Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Das übergeordnete Ziel dieser verbesserten Multiplex-Methode ist es, die Anzahl der Proteinproben zu erhöhen, die gleichzeitig analysiert werden können, und gleichzeitig den Probenfehler und die Instrumentenzeit zu verringern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Altern, neurodegenerative Erkrankungen, andere altersbedingte Krankheiten und Krebs zu beantworten, die mit Pathogenese, Progression, Diagnose, Prognose und therapeutischen Zielen zusammenhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine umfassende Momentaufnahme der Proteinveränderungen unter vielen Bedingungen erstellt werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Alzheimer-Krankheit im Mausmodell geben kann, kann sie auch auf Gewebeproben von Patienten mit Alzheimer oder einer Reihe anderer Erkrankungen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, eine Herausforderung darstellen, da mehrere Proben gleichzeitig in einem kurzen Zeitrahmen bearbeitet werden müssen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erkannten, dass die Acetylierung mit isoberischem Tagging für die Proteinnitrierung kombiniert werden kann, was uns dazu motivierte, die Technik weltweit für alle Peptide funktionieren zu lassen.

In dieser Studie werden Gehirn-, Herz- und Lebergewebe aus einem Alzheimer-Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen analysiert. Übertragen Sie 60 bis 90 Milligramm jeder Gewebeprobe in ein Lyseröhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter PBS mit acht molaren Harnstoff hinzu. Homogenisieren Sie die Proben mit einem mechanischen Homogenisator.

Entfernen Sie das Gewebehomogenat aus dem Lyseröhrchen und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Lyseröhrchen mit 100 bis 500 Mikrolitern PBS mit acht molaren Harnstoffen und mischen Sie die Spüllösung mit dem Gewebehomogenat. Zentrifugieren Sie das Gewebehomogenat 15 Minuten lang.

Greifen Sie den Überstand von jeder Probe ein. Nach der Durchführung des BCA-Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration geben Sie 100 Mikrogramm Protein aus jeder Probe in einzeln markierte Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie Dithiothreitol zu jeder Probe hinzu.

Und zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie Iodacetamid, IAM, zu jeder Probe und inkubieren Sie zwei Stunden lang im Dunkeln auf Eis. Fügen Sie dann jeder Probe L-Cystein hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach 30 Minuten Tris-Puffer mit Calciumchlorid hinzufügen, um Harnstoff auf eine Endkonzentration von zwei molaren zu verdünnen. Geben Sie L1-Tosilimitotophenylethylcholer, Methylketon, behandeltes Trypsin zu jeder Probe. Und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Am folgenden Tag wird der Proteinaufschluss durch Schockfrosten der Probe in flüssigem Stickstoff abgekühlt und bis zur weiteren Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Vor der Dimethylierungsmarkierung werden die Peptidproben, wie im Textprotokoll beschrieben, entsalzt und durch Vakuumzentrifugation getrocknet. Um mit dem Dimethylierungsmarkierungsverfahren zu beginnen, rekonstituieren Sie die Peptide in 1%Essigsäure, gelöst in HPLC oder nanoreinem Wasser.

Nehmen Sie einen 50-Mikrogramm-Teil jeder Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie den Rest der rekonstituierten Peptide bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Experimente. In den Schritten, die als nächstes demonstriert werden, ist es entscheidend, Reagenzien schnell hinzuzufügen, damit die chemischen Reaktionen für alle Proben gleich lange ablaufen.

Geben Sie acht Mikroliter einer 60 millimolaren Formaldehydlösung zu den Proben, um sie mit leichter Dimethylierung zu markieren. Geben Sie acht Mikroliter einer 60 Millimolar Kohlenstoff-13-Deuterium-markierten Formaldehydlösung zu den Proben, um sie mit starker Dimethylierung zu markieren. Geben Sie acht Mikroliter 24 millimolare Natriumcyanoborohydrid zu den Proben, die mit leichter Dimethylierung markiert sind.

Acht Mikroliter 24 millimolare Natriumcyanoboroduderide werden zu den Proben gegeben, die mit starker Dimethylierung markiert sind. Die Proben werden vortexen und dann auf einem Röhrchenschüttler etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Quaktieren Sie die Reaktionen, indem Sie 16 Mikroliter 1%iges Ammoniak für fünf Minuten hinzufügen.

Die Reaktionsgemische durch Zugabe von acht Mikrolitern 5%iger Ameisensäure wieder ansäuern. Kombinieren Sie die leichten und schweren dimethylierten Peptide, um insgesamt sechs Proben zu erzeugen. Führen Sie die Probenentsalzung durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Und trocknen Sie die Proben durch Vakuumzentrifugation. Um die dimethylierten Proben isobar zu markieren, rekonstituieren Sie zunächst 100 Mikrogramm dimethylierte Peptide und Triethylammoniumbicarbonat oder TEAB-Puffer. Bereiten Sie anschließend isobare Reagenzien gemäß dem Herstellerprotokoll des isobaren Markierungskits vor.

Geben Sie das entsprechende Volumen, in diesem Fall 41 Mikroliter des solubilisierten isobaren Markierungsreagenzes zu jeder der Peptidproben, und wirbeln Sie es etwa 10 Sekunden lang. Schütteln Sie die Proben auf einem Mikrozentrifugenröhrchenschüttler etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Um die Reaktionen zu löschen, fügen Sie jeder Probe 8 Mikroliter Hydroxylamin hinzu.

Und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fassen Sie die sechs markierten Proben zu einer einzigen Mischung zusammen und entsalzen Sie. Bereiten Sie die Peptide für die flüssige Chromatogrophie vor, indem Sie die Peptide in massenspektrometrischem Wasser mit 0,1 % Ameisensäure rekonstituieren.

Geben Sie rekonstituierte Peptide in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem 0,65-Mikrometer-Filter. Und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 12.000 g g. Entfernen Sie den Filter und entsorgen Sie ihn.

Übertragen Sie die gefilterten Peptide in ein Autosampler-Fläschchen. Injizieren Sie sechs Mikroliter jeder Probe der starken Kationenaustauschfraktion auf eine Fallensäule. Packen Sie bis zu zwei Zentimeter mit Carbon 18-Material.

Führen Sie die Methoden des analytischen Separations- und Datenerfassungs-Massenspektrometers durch. Es wurde eine 12-Plex-cPilot-Analyse von Gehirn-, Herz- und Lebergewebe aus einem Alzheimer-Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen durchgeführt. Die Vorläuferdaten zeigten leichte und schwere dimethylierte Peptide, die durch die Peaks bei m/z 643,854 und 647,875 repräsentiert werden.

Diese Peptide wurden ausgewählt, unabhängig voneinander isoliert und mit kollusionsinduzierter Dissoziation fragmentiert, um diese Spektren zu erzeugen. Die Suchergebnisse deuteten darauf hin, dass die Peaks zu einem Peptid des Proteins Phosphoglyceratkinase gehörten. Diese Peaks wurden für die hochenergetische kollusionale Dissoziations-Tandem-Massenspektrometrie weiter isoliert und die Reporterionen wie gezeigt beobachtet.

Beide Sätze von dreistufigen Massenspektrometrie-Spektren sind notwendig, um Informationen über die 12 Proben zu erhalten. In diesem Beispiel ist das Ionenverhältnis zwischen Alzheimer und Wildtyp bei den beiden biologischen Replikaten für Gehirn-, Leber- und Herzgewebe ähnlich. Die Faltungsänderungswerte für jeden Vergleich deuten darauf hin, dass die Phosphoglyerat-Kinase-Spiegel im Gehirn und im Herzen bei Alzheimer-Mäusen höher, in der Leber jedoch niedriger sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig mit der Probenhandhabung zu sein. In dieses Verfahren integriert können Trennmethoden wie starker Kationenaustausch oder Fraktionierung mit hohem pH-Wert durchgeführt werden, um die Tagestiefe und -abdeckung zu erhöhen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Probenmultiplexing mit C-Pilot verbessern können.