Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Konzentrationen vieler Proteine zwischen Proben mittels Massenspektrometrie mit Hilfe von Ready-Proteomics zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Protein aus jeder Probe verdaut wird, um Peptidmischungen zu erzeugen. Als nächstes werden die beiden Proben gemischt und die Peptide in der gemischten Probe fraktioniert und entsalzt.

Anschließend wird die gemischte Probe mittels Massenspektrometrie analysiert. Schließlich werden die Peptide durch den Vergleich der beiden Spektren der MS mit einer Zielköderdatenbank aller potenziellen Peptide in den Proben identifiziert und die relative Häufigkeit von Peptiden zwischen den Proben quantifiziert. Letztendlich ermöglicht die fertige Proteomik die Quantifizierung der relativen Häufigkeit vieler Proteine zwischen komplexen Proben.

Der Hauptvorteil der reduktiven Demethylierung gegenüber anderen Methoden zur Markierung stabiler Isotope wie iLite besteht darin, dass ready eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode ist, die keine spezielle Trois oder ein synthetisches Medium erfordert, was bedeutet, dass sie auf nahezu jede Art von Probe angewendet werden kann. Zu Beginn bereiten Sie ein Milligramm zelluläres Protein und 500 Mikroliter vor, indem Sie die Zellen mit Ultraschall oder einer französischen Presse dazu bringen, die Proteine auszufällen. Fügen Sie ein Volumen Trichlorsäure zu vier Volumen Protein hinzu und kühlen Sie es 10 Minuten lang auf Eis.

Zentrifugieren Sie bei 12.000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie dann einen Milliliter eiskaltes Aceton zur Resus. Suspendieren Sie das Pellet, bevor Sie es ein zweites Mal drehen.

Nach dem Aspirieren des Snats trocknen Sie das Pellet in einem 56 Grad Celsius heißen Block, um die Proteine zu denaturieren und die Farbstoffsulfidbindungen zu reduzieren. Verwenden Sie 500 Mikroliter Denaturierungs- und Reduktionspuffer zur Wiederverwendung. Resuspendieren Sie die Proteine auf etwa zwei Milligramm pro Milliliter.

Inkubieren Sie die Proteine 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius, gefolgt von 10 Minuten bei Raumtemperatur. Neben alkylatfreien Sulfidgruppen 25 Mikroliter frisch zubereitetes 0,3 molares IDO-Acetamid in Wasser auf 500 Mikroliter Protein geben und 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 10 Mikrolitern drei millimolaren DTT gestillt.

Lagern Sie die alkylierten Proteine bei minus 80 Grad Celsius, um die alkylierten Proteine nach der TCA-Fällung zu verdauen, verwenden Sie einen molaren Harnstoff in 50 Millimolar heis pH 8,2, um das Protein zu resuspendieren. Bereiten Sie eine Stammlösung aus Lysol, Endoproteinase oder LyC in Wasser in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter vor und fügen Sie das Enzym dem verdauten Protein in einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter hinzu. Die Proben werden sechs Stunden lang oder über Nacht bei Raumtemperatur belassen. 20 Mikrogramm Trypsin in Sequenzierqualität in 40 Mikrolitern 50 Millimolessigsäure suspendieren und fünf Mikroliter zur Lyceverdauungsreaktion hinzufügen.

Inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius zu den alkylierten Proteinen. Geben Sie Trifluoressigsäure oder TFA in eine Endkonzentration von 0,5 % ein. Befestigen Sie eine C 18-Säule an einem Extraktionskrümmer. Verwenden Sie dann sechs Milliliter Acetonitril oder ein CN, um die Säule zu befeuchten.

Verwenden Sie anschließend bei der höchstmöglichen Flussrate sechs Milliliter 80 %a CN 0,1 % TFA, um die Säule zu waschen, bevor Sie sechs Milliliter 0,1 % TFA verwenden, um die Säule auszugleichen, den Vakuumdruck zu stoppen und 500 Mikrogramm Peptide mit einer Flussrate von etwa einem Milliliter pro Minute auf die Säule zu laden. Sobald die Peptide an die Säule gebunden sind, starten Sie das Vakuum neu und verwenden Sie mit der höchstmöglichen Flussrate 0,1 % TFA, gefolgt von drei Millilitern Zitronensäurepuffer, um die Säule zu waschen und eine onkologische, reduktive, düstere Methylierung oder Fertigmarkierung durchzuführen. Bereiten Sie unter einer chemischen Haube jeweils 12 Milliliter leichte und schwere Fertigpuffer Tom Methylate peptidfrei vor.

Ein Mittel: Geben Sie 10 Milliliter entweder leichten oder schweren Fertigpuffer mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute in die Säule. Nach dem Auftragen eines zweiten 10-Milliliter-Aliquots. Um die Markierung zu gewährleisten, verwenden Sie sechs Milliliter 0,1 % TFA, gefolgt von einem Milliliter 0,5 % Essigsäure.

Um die Säule zu waschen, um die Proteine zu eluieren, stoppen Sie das Vakuum und geben Sie einen Milliliter 40 % auf eine CN 0,5 %Essigsäure mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Fügen Sie dann einen Milliliter 80%a CN 0,5%Essigsäure-Eluierung mit einer Fünf-Milliliter-Spritze hinzu, falls gewünscht. Mischen Sie ein Eins-zu-Eins-Verhältnis von schwer und leicht markierten Peptidproben und quantifizieren Sie durch Massenspektrometrie, um sicherzustellen, dass sowohl die als auch die leichte Markierung wirksam waren. Fraktionieren Sie das Peptidgemisch, indem Sie es zuerst auf eine C 18 HPLC-Säule auftragen.

Nachdem Sie die Säule fünf Minuten lang mit 5 %a CN gewaschen haben, verwenden Sie einen Gradienten von fünf bis 35 % a CN über 60 Minuten, um die Peptide in gleichen Fraktionen zu eluieren. In einer 96-Well-Platte, gefolgt von 90 %A CN für eine Minute. Nach weiteren vier Minuten mit 90 %A KN wird 5 %a KN verwendet, um die Säule wieder ins Gleichgewicht zu bringen.

Kombinieren Sie dann die Fraktionen auf folgende Weise mit der Vakuumzentrifuge. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den kombinierten Fraktionen. Verwenden Sie dann 130 Mikroliter eines molaren Harnstoffs mit 0,5 % TFA zur Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die Peptide aus den folgenden Fraktionen und lagern Sie den Satz von Fraktionen bei minus 20 Grad Celsius, um die Extraktion der resuspendierten Fraktionen durchzuführen, zu stoppen und zu starten. Bereiten Sie Mikrosäulen mit C 18-Tischspitze aus 200 Mikroliter-Pipettenspitzen vor, indem Sie zwei C 18-Scheiben mit einem Innendurchmesser von 1,07 Millimetern zum Verpacken verwenden. Legen Sie die Tischspitzen in Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 130 Mikroliter Methanol hinzu und schleudern Sie.

Fügen Sie dann 130 Mikroliter 80%a CN 0,5% Essigsäure hinzu, bevor Sie erneut schleudern, nachdem Sie 130 Mikroliter 0,1%TFA verwendet haben, um die Spitzen auszugleichen, übertragen Sie die Peptidmischung auf die Spitzen und waschen Sie sie. Zuerst mit 130 Mikrolitern 0,1 % TFA, gefolgt von 40 Mikrolitern 0,1 % TFA. Dann 40 Mikroliter 0,5% Essigsäure, um die Peptide zu eluieren.

Fügen Sie zunächst 20 Mikroliter 40% zu einer CN 0,5%Essigsäure hinzu. Dann 20 Mikroliter 80%a CN 0,5%Essigsäure. Kombinieren Sie die IITs und das Vakuumfiltrat zum Trocknen, um eine Mikrokapillarflüssigkeitschromatographie durchzuführen.

Die Tandem-Massenspektrometrie oder L-C-M-S-M-S beginnt mit der Verwendung von 5 % Ameisensäure, 5 % A CN, um die Proteine auf eine Konzentration von etwa einem Mikrogramm pro Mikroliter zu resuspendieren. Etwa ein Mikrogramm Peptide werden auf einen 100 Mikrometer x 20 Zentimeter großen C 18 aufgetragen. Umkehrphasen-HPLC-Säule und Eluierung unter Verwendung eines Gradienten von sechs bis 22 % eines CN in 0,1 25 %-Ameisensäure bei einer Flussrate von ca. 300 Nanolitern pro Minute, Anwendung über 75 bis 100 Minuten.

Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung und hoher Massengenauigkeit und identifizieren Sie Peptide in der Probe, indem Sie Ms.Ms Spectra-Rohdateien mit einer theoretischen Datenbank mit einem Algorithmus wie SE Quest vergleichen, wobei die hier gezeigten Parameter mit der Datenbank der offenen Leserahmen in der tatsächlichen und umgekehrten Ausrichtung Peptide mit einer Methode wie dem Zielköder auf eine falsche Entdeckungsrate von 1% gefiltert werden. Um die identifizierten Peptide zu quantifizieren, berechnen Sie die Flächen der schweren und leichten Paare von MS one extrahierten Ionenchromatogrammen, und Peptid-Signal-Rausch-Verhältnisse schließen Peptidpaare nur dann ein, wenn ihr durchschnittliches Signal-Rausch-Verhältnis über fünf liegt. Quantifizieren Sie die relative Häufigkeit eines Peptids in den beiden Proben als das Verhältnis von MS-Ein-Peak-Bereichen von schweren und leichten Versionen desselben Peptids, berechnen Sie die relativen Proteinhäufigkeiten als das mediane MS-Ein-Peak-Flächenverhältnis für alle Peptide im Protein, wenn es auf eine Peptid-Falschentdeckungsrate von 1 % gefiltert wird.

Die Effizienz einer Mischung aus c-Phyto-Ferment aus schwer und leicht markierten Kulturen, die 11.194 einzigartige Peptidsequenzen enthalten, betrug 98 %. Unfraktioniertes Vinier-Proteinlysat wurde auf ähnliche Weise analysiert. Die Unterschiede in der Proteinexpression spiegeln reproduzierbar die Verhältnisse wider, in denen die schweren und leichten Proben über einen weiten Bereich von Mischungsverhältnissen gemischt wurden. Insbesondere war die fo-Veränderung von 99% der Proteine kleiner als 1,6 für die eins-zu-eins-gemischten Proben in den Eins-zu-10- und 10-zu-Eins-Proben.

99% der Proteine lagen innerhalb des 3,8-fachen des erwarteten Verhältnisses, was eine Zunahme der Standardabweichung bei größerem Abstand zu einer Eins-zu-Eins-Mischung zeigt. Als die fertige Markierung auf das Clostridium-Phytoferment-Proteom angewendet wurde, wurden mehr als 2000 Proteine quantifiziert, wobei 94 % Proteine in zweifachen Stufen für Replikatkulturen gemessen wurden, die auf Glukoseproteinfaltung wachsen. Die Veränderungen für doppelte Kulturpaare waren ebenfalls stark korreliert.

Zusammengenommen zeigen diese Experimente, dass die Ready-Proteomik eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung von Proteinexpressionsunterschieden zwischen komplexen Proben ist. Da diese Technik auf praktisch jede Art von Probe angewendet werden kann, ebnete sie Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg, Veränderungen der Protenexpression in allen Arten von Proben zu untersuchen, einschließlich neuartiger Mikroben, Fisch- und Säugetierzellen.