Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Reifung von Myofibrillen und Kardiomyozyten im sich entwickelnden embryonalen Mausherzen zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem das embryonale Herz zuerst in Schnittmedium ausgerichtet und eingefroren wird. Anschließend wird das Herz in der geeigneten Orientierung kryoseziiert.

Anschließend werden die Herzgewebeschnitte immunfluoreszenzmäßig auf Proteine von Interesse markiert. Abschließend erfolgt die konfokale Mikroskopie der immunogefärbten Herzgewebeschnitte. Letztendlich kommen zweidimensionale und dreidimensionale Bildanalysen zum Einsatz, um die Entwicklung von MyFi und anderen kardialen Strukturen der Kardiomyozyten darzustellen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Herzentwicklung beantworten, beispielsweise wie Mutationen und kardiale Gene die Assembly von MyFi sowie die Entstehung spezifischer Strukturen wie interkalierter Scheiben und Costumer beeinflussen. Um embryonale Herzen einzufrieren, verwenden Sie ein optimales Schneidetemperatur- oder OCT-Medium, um eine 3,5 cm große Petrischale in einer chemischen Abzugshaube zu füllen. Kühlen Sie zwei Methylbutan in flüssigem Stickstoff.

Nach der Isolierung von embryonalen Mäuseherzen gemäß dem Textprotokoll die Herzen in OCT geben und mehrere Sekunden lang anlegen lassen, bevor sie in eine sieben Millimeter große Form mit OCT überführt werden. Die innere Wand des Herzens nach unten in die Form ausrichten. Die Form vorsichtig in das flüssigen Stickstoff gekühlte 2-Methylbutan bringen.

Darauf achten, dass die beiden Methylbutan-Flüssigkeiten das OCT oder das Herz nicht berühren, bis das OCT fest und weiß ist. Danach die Form in einen Eisbehälter mit Trockeneis überführen. Nachdem alle Herzen eingefroren sind, die Kryoschablonen in Folie einwickeln und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie für die Kryoschnitte bereit sind.

Um embryonale Herzen zu fixieren, PFA 4 % in PBS verwenden, um die Vertiefungen einer 12er-Kulturplatte zu füllen. Nachdem die embryonalen Herzen gemäß dem Textprotokoll präpariert wurden, jedes Herz in eine Vertiefung mit PFA geben und über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Um die Herzen für die Kryokonservierung vorzubereiten, jedes Herz mit einer plastischen Transferpipette in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das 1,5 Milliliter 15 %ige Sucrose in PBS enthält, und bei vier Grad Celsius vorsichtig agitieren, bis das Herz auf den Boden des Röhrchens sinkt. Danach jedes Herz in 30 %ige Sucrose in PBS überführen und bei vier Grad Celsius erneut vorsichtig agitieren, bis das Herz auf den Boden des Röhrchens sinkt.

Gefrieren Sie die Embryonen in OCT, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Nachdem die Kryoschneidformen in die Kryostatkammer gebracht und auf minus 17 Grad Celsius eingestellt wurden, drehen Sie die Kryoschneidform um und üben Sie sanften Druck aus, um den Herzblock aus der Form zu lösen. Richten Sie die vordere Wand des Herzens nach oben aus, sodass sie an der Oberseite des geformten Gewebeprobenblocks liegt.

Platzieren Sie einen großen Tropfen OCT auf den Spannfutter und montieren Sie den Herzblock auf den OCT-Tropfen. Achten Sie dabei darauf, dass die Orientierung so bleibt, dass die vordere Wand des Herzens am weitesten vom Spannfutter entfernt ist. Lassen Sie das Herz am Spannfutter einfrieren.

Laden Sie die Spannfutter und den befestigten Herzblock auf den Objekthalter des Kryostaten auf. Stellen Sie ihn so ein, dass der Winkel des Messers drei bis fünf Grad relativ zur Probe beträgt. Sammeln Sie 10 µm dicke Schnitte auf Mikroskopobjektträgern, die zuvor mit einer positiv geladenen Beschichtung vorbehandelt wurden.

Trocknen Sie die Proben vollständig, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern, um die Immunfluoreszenz durchzuführen. Nach der Fixierung und/oder Entfernung von OCT aus den Schnitten verwenden Sie einen x Blockierpuffer, der in PBS verdünnt ist, und blockieren 45 Minuten unter leichtem Schütteln. Wenn ein primärer Antikörper, der in Maus erzeugt wurde, verwendet wird, geben Sie ein donkey- oder goat-anti-maus-IgG-H-plus-L-monovalentes FAB-Fragment im Verdünnungsverhältnis 1 zu 100 in PBS mit 0,1 % Tween 20 hinzu und inkubieren bei Raumtemperatur für 45 Minuten unter leichtem Schütteln.

Fügen Sie den primären Antikörper oder die primären Antikörper, verdünnt in einem x Blockierpuffer, hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Schnitte dreimal mit einem x PBS je 10 Minuten. Geben Sie anschließend bei Raumtemperatur den konjugierten sekundären Antikörper, im Verhältnis 1:500 im Blockierpuffer verdünnt, zu den Proben und inkubieren Sie zwei Stunden lichtgeschützt.

Verwenden Sie bei Raumtemperatur ein XPBS, um die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten bei Lichtschutz zu waschen. Decken Sie die Objektträger mit einem Anti-Fade-Medium ab, indem Sie zwei Tropfen des Mediums auf jedes Ende des Objektträgers geben und mit einem Deckgläschen abdecken. Versiegeln Sie die Deckgläschen mit Nagellack.

Lagern Sie es bei vier Grad Celsius, lichtgeschützt, bis zur Bildaufnahme. Suchen Sie mit einem 4x-Objektiv und Laserfluoreszenz die Probe und den interessierenden Bereich. Erfassen Sie das Bild, um es als Karte zu verwenden.

Bei der Bildaufnahme mit hoher Vergrößerung die Objektivschiebung mit minimalen Einstellungen am Objekttisch entfernen. Danach wechseln Sie zu einem 60x-Ölimmersionsobjektiv.

Platzieren Sie einen kleinen Tropfen Öl auf dem Objektiv und setzen Sie die Probe erneut auf den Objekttisch. Suchen Sie die Probe danach erneut, und stellen Sie die Laserleistung, Belichtungszeit und Binning für jeden Kanal auf die gewünschten Werte ein. Sobald die optimalen Einstellungen gemäß den Anweisungen des Textprotokolls bestimmt sind, verwenden Sie diese Einstellungen für alle Gewebeschnitte innerhalb des Experiments.

Verwenden Sie das Intensitätshistogramm, um den optimalen Intensitätsbereich für jeden Kanal zu ermitteln, der für die Analyse verwendet wird. Erzeugen Sie einen Zack mithilfe der Aufnahmefunktion, indem Sie die geeigneten Laserkanäle auswählen. Wählen Sie anschließend die oberen und unteren Grenzen des Z-Stapels.

Wählen Sie eine Zack-Schrittgröße, die der halben optischen Schichtdicke entspricht, die von der Software bereitgestellt wird. Klicken Sie auf „Ausführen“, um die Bilder mithilfe von Fiji oder einem vergleichbaren Programm für die Bildanalyse aufzunehmen. Öffnen Sie die Zack-Datei mit einer benutzerdefinierten Farbmodus-Option und den Kanälen, die in separate Fenster aufgeteilt sind.

Öffnen Sie über das Dropdown-Menü „Bild“ das Werkzeug zur Anpassung von Helligkeit und Kontrast, und stellen Sie für jeden Kanal den optimalen Intensitätsbereich des Histogramms ein. Wie zuvor bestimmt, wenden Sie diese Kanalbereiche auf alle zu analysierenden Zacks an. Gehen Sie dann über das Dropdown-Menü „Bildfarbe“ und kombinieren Sie die einzelnen Kanäle zu einem einzigen zusammengesetzten Bild.

Erstellen Sie mithilfe des Menüs „Image Stacks Z Project“ einen flachen Z-Stapel aus dem zusammengesetzten Bild. Da dieses Bild deutlich heller sein wird als das 3D-Bild, passen Sie den Histogramm-Intensitätsbereich für die Kontrollprobe an, um eine Überbelichtung zu vermeiden, und wenden Sie dieselben Einstellungen auf den experimentellen, flachen Z-Stapel an. Um ein 3D-Bild zu erzeugen, wählen Sie zuerst das Menü „Image Stacks 3D Project“. Wählen Sie entweder die X-Achse oder die Y-Achse der Rotation.

Stellen Sie den Schichtabstand auf dieselbe Anzahl Mikrometer wie die Z-Stapel-Schrittgröße ein. Wählen Sie die gewünschte Gesamtdrehung und stellen Sie die Drehwinkelinkrementierung auf eins ein. Öffnen Sie dann den ImageJ-3D-Viewer über das Dropdown-Menü „Plugins“.

Wählen Sie die erzeugte zusammengesetzte Bildanzeige als Volumen und setzen Sie den Resampling-Faktor auf eins oder zwei. Diese Abbildungen zeigen typische Ergebnisse für die Co-Staining verschiedener Proteine in einem schockgefrorenen und einem Aceton-fixierten Herzen. Der Antikörper gegen S-Aktinin markierte wiederholt Z-Scheiben und interkalierte Scheiben mit hoher Spezifität und minimalem Hintergrund. Der Antikörper gegen das Adhärenz-Junction-Protein β-Catenin band an die Membran sowohl von Kardiomyozyten als auch von nicht-kardiomyozytären Zellen, und eine Kolokalisation mit SFA-Aktinin trat in vermuteten interkalierten Scheiben bei E 16,5 auf. Die Immunfluoreszenz von Beta-1-Integrin im embryonalen Herzen ist besonders anspruchsvoll, doch die Beta-1-Integrin-Färbung in diesen Studien zeigte ein Signal mit derselben Periodizität wie die von SFA-Aktinin markierten Z-Scheiben, was möglicherweise auf neu entstehende Kostümere hinweist, die bei E 16,5 gebildet werden.

Am E 12,5 zeigte das Färbemuster von SFA-Aktinin und Tropomyosin eine regelmäßige Periodizität in trabekulären Kardiomyozyten, die mit ausgereiften Myofibrillen in der äußeren kompakten Zone übereinstimmt. SFA-Aktinin war stärker punktförmig als linear, und das Tropomyosin-Signal war diffus statt linear. NCA-adhärente Färbung und trabekuläre Kardiomyozyten in Herzen vom Embryonalstadium E 12,5 wiesen eine Kolokalisation mit Bereichen intensiver SFA-Aktinin-Färbung auf, was möglicherweise auf interkalierte Scheiben hinweist. Gezeigt ist ein mit PFA fixiertes embryonales Herz vom Typ E 12,5, das für SFA-Aktinin und filamentöses Aktin aus einer Life-Act-RFP-Ruby-transgenen Maus markiert wurde. Das Signal-Rausch-Verhältnis von SFA-Aktin war im Vergleich zu schockgefrorenen Herzpräparaten verringert.

Die dreidimensionale Bildrekonstruktion zeigte, dass MyFi innerhalb eines Kardiomyozyten grob parallel zueinander verliefen, jedoch unterschiedliche Kardiomyozyten in variierenden Winkeln zueinander orientiert waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie embryonale Herzen korrekt orientiert und kryoseziiert werden, sowie wie Immunfärbungen, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse durchgeführt werden, um die MyFi- und Kardiomyozytenreifung während der Maus-Herzentwicklung zu untersuchen.Admit.