Name: Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Erfahren Sie quantitative Proteomik durch reduktive Dimethylierung für die Analyse von Proteinmischungen mittels Massenspektrometrie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Quantifizierung in komplexen Proben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken SP Gygi und GM Church für ihre Hilfe und Anleitung. Diese Arbeit wurde durch einen CNRS-Exzellenzlehrstuhl für ACT unterstützt.

HINWEIS: Diese Methode wurde bereits beschrieben 12. 1. Proteinisolierung Herstellung von 1 mg Zellprotein durch Lysieren von Zellen, vorzugsweise durch physikalische Methoden wie Französisch Presse Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung. Vermeiden Lysozym-vermittelte Zell-Lyse, weil das Enzym Massenspektrometrie Messungen zu verwechseln. 2. TCA-Fällung von Proteinen 1 Volumen Trichloressigsäure (TCA) bis 4 Volumen Protein-und Chill auf Eis für 10 min, um Proteine ​​zu fällen. Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Entfernen des Überstandes. Resuspendieren des Pellets in 1 ml eiskaltem Aceton und Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und das Röhrchen auf der Bank, um das Pellet für 15 Minuten trocknen. Speicher Proteinpellets bei -80 ° C. 3. Proteine ​​denaturieren und die Reduzierung von Disulfidbrücken ReProteine ​​aussetzen, um ~ 2 mg / ml in 500 ul Denaturierung und Reduktion Puffer (entweder 4 M Harnstoff, 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Optional umfassen einen Proteaseinhibitor in Puffer. Proteine, Inkubation 30 min bei 56 ° C, gefolgt von 10 min bei Raumtemperatur. 4. Aklylate freien Sulfhydrylgruppen irreversibel stören Disulfidbindungsbildung Bereiten Sie frischen 0,3 M iodoacetamide in Wasser. ACHTUNG! Iodacetamid ist hochgiftig. Hinzufügen von 25 &amp;mgr; l 0,3 M Iodacetamid (15 mM Endkonzentration) zu 500 ul Protein und Inkubation für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Quench iodoacetamide durch Zugabe von 10 ul 300 mM DTT (5 mM DTT endgültige Konzentration). Speichern alkylierten Proteinen bei -80 ° C. 5. Protein Verdauung TCA-Ausfällung Proteine ​​(wie in Schritt 2 beschrieben) und Resuspendieren in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M Harnstoff. Bereiten Sie eine Stammlösung von Lysyl endoproteinase (Lys-C) in Wasser bei einer Konzentration von 2 ug / ul und mit 5 &amp;mgr; l der Proteinlösung. Inkubieren der Mischung für 16 Stunden bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die endgültige Lys-C-Konzentration 10 ng / &amp;mgr; l, und das Protein-zu-LysC-Verhältnis (w / w) 1/50 bis 1/200 ist. Resuspendieren 20 ug Trypsin sequencing grade in 40 ul 50 mM Essigsäure werden 5 ul (10 ug Trypsin) an die Lys-C-Verdau und Inkubation für 6 h bei 37 ° C. Verwenden die gleiche Proteasekonzentration und Protease-zu-Protein-Verhältnisse für die Lys-C wie Trypsin verwendet. 6. Umkehrphasen-Peptid-Extraktion <ol><li> Anzusäuern Peptide durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (pH ≈ 2). Bringen Sie eine C18-Säule einer Extraktion vielfältig. Verwenden Sie die höchste Durchflussrate für alle Schritte außer Be-und Elution der Peptide. </li><li> Nass Säule mit 6 ml Acetonitril (ACN). Waschen Säule mit 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, dann ins Gleichgewicht mit 6 ml 0,1% TFA. Lassen Sie dasSpalte trocken Schritte laufen. </li><li> Stoppen Vakuumdruck und Last 500 ug von Peptiden auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml / min. Nachdem Peptide auf die Säule gebunden Neustart Vakuum und wäscht mit 6 ml 0,1% TFA, dann mit 3 ml Zitronensäurepuffer (0,09 M Zitronensäure, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5). Hinweis: Höhere Peptid-Mengen können markiert werden, aber die Bindungskapazität C18-Säule sollte mindestens zwei-fach höher als die Menge an Peptidprobenverlust zu vermeiden. </li></ol> 7. On-Spalte der Peptidmarkierung durch reduktive Dimethylierung (Redi Labeling) Führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube als Cyanwasserstoff in geringer Konzentration während des Markierungsprozesses freigesetzt. <ol><li> Bereiten Sie 12 ml &quot;Licht&quot; und &quot;schwer&quot; Redi Puffer Peptid freien Amine methylieren. Licht Redi Puffer besteht aus 0,8% Formaldehyd und 0,12 M Natriumcyanoborhydrid Durchführung Wasserstoffatome in their natürliche Isotopenverteilungen in Zitronensäure-Puffer. Schwere Redi Puffer besteht aus 0,8% deuteriertes Formaldehyd und 0,12 M deuteriertem Natriumcyanoborhydrid in Zitronensäure-Puffer. </li><li> Inkubieren Spalte Peptide durch Zugabe von 10 ml entweder leicht oder schwer Redi Puffer zu den Peptid-enthaltende Spalten am Flussrate von 1 ml / min, und wiederholen Sie die vollständige Kennzeichnung zu gewährleisten. Waschkolonne mit 6 ml 0,1% TFA und dann mit 1 ml 0,5% Essigsäure. </li><li> Stoppen Vakuum und markierte Peptide eluieren zuerst mit 1 ml 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann mit 1 ml 80% ACN, 0,5% Essigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 ml / min. Wenn gewünscht, messen Sie die Markierungseffizienz der einzelnen Proben mittels Massenspektrometrie vor dem Mischen der schweren und leichten Proben (siehe &quot;Repräsentative Ergebnisse&quot;). Mix 1.01 schweren und leichten markiertes Peptid Proben massenspektrometrisch quantifiziert werden. </li></ol> 8. Separate Peptidmischung von Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatographie &lt;/ P&gt; Basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) gereinigt, um die Peptid-Gemisch in mehrere Fraktionen, die unabhängig von LC-MS/MS analysiert werden Proteom-Abdeckung zu erhöhen trennen. <ol><li> Fraktionierung der Peptidmischung auf einer C18-HPLC-Säule durch Anlegen eines Gradienten mit zunehmender ACN-Konzentration in 10 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8). Beginnen mit 5% (v / v) ACN für 5 min, zu erhöhen, um 35% ACN in 60 min, und dann auf 90% ACN in 1 min. Bewahren Sie die 90% ACN für 4 min vor Verringerung der ACN zu 5% wieder ins Gleichgewicht die Spalte für 9 min. Sammeln 96 Fraktionen von gleichem Volumen in einer 96-Well-Platte (A1 bis H12). Überwachung der Fraktionierung unter Verwendung eines UV-Detektors bei 220 nm, während Peptide Elution von der Säule (10-70 min für den hier beschriebenen Bedingungen). </li><li> Kombinieren Fraktionen aus Vertiefungen A1, C1, E1 und G1 (Fraktion A1) aus den Vertiefungen B1, D1, F1 und H1 (Fraktion B1) aus den Vertiefungen A2, C2, E2 und G2 (Fraktion A2) und demgemäß für die restlichen Fraktionen. Entfernen Sie die Zahlungsfähigkeitt mit einer Vakuumzentrifuge. Resuspendieren Peptide von Fraktionen A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 und B12 in 130 ul 1 M urea/0.5% TFA und Reinigung mit StageTips wie in Schritt 9 beschrieben. Shop Fraktionen B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 und bei -20 º C. </li></ol> 9. Purify Peptiden durch Stop and Go Extraction (StageTips) Bereiten C18-StageTip 7 Mikrosäulen durch die Verpackung 200 ul Pipettenspitzen mit zwei C18-Festplatten mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,07 mm. Setzen Bühnen Tipps in Eppendorf-Röhrchen. Verwenden Sie einen Mikro um Tipps mit 130 ul Methanol, dann 130 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure waschen. Ins Gleichgewicht StageTips mit 130 ul 0,1% TFA. Peptidgemisch zu übertragen StageTips und wäscht mit 130 ul 0,1% TFA, dann wurden 40 ul 0,1% TFA, dann 40 &amp;mgr; l 0,5% Essigsäure. Peptide eluieren zuerst mit 20 ul 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann 20 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure. Kombinieren Sie ein Eluatend trockenen durch Vakuumfiltration. 10. Mikrokapillar LC-MS/MS <ol><li> Lösen Peptide in 1-5 ul 5% Ameisensäure, 5% ACN in einer Konzentration von etwa 1 ug / ul. Beheben ~ 1 &amp;mgr; g Peptide auf eine 100 &amp;mgr; m × 20 cm C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit einem Gradienten von 6-22% ACN in 0,125% Ameisensäure über 75 oder 100 min aufgebracht mit einer Flussrate von ca. 300 Nl / min. </li><li> Identifizieren Peptide mit Hilfe eines LTQ Orbitrap Velos 12 oder ähnliche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattform mit einem Massenspektrometer bietet hohe Auflösung und hohe Massengenauigkeit. Betreiben Sie das Massenspektrometer in den datenabhängigen Modus mit einem vollen MS-Scan (Auflösung von 60.000) in der Orbitrap Analysator erworben. Generieren linearen Ionenfalle MS / MS-Spektren für die 20 in der Voll MS-Spektrum erkannt häufigsten Ionen. Einstellen der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) Ziele zu 1 × 10 6 für die volle MS und 2.000 für MS / MS. Stellen Sie maximale Ionenakkumulationszeiten bis 1000 msfür MS und 150 ms für MS / MS. Ausschließen fragmentierten Peptid-Vorläufer-Ionen von der weiteren Auswahl von MS / MS für 20-60 sek. </li></ol> 11. MS / MS-Datenerfassung Peptide zu identifizieren durch Vergleichen MS / MS-Spektren Rohdaten zu einem theoretischen Datenbank mit einem Algorithmus, wie SEQUEST 8 unter Verwendung dieser Parameter (Tabelle 1). Tabelle 1. Peptid Datenbanksuchparameter. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Allgemeine Parameter </td><td> vollständig tryptischen Verdau mit bis zu 2 verpasst Spaltungen </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm Vorläuferionen Toleranz </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 Da Fragmentionentoleranz </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Statische Änderungen </sTrong&gt; </td><td> 57,02146 Da auf Cystein, Carboxyamidomethylierung </td></tr><tr height="19"><td> 28,03130 Da auf Lysin und dem Peptid N-Terminus, Licht Dimethylierung Label </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Dynamische Änderungen </td><td> 15,99491 Da an Methionin, Oxidation </td></tr><tr height="19"><td> Da auf 6,03766 Lysin und dem Peptid N-Terminus, schwere Dimethylierung Label </td></tr></tbody></table><ol><li> Filter Peptide zu einer falschen Erkennungsrate von 1% mit einem Verfahren wie dem Ziel-Decoy-9-Strategie unter Verwendung einer Datenbank von offenen Leserahmen in den tatsächlichen und Orientierungen umgekehrt. </li></ol> 12. Peptid-Quantifizierung Berechnen Sie die Bereiche der schweren und leichten Paare von MS1 extrahiert Ionenchromatogramme (MS1 Peakflächen) und Peptid-Signal-zu-Rauschen (S / N)-Verhältnisse 10. Fügen Peptidpaare nur, wenn ihre durchschnittlichen Signal-noise Verhältnis über fünf. Quantifizierung der relativen Menge eines Peptids in den zwei Proben als das Verhältnis der Peakflächen MS1 ​​von schweren und leichten Varianten des gleichen Peptids (MS1 Peakflächenverhältnis). Berechnen relativer Häufigkeiten Protein als Median MS1 ​​Peakflächenverhältnis für alle Peptide in dem Protein.

<ol><li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li>
<li>Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li>
<li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li>
<li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li>
<li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li>
<li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li>
<li>Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+N%28%CE%B1%29-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. Che...

Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine ​​zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung 15 N 1 und 2 SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT 3, iTRAQ 4, 5 und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion und Verdauung hinzufügen stabilen Isotopen-Tags. Unter diesen Verfahren wird die reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) an Popularität gewinnt als eine preiswerte, reproduzierbare Methode zur Proteinkonzentration Unterschiede in fast jeder Art von Probe zu quantifizieren. REDi Markierung beinhaltet die Umsetzung von Peptiden mit Formaldehyd zu einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, zu bilden,von Cyanoborhydrid. Diese Reaktion dimethylates freien Aminogruppen auf N-Termini und Lysin-Seitenketten und monomethylates N-terminale Prolin. Das hier beschriebene Protokoll methyliert Peptide in Probe 1 mit einem &quot;light&quot;-Label unter Verwendung von Reagenzien mit Wasserstoffatomen in ihrer natürlichen Isotopenverteilung und Probe 2 mit einer &quot;schweren&quot; Etikett mit deuteriertem Formaldehyd und Cyanoborhydrid (Abbildung 1). Jeder dimethylierten Aminogruppe auf einem Peptid zu einer Massendifferenz von 6,0377 Da zwischen leichten und schweren Formen, die verwendet wird, um zwischen den beiden Formen mit einem Massenspektrometer zu unterscheiden. Insbesondere werden relativen Häufigkeiten Peptid als das Verhältnis der MS1 extrahiert Ionenchromatogramm Bereiche (Peakflächenverhältnis MS1) von leichten und schweren Version für jedes Peptid Ionenpaar quantifiziert. Die relative Menge eines Proteins wird als Median MS1 ​​Peakflächenverhältnis aller Peptide in dem Protein errechnet. In diesem Bericht beschreiben wir ein robustes Protokoll für das Verhaltening Redi Markierungsexperimente mit LC-MS/MS, die Umkehrphasen-Peptid-Festphasenextraktion, On-Column-Kennzeichnung redi-, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und Reinigung der Peptidgemische mit StageTips (Abbildung 2) umfasst . Wir diskutieren Vor-und Nachteile der Verwendung von Redi Kennzeichnung für die quantitative Proteomik.

<table><tbody><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>Proteinfällung</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Proteinfällung</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Denaturierung, Proteinreduktion</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Denaturierung, Proteinreduktion</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>Denaturierung, Reduktion, Alkylatprotein</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Complete Mini Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>Denaturierung, Reduzierung des Proteins</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>Alkylatprotein</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>Resuspendierung, Extrakt, Markierung Protein</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Protein resuspendieren</td></tr><tr><td>Lysyl-Endoprotease</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>Proteinaufschluss</td></tr><tr><td>Trypsin in Sequenzierungsqualität</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Proteinaufschluss</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Proteinaufschluss</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Umkehrphasen-Peptidextraktion</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 Kartuschen</td><td>Wasser</td><td>WAT054960</td><td>Umkehrphasen-Peptidextraktion</td></tr><tr><td>Extraktionsverteiler</td><td>Wasser</td><td>WAT200609</td><td>Umkehrphasen-Peptidextraktion</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>verschiedene</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" Licht" Peptidmarkierung</td></tr><tr><td>Cyanoborohydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" Licht" Peptidmarkierung</td></tr><tr><td>Deuteriertes Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" schwer" Peptidmarkierung</td></tr><tr><td>Natriumcyanoborodeuterid</td><td>CDN-Isotope</td><td>D-1797</td><td>" schwer" Peptidmarkierung</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>Peptidmarkierung</td></tr><tr><td>C18-HPLC-Säule (4,6 x 250 mm, 5 & Mikro; m Partikelgröße)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>basische pH-Umkehrphasenchromatographie</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>diverse</td></tr><tr><td>C18 Empore Scheiben</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>STAGE-Tipps</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE Spitzen</td></tr></tbody></table>

quantitative proteomics mit reduktive dimethylierung stabile isotope labeling

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.

Wir untersuchten die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae und Clostridium phytofermentans Ganzzelllysaten. Wir haben zuerst quantifiziert die redi Markierungseffizienz aus einer Mischung von C phytofermentans Proteinlysate aus Cellulose (schwere beschriftet, H) und Glucose (Licht-Label, L) Kulturen. Wenn ein Peptid False Discovery Rate 1% gefiltert, enthielt diese Probe 11.194 einzigartige Peptidsequenzen mit einer Redi Markierungsef...

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentrationen zahlreicher Proteine zwischen Proben mittels Massenspektrometrie unter Verwendung der fertigen Proteomik zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Protein aus jeder Probe verdaut wird, um Peptidgemische zu erzeugen. Anschließend werden die beiden Proben gemischt, und die Peptide in der gemischten Probe werden fraktioniert und entsalzt.Anschließend wird die gemischte Probe mittels Massenspektrometrie analysiert. Schließlich werden die Peptide identifiziert, indem die beiden MS-Spektren mit einer Target-Decoy-Datenbank aller potenziellen Peptide in den Proben verglichen werden, und die relative Häufigkeit der Peptide zwischen den Proben wird quantifiziert. Letztendlich ermöglicht ready Proteomics die Quantifizierung der relativen Häufigkeit vieler Proteine zwischen komplexen Proben.Die Hauptvorteile der reduktiven Demethylierung gegenüber anderen Methoden zur stabilisotopenmarkierten Markierung, wie beispielsweise iLite, bestehen darin, dass ready eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode ist, die keine spezifischen trois oder ein synthetisches Medium erfordert und daher nahezu auf jede Pr

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Reaktive Sauerstoffspezies Niveau angehoben wird, wenn Zellen begegnen Stressbedingungen. Hier zeigen wir das Beispiel von 3'-3 'Diaminobenzidin-Färbung sowie cysTMT Kennzeichnung und Massenspektrometrie, um die Redox-Proteom im...

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Es werden zwei Verfahren zur Zuordnung der α- und ε-Dimethylamin-Kernspinresonanzsignale eines reduktiv 13C-methylierten N-terminalen Lysins beschrieben. Eine Methode nutzt die pH-induzierte Selektivität der reduktiven Methylierungsreaktion, und die andere verwendet Aminopeptidase, um das N-terminale Lysin selektiv zu entfernen.

Methoden, um die NMR-Resonanzen von Identify<sup&gt; 13</sup&gt; C-Dimethyl-N-terminalen Amins auf reduktiv methylierte Proteine

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Dieser Artikel beschreibt eine Probenvorbereitungsmethode, die auf Wärmeinaktivierung basiert, um endogene Peptide zu erhalten und den Abbau post mortem zu vermeiden, gefolgt von einer relativen Quantifizierung mittels Isotopenmarkierung plus LC-MS.

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Erfahren Sie quantitative Proteomik durch reduktive Dimethylierung für die Analyse von Proteinmischungen mittels Massenspektrometrie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Quantifizierung in komplexen Proben.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Weitere Videos entdecken