren. Die Spitze sollte in die Perikardhöhle der atrioventrikulären Furche beenden. Im Fall von perikardialen Blutungen, Blutzellen wird als weißer schneeartige Muster sichtbar. Wenn dies der Fall ist, beenden Sie das Einspritzen des Embryos und nun zu einem anderen Embryo. </li><li> Injizieren Sie die Injektions. Spritzen Sie maximal 700 nl in den Herzraum, um nachteilige Auswirkungen auf die Herzen Entwicklung zu verhindern. Überwachen Sie den richtigen Einspritz durch leichte zeitliche Schwellung der Herzbeutel. </li><li> Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel heraus und bestätigen, dass Injektions noch ausgeworfen wird, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht durch Gewebefragmente verstopft sein. </li><li> Positionieren Sie den Umgang Tabelle für Bild und injizieren das nächste Embryo. Halten Sie die Anzahl der injizierten Embryonen auf maximal 3-4 (in einem Gebärmutterhorn) zu verhindernAnästhesie verlängert, um die Kontrolle Embryonen in der gegenüberliegenden Uterushorn zu ermöglichen und um sicherzustellen, dass das Verfahren nicht stören Embryonalentwicklung. </li><li> Nach der Injektion die gewünschte Anzahl der Embryonen, überschüssige Ultraschall-Gel und sanft legen Sie das Uterushorn zurück in den Unterleib in die richtige Position. </li><li> Schließen des mütterlichen Bauch unter Verwendung einer Schicht des Fadens für das Bauchfell-und Bauchmuskulatur, und eine zweite Schicht des Fadens für die Haut. </li><li> Spritzen Sie die Maus mit der ersten Dosis von Schmerzmitteln. Verwenden Sie eine Injektion von 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin 15 min vor Ende der Anästhesie und drei weitere Injektionen mit 12-Stunden-Intervallen. </li><li> Brechen Anästhesie und überwachen die Maus für ausreichende Erholung von dem Eingriff. Haus die schwangere Maus im Einzelkäfig für die gewünschte Dauer des Follow-up. </li></ol></li></ol>

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<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vix.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die oben beschriebenen intrakardialen Injektion ex vivo-Protokolle sind für die myokardiale Funktion für mindestens 48 h im mittleren Stadium (E9.5-E11.5) Maus-Embryonen erhalten. Diese Injektions Ansätze ermöglichen räumlich gezielte Injektion von DNA oder Zellen. Die wenigen Beispiele in den Figuren 1-3 gezeigt nachweisen Konzept für die Abgrenzung ex vivo und in vivo molekularen Mechanismen der Entwicklungsprozesse, die in eingeschränkter Herz Regionen, wie EMT der endokard...

Vor mehr als einem Jahrzehnt haben menschliche embryonale Stammzellen (HuESCs) aus menschlichen Blastozysten 1 abgeleitet. Seitdem haben sich diese Zellen zum Gegenstand einer wichtigen Forschungsgebiet, das unerfüllte Fragen in der menschlichen Entwicklungsbiologie befasst. HuESCs haben ferner vorgesehen Hoffnungen in der regenerativen Medizin. In den letzten Jahren wurden menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus patientenspezifische Körperzellen erzeugt worden ist, die Bereitstellung von Modellen Erbkrankheit 2. Viele Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, einschließlich Herz-Abstammungslinien 3, wurden berichtet. Die differenzierten Zellen werden oft durch Analyse von RNA und Protein-Expression, Immunfärbung und / oder in-vitro-Funktionstests phänotypisiert. Allerdings haben pluripotente Stammzelle Derivate in einem richtigen embryonalen Umgebung, um zu testen, ob sie die cel vollständig erwerben platziert werdenl Schicksal ihrer embryonalen Gegenstück, und ob sie den echten in vivo Funktion als Reaktion auf regionale Hinweise zu rekapitulieren. Während Tissue Engineering ist vielversprechend, ist es noch nicht bieten alle bekannten und unbekannten Signale der richtigen In-vivo-Entwicklung embryonalem Gewebe 4,5. Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren in Embryos, einschließlich Maus-Embryonen wurden wichtige Informationen über die Herkunft der embryonalen Zelllinien während der Herzentwicklung 6 gebracht. Beispielsweise Farbstoffinjektion in die Perikardhöhle von Maus-Embryonen ex vivo, gefolgt von in vitro-Kultur von isolierten Herzen, wurde zur epikardialen Zellen und deren Nachkommen 7 beschriftet. Allerdings Farbstoff und retroviralen Zell Kennzeichnung wurden meist auf frühe Mausembryonen mit noch schwach entwickelten Organen oder Hühnerembryonen, die leichter zugänglich sind 8 angewendet. Eine Ausnahme ist das Gehirn, die einfacher in E zum Ziel istmbryos 9,10. Ein solcher Ansatz ist noch nicht zu der embryonalen Mäuseherzen schlagen angewendet. Um mit Farbstoffen oder Virus ergänzen direkte Markierung und Linienverfolgung in weiter fortgeschrittenen Stadium Maus-Embryonen und erwachsenen Mäusen durchzuführen, hat sich die Zellmarkierung Ansatz mit der Analyse von transgenen Mäusen mit Hilfe des Cre / lox-Technologie kombiniert. Das Cre / Lox-Ansatz jedoch 11 verfügt über einige Einschränkungen aufgrund der räumlich-zeitlichen Spezifität der genomischen regulatorischen Regionen verwendet, um die Expression der Rekombinase zu fahren, und die Effizienz des Cre / Lox Rekombination 12. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht vollständig die spezifischen Fragen der Zellmigration gesteuert erfasst Zellschicksal ehen, da es nur eine Vorstufe zu kennzeichnen nach der Aktivierung der regulatorischen Region zur Cre-Expression zu fahren. Es kann auch nicht an menschlichen Embryonen zu offensichtlichen ethischen Probleme gelten. Angesichts dieser Einschränkungen, haben wir eine Reihe von neuen protocols, um eine Vielzahl von Zellmarkierungsmittel, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Viren, Modulatoren der Genexpression wie shRNA und DNA-basierte Zellmarkierung Vektoren oder Zellen der Maus Embryo E9.5 und späteren Stadien der Entwicklung in den Zielregionen der injizieren Herz. Die DNA / Zellinjektionen mit einem Stereomikroskop und eine einfache Mikroinjektionsvorrichtung kombiniert mit ex vivo Embryokultur bis zu 48 h, oder isolierte Herz-oder embryonale Explantatkultur für 48-72 Std. Wir haben auch ein Ultraschall-vermittelte Mikroinjektion Protokoll in embryonalen Maus-Herzen in utero zu melden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Entwicklung von Embryonen 13 und ermöglicht Langzeit-Follow-up der Injektate und / oder markierten Zellen. Wir fanden, dass diese Ansätze die Erhaltung der Funktion des Organs und liefern eine repräsentative Umgebung als in-vitro-Tests der Stammzellpotential. Es bietet auch die Möglichkeit, Migration folgenvon markierten und / oder injizierten Zellen, ihr Schicksal zu überwachen. Letztendlich sollten diese ein besseres Verständnis der regionalen Gewebemusterbildung und biologische Schlüsselprozesse ergeben.

<table><tbody><tr><td>Setups/Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 MHz Wandler</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>5242</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Erforderlicher Stickstoff</td><td></td><td></td><td>zur Druckbeaufschlagung des Injektors</td></tr><tr><td>Schienensystem</td><td>VisualSonics-Rotator</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>zum Drehen von Glasröhren mit Embryonen im Inkubator</td></tr><tr><td>Standard-Inkubator</td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37 &#176; </td></tr><tr><td>C Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillarrohre</td><td>World Precision Instrument</td><td>KTW-120-6</td><td>1,2-&mu; m Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Sutter</td><td>Modell P87</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsnadeln</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>OD/ID 1,14 mm/53 mm, mit 50/35 &mu; m OD/ID</td></tr><tr><td>Spitze Hamilton Spritzen&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td>mit 10 cm Durchmesser</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Silikonmembran</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4,3 x 4,3 cm</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Vet One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungsmittel</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye Gleitmittel</td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodengel (Signa)</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naht</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgel</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenex Buprenex (Buprenorphin Hydrochlorid)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0,05-0,1 mg/kg in Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Elastomer Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Glaspetrischalen</td><td>Fine Science Tools</td><td></td> Insektenstifte <td>mit 60 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Medien- und Kulturreagenzien </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>Rattenserum mit hohem Glukosegehalt und 50 %</td></tr><tr><td>M16 Medium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Janvier</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>Pennicilin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff 40 %</td> <td>Luftflüssigkeit</td><td></td><td>erforderlich, um das Embryokulturmedium mit Sauerstoff anzureichern</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Fisher</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>zur Beschichtung von Kulturschalen für Explantatkulturen</td></tr><tr><td>Kulturschalen</td><td>Dutcher /Orange</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td>Injectates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDCFDA-SE</td><td>Invitrogen/Molekulare Sonden</td><td>C1165</td><td>25 mg/ml DMSO. Bei -20 &#176;C lagern. Vor Gebrauch 1:100-200 in Kochsalzlösung verdünnen.</td></tr><tr><td>PGK-GFP-exprimierendes Lentivirus&nbsp;</td><td></td><td></td><td>~8E9 Transducing-Einheiten/ml DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

zellmarkierung und einspritzung in entwicklungs embryonalen maus-herzen

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testen das Schicksal der embryonalen oder pluripotenten Stammzellen-Derivate in in-vitro-Protokolle hat zu kontroversen Ergebnissen, die nicht ihre in vivo Potential nicht unbedingt geführt. Vorzugsweise sollten diese Zellen in einer geeigneten Umgebung embryonalen um ihre definitive Phänotyp erwerben platziert werden. Zudem hat Zelllinie Tracing Studien in der Maus nach der Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren meist auf frühzeitig Maus-Embryonen mit noch schwach entwickelten Organe geblieben. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Standard-und Ultraschall-vermittelten Mikroinjektion Protokolle verschiedener Mittel in den Zielregionen des Herzens in Maus-Embryonen an E9.5 und späteren Entwicklungsstadien zu injizieren. Embryonale Explantat oder Embryonen werden dann kultiviert oder links, um in utero weiter zu entwickeln. Diese Mittel umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Virus, shRNA oder Stammzellen abgeleiteten Vorläuferzellen. Unsere Ansätze ermöglichen die Erhaltung der funktion der Orgel während der Überwachung der Migration und das Schicksal von markierten und / oder injizierten Zellen. Diese Technologien können auf andere Organe ausgedehnt werden und wird sehr hilfreich sein, wichtige biologische Fragestellungen in der Biologie der Entwicklung zu befassen.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Injektionsprotokolle können Zellen markiert und / oder in die embryonalen Maus-Herz injiziert werden. Als Proof of Concept, werden mehrere Beispiele gezeigt, in dem die Injektionsprotokoll und die Ex-vivo-AVC Explantation, isoliert Herz, oder ganze Embryokultur wurden kombiniert (Abbildung 1). Figur 1 zeigt die Herstellung des Embryos vor der Zellinjektion. Die E9.5 Embryo aus seiner Dezidua entfernt, während ...

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen, Farbstoff oder DNA in embryonale Mausherzen zu injizieren. Um die Zellfate oder die lokale Genexpression gezielt zu beeinflussen, werden zunächst die Embryonen aus einer trächtigen Maus herauspräpariert und das embryonale Herz freigelegt. Anschließend werden DNA, Farbstoff oder Zellen in den gewünschten Zielbereich des Herzens injiziert.Danach wird nach der Inkubation des Embryos das Herz entfernt und in Kultur gebracht. Schließlich wird das Schicksal injizierter oder markierter Zellen mittels Mikroskopie bestimmt. Letztendlich wird das Schicksal injizierter, markierter oder genetisch veränderter Zellen durch konfokale Mikroskopie oder Licht- und Epi-Fluoreszenzmikroskopie verfolgt, wodurch die funktionelle Bedeutung spezifischer Gene und Zellen während der Herzentwicklung aufgeklärt wird.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Transgenese bei der Maus besteht darin, dass wir labor- oder genetisch veränderte Zellen lokal und präzise in vivo injizieren können. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen in ihrem natürlichen Umfeld. Diese Prozedur werden ich und Emily Aar, eine Dok

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kennzeichnung embryonalen Haut und Thymus Blutgefäße.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik zur Visualisierung des sich entwickelnden Gefäßsystems. Hier verwendeten wir in utero intrakardiale FITC-markierte Tomaten-Lektin-Mikroinjektionen an Mausembryonen. Mit dieser Technik grenzen wir die perfundierten und undurchbluteten Gefäße in der gesamten embryonalen Niere ab.

In Utero Intraherz Tomato Lektin-Injektionen auf Maus Embryonen zu Nierendurchblutung Messer

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für ganze Berg Immunfluoreszenz und Image-basierten quantitativen volumetrische Analyse der frühen Stadium Mausembryonen. Wir präsentieren diese Technik als ein leistungsfähiger Ansatz qualitativ und quantitativ kardialen Strukturen während der Entwicklung zu bewerten, und schlagen vor, dass es möglicherweise sehr anpassungsfähig an andere Organsysteme.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.

Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Erfahren Sie, wie Sie Zellen, Farbstoffe oder DNA in embryonale Mäuseherzen injizieren, um Zellschicksal und Genexpression lokal zu manipulieren. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der Herzentwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

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