Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentrationen zahlreicher Proteine zwischen Proben mittels Massenspektrometrie unter Verwendung der fertigen Proteomik zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Protein aus jeder Probe verdaut wird, um Peptidgemische zu erzeugen. Anschließend werden die beiden Proben gemischt, und die Peptide in der gemischten Probe werden fraktioniert und entsalzt.

Anschließend wird die gemischte Probe mittels Massenspektrometrie analysiert. Schließlich werden die Peptide identifiziert, indem die beiden MS-Spektren mit einer Target-Decoy-Datenbank aller potenziellen Peptide in den Proben verglichen werden, und die relative Häufigkeit der Peptide zwischen den Proben wird quantifiziert. Letztendlich ermöglicht ready Proteomics die Quantifizierung der relativen Häufigkeit vieler Proteine zwischen komplexen Proben.

Die Hauptvorteile der reduktiven Demethylierung gegenüber anderen Methoden zur stabilisotopenmarkierten Markierung, wie beispielsweise iLite, bestehen darin, dass ready eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode ist, die keine spezifischen trois oder ein synthetisches Medium erfordert und daher nahezu auf jede Probentyp angewendet werden kann. Zunächst bereiten Sie ein Milligramm zelluläres Protein und 500 Mikroliter vor, indem Sie die Zellen durch Ultraschallbehandlung oder mit einer French-Presse lysieren, um die Proteine auszufällen. Geben Sie ein Volumen Trichloressigsäure zu vier Volumina Protein hinzu und kühlen Sie 10 Minuten auf Eis.

Zentrifugieren Sie bei 12.000 Gs fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Anschließend den Pellet mit einem Milliliter eiskaltem Aceton resuspendieren und erneut zentrifugieren.

Nachdem das Überstand entfernt wurde, trocknen Sie das Pellet in einem Wärmeprobeblock bei 56 Grad Celsius, um die Proteine zu denaturieren und die Farbstoff-Disulfidbindungen zu reduzieren. Verwenden Sie 500 Mikroliter Denaturierungs- und Reduktionspuffer, um das Pellet erneut aufzusuchen. Resuspendieren Sie die Proteine auf etwa zwei Milligramm pro Milliliter.

Die Proteine 30 Minuten bei 56 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um freie Sulfidgruppen zu alkylieren, 25 Mikroliter frisch zubereitete 0,3 molare IDO-Acetamid-Lösung in Wasser zu 500 Mikrolitern Protein geben und 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Reaktion durch Zugabe von 10 Mikrolitern dreimillimolarer DTT stoppen.

Lagern Sie die alkylierten Proteine bei minus 80 Grad Celsius. Um die alkylierten Proteine nach der TCA-Fällung zu verdauen, verwenden Sie einmolares Harnstoff in 50 Millimolar HEPES, pH 8,2, um das Protein zu resuspendieren. Bereiten Sie eine Stammlösung von Lys-C, Endoproteinase oder Ly-C in Wasser mit einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter vor und geben Sie das Enzym zur verdauten Proteinlösung in einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter hinzu. Die Proben werden sechs Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Suspendieren Sie 20 Mikrogramm Trypsin der Sequenzierungsqualität in 40 Mikrolitern 50 Millimolar Essigsäure und geben Sie fünf Mikroliter zu der Ly-C-Verdauungsreaktion hinzu.

Inkubieren Sie sechs Stunden bei 37 Grad Celsius mit den alkylierten Proteinen. Geben Sie Trifluoressigsäure oder TFA bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu. Befestigen Sie eine C 18-Säule an einer Extraktionsvorrichtung. Befeuchten Sie die Säule anschließend mit sechs Milliliter Acetonitril oder ACN.

Als Nächstes spülen Sie die Säule mit der höchstmöglichen Fließgeschwindigkeit mit sechs Milliliter 80 % a CN 0,1 % TFA, gefolgt von sechs Milliliter 0,1 % TFA zur Gleichilibration der Säule. Stoppen Sie den Vakuumdruck und geben Sie 500 Mikrogramm Peptide mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Minute auf die Säule. Sobald die Peptide an die Säule gebunden sind, setzen Sie das Vakuum erneut ein und spülen Sie die Säule mit der höchstmöglichen Fließgeschwindigkeit zuerst mit 0,1 % TFA und anschließend mit drei Milliliter Zitronensäurepuffer, um die onko, reduktive, dimethylierte oder Ready-Markierung durchzuführen. Unter einer chemischen Abzugshaube bereiten Sie jeweils 12 Milliliter des leichten und des schweren Ready-Puffers Tom Methylierung von peptidfreiem Material vor.

Geben Sie 10 Milliliter eines leichten oder schweren vorgefertigten Puffers zur Säule mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute hinzu. Nach der Applikation eines zweiten 10-Milliliter-Aliquots. Um die Markierung sicherzustellen, verwenden Sie sechs Milliliter 0,1 % TFA, gefolgt von einem Milliliter 0,5 %iger Essigsäure.

Um die Säule zu waschen und die Proteine zu eluieren, stoppen Sie das Vakuum und geben Sie ein Milliliter 40 %iger CN 0,5 %iger Essigsäure mit einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute auf. Anschließend geben Sie ein Milliliter 80 %iger CN 0,5 %iger Essigsäure hinzu und eluieren gegebenenfalls mit einer fünf Milliliter umfassenden Spritze. Mischen Sie die schweren und leichten markierten Peptidproben im Verhältnis 1:1 und quantifizieren Sie mittels Massenspektrometrie, um sicherzustellen, dass sowohl die schwere als auch die leichte Markierung wirksam war. Fraktionieren Sie das Peptidgemisch, indem Sie es zunächst auf eine C18-HPLC-Säule auftragen.

Danach die Säule fünf Minuten lang mit 5 % A CN waschen, gefolgt von einer Gradientelution von fünf auf 35 % A CN über 60 Minuten, um die Peptide in gleichen Fraktionen zu eluieren. In einer 96-Loch-Platte anschließend 90 % A CN für eine Minute. Nach weiteren vier Minuten mit 90 % A CN die Säule mit 5 % A CN wieder in das Ausgangsgleichgewicht bringen.

Anschließend Fraktionen auf folgende Weise mit dem Vakuumzentrifugiergerät vereinen. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den vereinigten Fraktionen. Verwenden Sie dann 130 Mikroliter einer einmolarigen Harnstofflösung mit 0,5 % TFA zum erneuten Einwägen.

Suspendieren Sie die Peptide aus den folgenden Fraktionen und lagern Sie den Satz der Fraktionen bei minus 20 Grad Celsius, um eine Stop-and-Go-Extraktion an den resuspendierten Fraktionen durchzuführen. Bereiten Sie C18-Stage-Tip-Mikrosäulen aus 200-Mikroliter-Pipettenspitzen vor, indem Sie zwei C18-Scheiben mit einem Innendurchmesser von 1,07 Millimeter zum Befüllen verwenden. Setzen Sie die Stage-Tips in Mikrozentrifugenröhrchen ein und geben Sie 130 Mikroliter Methanol hinzu und zentrifugieren Sie.

Dann 130 µL 80 % ACN mit 0,5 % Essigsäure hinzufügen, nachdem zuvor die Spitzen mit 130 µL 0,1 % TFA equilibriert wurden; die Peptidmischung auf die Spitzen übertragen und waschen, zunächst mit 130 µL 0,1 % TFA, gefolgt von 40 µL 0,1 % TFA. Anschließend 40 µL 0,5 % Essigsäure zur Elution der Peptide verwenden.

Fügen Sie zunächst 20 µL 40 % zu einer 0,5 %igen Essigsäure hinzu. Danach 20 µL 80 % zu einer 0,5 %igen Essigsäure. Kombinieren Sie die IITs und das Vakuumfiltrat, um bis zur Trockne einzudampfen, und führen Sie die Mikrokappillar-Flüssigkeitschromatographie durch.

Die Tandem-Massenspektrometrie oder LC-MS-MS beginnt damit, die Proteine mit 5 % Ameisensäure und 5 % ACN in einer Konzentration von etwa einem Mikrogramm pro Mikroliter zu resuspendieren. Etwa ein Mikrogramm Peptide wird auf eine 100 Mikrometer mal 20 Zentimeter große C18-Reverse-Phase-HPLC-Säule aufgegeben und mit einem 6 bis 22 %igen Gradienten von ACN in 0,125 % Ameisensäure bei einer Flussrate von etwa 300 Nanolitern pro Minute über 75 bis 100 Minuten eluiert.

Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung und hoher Massengenauigkeit, und identifizieren Sie Peptide in der Probe, indem Sie die rohen MS/MS-Spektrendateien mit einer theoretischen Datenbank anhand eines Algorithmus wie SE quest vergleichen, wobei die hier gezeigten Parameter und die Datenbank offener Leseraster in direkter und reverser Orientierung verwendet werden. Filtern Sie die Peptide auf eine Falsch-Entdeckungsrate von 1 % mithilfe einer Methode wie Target-Decoy. Zur Quantifizierung der identifizierten Peptide berechnen Sie die Flächen der schweren und leichten Paare aus MS1-Extraktions-Ionen-Chromatogrammen und die Signal-Rausch-Verhältnisse der Peptide; berücksichtigen Sie nur Peptidpaare, deren durchschnittliches Signal-Rausch-Verhältnis über fünf liegt. Quantifizieren Sie die relative Häufigkeit eines Peptids in den beiden Proben als Verhältnis der MS1-Spitzenflächen der schweren und leichten Versionen desselben Peptids. Berechnen Sie die relativen Proteinmengen als Median des MS1-Spitzenflächenverhältnisses aller Peptide des Proteins, nachdem diese auf eine Falsch-Entdeckungsrate von 1 % für Peptide gefiltert wurden.

Die Fertigmarkierungseffizienz einer Mischung aus c-Phyto-Ferment aus schweren und leicht markierten Kulturen, die 11.194 eindeutige Peptidsequenzen enthielt, betrug 98 %. Unfraktionierte Visier-Proteinglysate wurden auf ähnliche Weise analysiert. Unterschiede in der Proteinexpression spiegelten reproduzierbar die Verhältnisse wider, in denen die schweren und leichten Proben über einen weiten Bereich von Mischungsverhältnissen hinweg gemischt wurden. Insbesondere war die Faktoränderung von 99 % der Proteine für die 1:1-gemischten Proben in den 1:10- und 10:1-Proben kleiner als 1,6.

99 % der Proteine lagen innerhalb eines Faktors von 3,8 bezüglich des erwarteten Verhältnisses, wobei eine Zunahme der Standardabweichung bei größerer Entfernung von einer Eins-zu-eins-Mischung zu beobachten war. Als die schnelle Markierung auf das Proteom von Clostridium phytofermentans angewendet wurde, konnten mehr als 2000 Proteine quantifiziert werden, wobei 94 % der Proteine innerhalb eines zweifachen Bereichs für replizierte Kulturen gemessen wurden, die auf Glukoseprotein-Faltung wuchsen. Die Veränderungen für doppelte Kulturpaare waren ebenfalls stark korreliert.

Die Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass Ready-Proteomik eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung von Proteinexpressionsunterschieden zwischen komplexen Proben darstellt. Da dieses Verfahren praktisch auf jede Art von Probe angewendet werden kann, hat es Forschern im Bereich der Proteomik den Weg geebnet, Expressionsänderungen des Proteoms in allen möglichen Proben zu untersuchen, einschließlich neuartiger Mikroben, Fisch- und Säugetierzellen.