Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Das übergeordnete Ziel dieser verbesserten Multiplex-Methode besteht darin, die Anzahl der gleichzeitig analysierbaren Proteinproben zu erhöhen und gleichzeitig die Probenfehler sowie die Messdauer am Gerät zu verringern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Alterung, neurodegenerative Erkrankungen, andere altersbedingte Erkrankungen und Krebs zu beantworten, die mit Pathogenese, Krankheitsverlauf, Diagnose, Prognose und therapeutischen Zielstrukturen zusammenhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ein umfassender Überblick über Proteinveränderungen unter zahlreichen Bedingungen erstellt werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Alzheimer-Krankheit im Mausmodell ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf Gewebeproben von Patienten mit Alzheimer oder einer Reihe anderer Erkrankungen anwenden. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, werden sie im Allgemeinen als herausfordernd empfinden, da mehrere Proben innerhalb eines kurzen Zeitraums gleichzeitig bearbeitet werden müssen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir erkannten, dass Acetylierung mit isobaren Markierungen für die Protein-Nitrierung kombiniert werden könnte, was uns motivierte, die Technik global für alle Peptide funktionstüchtig zu machen.

Diese Studie wird Gehirn-, Herz- und Lebergewebe aus einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit sowie Wildtyp-Kontrollen analysieren. Überführen Sie 60 bis 90 Milligramm jeder Gewebeprobe in ein Zerstörungsgefäß und geben Sie 500 Mikroliter PBS mit acht molar Harnstoff hinzu. Homogenisieren Sie die Proben mithilfe eines mechanischen Homogenisators.

Entfernen Sie das Gewebelysat aus dem Zerstörungsrohr und überführen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Zerstörungsrohr mit 100 bis 500 Mikrolitern PBS mit acht Mol Harnstoff und vereinigen Sie die Spüllösung mit dem Gewebelysat. Zentrifugieren Sie das Gewebelysat 15 Minuten lang.

Sammlen Sie den Überstand von jeder Probe. Nach Durchführung des BCA-Assays zur Bestimmung der Protein­konzentration geben Sie 100 Mikrogramm Protein aus jeder Probe in separat beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie Dithiothreitol zu jeder Probe hinzu.

Und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Geben Sie Iodoacetamid, IAM, zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln zwei Stunden auf Eis. Fügen Sie anschließend L-Cystein zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach 30 Minuten Tris-Puffer mit Calciumchlorid hinzufügen, um Harnstoff auf eine Endkonzentration von zwei Molaren zu verdünnen. L1-Tosilimidophenylethylcholermethylketon-behandelte Trypsin zu jeder Probe hinzufügen und 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Am folgenden Tag stoppen Sie die Proteolyse, indem Sie die Probe in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis weitere Verarbeitungsschritte erfolgen. Vor der Dimethylierungs-Markierung werden die Peptidproben gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren entzogenet und durch Vakuumzentrifugation getrocknet. Um mit der Dimethylierungs-Markierung zu beginnen, resuspendieren Sie die Peptide in 1 %iger Essigsäure, gelöst in HPLC- oder nanopurenem Wasser.

Entnehmen Sie eine 50 µg-Portion jeder Probe in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie den Rest der rekonstituierten Peptide bei -80 °C für zukünftige Experimente. In den im Folgenden demonstrierten Schritten ist es entscheidend, die Reagenzien schnell zuzugeben, damit die chemisch bedingten Reaktionen für alle Proben über die gleiche Zeitspanne ablaufen.

Fügen Sie acht Mikroliter einer 60 Millimolar-Formaldehydlösung zu den Proben für die Markierung mit leichter Dimethylierung hinzu. Fügen Sie acht Mikroliter einer 60 Millimolar-Lösung aus Kohlenstoff-13 und Deuterium-markiertem Formaldehyd zu den Proben für die Markierung mit schwerer Dimethylierung hinzu. Fügen Sie acht Mikroliter einer 24 Millimolar-Natriumcyanoborhydrid-Lösung zu den mit leichter Dimethylierung markierten Proben hinzu.

Fügen Sie acht Mikroliter 24 Millimolar Natriumcyanoborhydrid zu den Proben hinzu, die mit schwerer Dimethylierung markiert sind. Vortexen Sie die Proben und schütteln Sie sie anschließend etwa 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Röhrenschüttler bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Reaktionen durch Zugabe von 16 Mikrolitern 1 % Ammoniak für fünf Minuten.

Reazidifizieren Sie die Reaktionsgemische durch Zugabe von acht Mikrolitern 5 %iger Ameisensäure. Kombinieren Sie die leicht und schwer dimethylierten Peptide, um insgesamt sechs Proben zu erhalten. Führen Sie die Desalzierung der Proben wie im Textprotokoll beschrieben durch.

Und trocknen Sie die Proben durch Vakuumzentrifugation. Um die isobare Markierung der dimethylierten Proben zu beginnen, resuspendieren Sie zunächst 100 Mikrogramm dimethylierter Peptide in Triethylammoniumbicarbonat oder TEAB-Puffer. Bereiten Sie danach die isobaren Reagenzien gemäß der Herstelleranleitung des Isobar-Markierungs-Kits vor.

Geben Sie das entsprechende Volumen, in diesem Fall 41 µL des gelösten isobaren Markierungsreagenzes, zu jeder der Peptidproben hinzu und wirbeln Sie etwa 10 Sekunden lang. Schütteln Sie die Proben etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Mikrozentrifugenröhrchenschüttler. Um die Reaktionen zu stoppen, geben Sie 8 µL Hydroxylamin zu jeder Probe hinzu.

Anschießend die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die sechs markierten Proben zu einer einzigen Mischung vereinigen und entsalzen. Die Peptide für die Flüssigkeitschromatographie vorbereiten, indem die Peptide in massenspektrometriegereinigtem Wasser mit 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert werden.

Fügen Sie die rekonstituierten Peptide einer Mikrozentrifugenröhre hinzu, die einen 0,65-Mikrometer-Filter enthält. Zentrifugieren Sie anschließend bei 12.000 × g für eine Minute. Entfernen und verwerfen Sie den Filter.

Überführen Sie die gefilterten Peptide in eine Probenvials für den Autosampler. Injizieren Sie sechs Mikroliter jeder starken Kationenaustausch-Fraktion auf eine Trap-Säule. Packen Sie diese mit zwei Zentimetern Material mit Kohlenstoff-18-Beschichtung.

Führen Sie die analytischen Trenn- und Datenaufnahmemethoden des Massenspektrometers durch. Es wurde eine 12-plex-cPilot-Analyse von Gehirn-, Herz- und Lebergeweben aus einem Alzheimer-Mausmodell sowie von Wildtyp-Kontrollen durchgeführt. Die Vorläuferdaten zeigten leicht und schwer dimethylierte Peptide, die durch die Peaks bei m/z 643,854 und 647,875 repräsentiert wurden.

Diese Peptide wurden unabhängig voneinander ausgewählt, isoliert und mittels kollisionsinduzierter Dissoziation fragmentiert, um diese Spektren zu erzeugen. Die Suchergebnisse zeigten, dass die Peaks zu einem Peptid des Proteins Phosphoglyceratkinase 1 gehörten. Diese Peaks wurden anschließend weiter isoliert, um mittels Tandem-Massenspektrometrie mit hochenergetischer kollisioneller Dissoziation analysiert zu werden, und die Reporterionen wurden wie dargestellt beobachtet.

Beide Sätze von dreistufigen Massenspektrometriespektren sind erforderlich, um Informationen über die 12 Proben zu erhalten. In diesem Beispiel sind die Ionenverhältnisse von Alzheimer-Krankheit zu Wildtyp-Kontrolle über die beiden biologischen Wiederholungen hinweg für Gehirn-, Leber- und Herzgewebe ähnlich. Die Fold-Change-Werte für jeden Vergleich deuten darauf hin, dass die Spiegel der Phosphoglyceratkinase 1 im Gehirn und Herz bei Mäusen mit Alzheimer-Krankheit höher, in der Leber jedoch niedriger sind.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa fünf Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig mit der Probenbehandlung umzugehen. In dieses Verfahren können Trennmethoden wie die starke Kationenaustauschchromatographie oder die Fraktionierung bei hohem pH-Wert integriert werden, um die tägliche Tiefe und Abdeckung zu erhöhen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Probenvielfalt mithilfe von C-Pilot verbessert werden kann.