Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reifung von Myofialen und Kardiomyozyten im sich entwickelnden embryonalen Mausherz zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem das embryonale Herz zunächst in einem Schneidmedium ausgerichtet und eingefroren wird. Als nächstes wird das Herz in der richtigen Ausrichtung kryogeschnitten.

Dann werden die Herzabschnitte einer Immunfluoreszenzmarkierung von Proteinen unterzogen, die von Interesse sind. Abschließend wird eine konfokale Mikroskopie von immungefärbten Herzschnitten durchgeführt. Letztlich werden zweidimensionale und dreidimensionale Bildanalysen eingesetzt, um die Entwicklung von MyFi und anderen Kardiomyozytenstrukturen zu zeigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Entwicklung zu beantworten, z. B. wie Mutationen und kardiale Gene die MyFi-Assemblierung beeinflussen und wie spezifische Strukturen wie interierte Bandscheiben und Kunden entstehen. Zum Einfrieren von embryonalen Herzen verwenden Sie die optimale Schnitttemperatur oder das OCT-Medium, um eine 3,5 Zentimeter große Petrischale in einer chemischen Haube zu füllen. Kühl. Zwei Methylbutan in flüssigem Stickstoff.

Nachdem Sie die embryonalen Herzen der Maus gemäß dem Textprotokoll isoliert haben, legen Sie die Herzen in das OCT und lassen Sie sie einige Sekunden lang äquilibrieren, bevor Sie sie in eine sieben Millimeter große Form mit OCT übertragen. Richten Sie die Innenwand des Herzens zum Boden der Form aus. Legen Sie die Form vorsichtig in die mit flüssigem Stickstoff gekühlten zwei Methylbutane.

Achten Sie darauf, dass die beiden Methyl-Butan-Flüssigkeiten das OCT oder das Herz nicht berühren, bis das OCT fest weiß ist. Gib dann die Form in einen Eiskübel mit Trockeneis. Nachdem alle Herzen eingefroren sind, wickeln Sie die Kryoformen in Folie ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Kryosektion bereit sind.

Um embryonale Herzen zu fixieren, verwenden Sie 4%PFA in PBS, um die Vertiefungen einer 12-Folien-Kulturplatte zu füllen. Nachdem Sie die embryonalen Herzen gemäß dem Textprotokoll präpariert haben, legen Sie jedes Herz in eine Vertiefung mit PFA und fixieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die Herzen mit einer Kunststoff-Transferpipette kryosicher zu schützen, bewegen Sie jedes Herz in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1,5 Milliliter 15%ige Saccharose in PBS enthält, und rühren Sie vorsichtig bei vier Grad Celsius, bis das Herz auf den Boden des Röhrchens sinkt. Übertragen Sie jedes Herz auf 30%ige Saccharose in PBS und rühren Sie vorsichtig bei vier Grad Celsius, bis das Herz auf den Boden der Röhre sinkt.

Frieren Sie die Embryonen in OCT ein, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Nachdem Sie die Kryoformen in die Kryostatenkammer eingesetzt haben und einer Temperatur von minus 17 Grad Celsius entsprechen, drehen Sie die Kryoform um und üben Sie sanften Druck aus, um den Herzblock aus der Form zu entfernen. Richten Sie die Vorderwand des Herzens an der Spitze des geformten Gewebeblocks aus.

Geben Sie einen großen Tropfen OCT auf das Spannfutter und montieren Sie den Herzblock auf den OCT-Tropfen. Halten Sie die Ausrichtung so, dass die Vorderwand des Herzens am weitesten vom Chuck entfernt ist. Lassen Sie das Herz auf dem Futter einfrieren.

Laden Sie das Spannfutter und den montierten Herzblock auf den Kryostat-Objekthalter. Stellen Sie die Klinge so ein, dass der Winkel der Klinge drei bis fünf Grad relativ zur Probe beträgt. Sammeln Sie 10-Mikrometer-Schnitte auf Objektträgern, die mit einer positiv geladenen Beschichtung vorbehandelt wurden.

Lassen Sie die Proben vollständig trocknen, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern, um eine Immunfluoreszenz durchzuführen. Nach dem Fixieren und/oder Entfernen der OCT aus den Schnitten verwenden Sie einen x Blockierungspuffer, der in PBS verdünnt ist, um 45 Minuten lang unter leichtem Schütteln zu blockieren. Wenn Sie einen primären Antikörper verwenden, der in der Maus erzeugt wurde, fügen Sie ein monovalentes FAB-Fragment aus Esel oder Ziege gegen Maus hinzu, das in PBS 0,1 % zwischen 20 verdünnt ist, und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.

Primärantikörper oder Antikörper, die in einem x Blockierungspuffer verdünnt sind, zugeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation mit einem XPBS dreimal 10 Minuten lang. Bei Raumtemperatur wird der konjugierte Sekundärantikörper mit einem Addor von 1 bis 500 in einem Blockierungspuffer zu den Proben verdünnt und zwei Stunden lang lichtgeschützt inkubiert.

Bei Raumtemperatur die Abschnitte mit einem XPBS dreimal 10 Minuten lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur waschen. Montieren Sie die Objektträger auf Anti-Fade-Medium, indem Sie zwei Tropfen Medium auf jedes Ende der Folie geben und ein Deckblatt zum Abdecken verwenden. Verwenden Sie Nagellack, um die Deckgläser zu versiegeln.

Lagern Sie es bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt, bis es abbildbereit ist. Mit einem vierfachen Objektiv und Laserfluoreszenz können Sie die Probe und den interessierenden Bereich ermitteln. Erfassen Sie das Bild, um es als Karte zu verwenden.

Bei der Bildgebung mit hoher Vergrößerung. Entfernen Sie die Folie, indem Sie minimale Anpassungen an der Folienbühne vornehmen. Wechseln Sie dann zu einem 60 x Ölimmersionsobjektiv

Geben Sie einen kleinen Tropfen Öl auf das Objektiv und setzen Sie den Objektträger wieder auf den Objektträgertisch. Suchen Sie als Nächstes die Probe erneut, stellen Sie die Belichtungszeit der Laserleistung und das Binning für jeden Kanal auf die gewünschten Pegel ein. Sobald die optimalen Einstellungen gemäß den Richtlinien des Textprotokolls bestimmt sind, verwenden Sie die Probeneinstellungen für alle Gewebeschnitte innerhalb des Experiments.

Verwenden Sie das Intensitätshistogramm, um den optimalen Intensitätsbereich für jeden Kanal zu notieren, der für die Analyse verwendet wird. Erzeugen Sie einen Zack mit der Erfassungsfunktion, indem Sie die entsprechenden Laserkanäle auswählen. Wählen Sie dann die obere und untere Grenze des Z-Stapels aus.

Wählen Sie eine Zack-Schrittgröße, die halb so groß ist wie der Wert der von der Software bereitgestellten optischen Schichtdicke. Klicken Sie auf Ausführen, um die Bilder mit Fiji oder einem vergleichbaren Programm zur Bildanalyse zu sammeln. Öffnen Sie die Zack-Datei mit einer benutzerdefinierten Farbmodus-Option und teilen Sie die Kanäle in separate Fenster auf.

Öffnen Sie im Bild-Pulldown-Menü das Werkzeug zum Anpassen des Helligkeitskontrasts und stellen Sie in jedem Kanal den optimalen Intensitätsbereich des Histogramms ein. Wenden Sie diese Kanalbereiche, wie zuvor festgelegt, auf alle zu analysierenden Zacks an. Ziehen Sie dann aus dem Menü "Bildfarbe" nach unten die einzelnen Kanäle zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammen.

Erstellen Sie im Projektmenü "Bildstapel Z" einen abgeflachten Z-Stapel aus dem zusammengesetzten Bild. Da dieses Bild deutlich heller ist als das 3D-Bild, passen Sie den Intensitätsbereich des Histogramms für das Kontrollsample an, um eine Übersättigung zu vermeiden, und wenden Sie die gleichen Einstellungen auf das experimentell abgeflachte Zack an. Um ein 3D-Bild zu erzeugen, wählen Sie zunächst das Menü "3D-Projekt" der Bildstapel. Wählen Sie entweder die X-Achse oder die Y-Rotationsachse.

Legen Sie den Schichtabstand auf die gleiche Anzahl von Mikrometern wie die Schrittgröße des Z-Stapels fest. Wählen Sie die gewünschte Gesamtdrehung und stellen Sie das Inkrement des Drehwinkels auf eins ein. Öffnen Sie dann den Image J 3D-Viewer aus dem Pulldown-Menü der Plugins.

Wählen Sie das generierte Composite-Bild als Volumen aus und stellen Sie den Resampling-Faktor auf eins oder zwei ein. Diese Abbildungen zeigen typische Ergebnisse für die cos-Färbung verschiedener Proteine in einem Snap Frozen, einem Aceton-fixierten Herzen, dem Antikörper gegen S-alpha-Actinin, reproduzierbar markierten Z-Scheiben und in interierten Scheiben mit hoher Spezifität und minimalem Hintergrund. Der Antikörper gegen das Adhärenzverbindungsprotein Beta-Catenin band die Membran sowohl von Kardiomyozyten als auch von Nicht-Kardiomyozytenzellen, und die Kolokalisation mit SFA-Actinin trat in vermuteten interierten Scheiben bei E 16,5 beta one Integrin-Immunfluoreszenz im embryonalen Herzen auf, aber die Beta-Eins-Integrin-Färbung in diesen Studien zeigte ein Signal mit der gleichen Periodizität wie SFA-Actinin-markierte Z-Scheiben. möglicherweise auf aufstrebende Kunden, die sich bei E 16,5 bilden.

Bei E 12,5 zeigte das SFA-Aktinin- und Tropo-Mycin-Färbemuster eine regelmäßige Periodizität in trabekulären Kardiomyozyten, die mit reifen Myofibrillen in der äußeren kompakten Zone übereinstimmte: SFA-Actinin war eher punktförmig als linear, und das Tropo-Myosin-Signal war diffus statt linear, NCA-adhärente Färbung, und trabekuläre Kardiomyozyten an E 12,5-Herzen waren co-lokalisiert mit Bereichen mit intensiver SFA-Aktinin-Färbung, die möglicherweise interierte Bandscheiben darstellen. Hier ist ein PFA-fixiertes embryonales Herz E 12.5 zu sehen, das für SFA-Actinin und filamentöses Akton von einer transgenen Maus mit RFP-Ruby markiert ist. Das Verhältnis von SFA-Aktinsignal-zu-Rauschen war im Vergleich zu Snap-Frozen Heart-Schnitten verringert.

Die dreidimensionale Bildrekonstruktion zeigte, dass MyFi innerhalb eines Kardiomyozyten ungefähr parallel zueinander war, aber einzelne Kardiomyozyten in unterschiedlichen Winkeln zueinander ausgerichtet waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie embryonale Herzen richtig ausrichten und kryoschneiden sowie Immunfärbungen, konfokale Mikroskopie und Bildanalysen durchführen, um die MyFi- und Kardiomyozytenreifung während der Entwicklung des Mausherzens zu beurteilen. Zugeben.