Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide
15. Dezember 2014
Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch Exposition gegenüber aerosolisiertem LPS eine konsistente und reproduzierbare Neutrophilie der Atemwege zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst in Kochsalzlösung suspendiertes LPS in einen Vernebler geladen wird, der mit einer Expositionskammer verbunden ist. Als nächstes werden Mäuse dem aerosolisierten LPS ausgesetzt und dann wird bronchoalveoläre Lavage gesammelt und Entzündungszellen in der Lavage werden aufgezählt.
Schließlich wird das Lungengewebe fixiert, formell für die Einbettung und Sektion und immunhistochemische Analyse. Letztendlich können die Gesamt- und Differentialzellzahlen der bronchoalveolären Lavage verwendet werden, um die Rekrutierung von Neutrophilen in die Lunge zu beurteilen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intratrachealen LPS-Verabreichung sind die gleichmäßige Verteilung von aerosolisiertem LPS in der Lunge, die einfache Durchführung und der minimale Schulungsaufwand, der für eine erfolgreiche Anwendung erforderlich ist. Um ein LPS-Aerosol unter Verwendung geeigneter PSA und innerhalb einer belüfteten Haube der Stufe zwei für biologische Gefahren zu erzeugen, beginnen Sie damit, einen roten Einlass in einen Vernebler einzuführen und dann den Vernebler über den von der bereitgestellten Schlauch mit der unter Druck stehenden Raumluft zu verbinden. Hersteller.
Verwenden Sie als Nächstes einen Luftfilter, um den Auslass des Verneblers an einen Massendurchflussmesser anzuschließen, und schließen Sie dann den Massendurchflussmesser an eine Stromversorgung an. Stellen Sie den Luftstrom auf fünf Liter pro Minute ein, halten Sie den Druck bei ein bis zwei bar, entfernen Sie dann den Massendurchflussmesser und trennen Sie den Luftstrom. Als nächstes wird der Auslass des Verneblers an ein 15,9 Millimeter großes Gabelrohr angeschlossen, das mit 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5 Millimeter großen Plexiglaskästen verbunden ist, die mit abnehmbaren Deckeln ausgestattet sind.
Jede Box sollte ein fünf Millimeter großes Loch in der dem Einlass gegenüberliegenden Seite haben, um einen Druckaufbau zu verhindern. Lege nun bis zu fünf Mäuse in jede Box und schließe die Deckel. Öffnen Sie dann den Vernebler.
Füllen Sie den Einsatz mit vier bis acht Millilitern LPS, das nur in Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gelöst ist, und schließen Sie den Einlass wieder an die Luftzufuhr an. Lassen Sie das Aerosol in die geschlossenen Plexiglasboxen strömen, während Sie die Tiere kontinuierlich überwachen und sicherstellen, dass die Luftzufuhr während der Aerosolisierung fest am Einlass des Verneblers befestigt bleibt. Trennen Sie nach 10 Minuten die Luftzufuhr und lassen Sie die Tiere weitere zwei Minuten in den Plexiglasboxen.
Öffnen Sie dann die Deckel. Lassen Sie das Aerosol sich verteilen und bringen Sie die Mäuse am experimentellen Endpunkt in ihre Käfige zurück. Für jedes Tier der Reihe nach wird zunächst mit einer Schere ein einzelner vorderer hinterer Schnitt gemacht, um den Thorax freizulegen. Heben Sie dann den Brustkorb an der vorderen Spitze des Brustbeins an und punktieren Sie das Zwerchfell an der ventralsten Stelle, ohne in das Lungengewebe einzuschneiden.
Öffnen Sie dann den Brustkorb mit zwei Schnitten, die unterhalb des Kiefers in vorder-hinterer Richtung aufeinandertreffen. Sobald der Brustkorb geöffnet ist, ziehen Sie ihn mit einer Pinzette vorsichtig auseinander und schneiden Sie die Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes durch. Heben Sie nun die Luftröhre an und durchtrennen Sie die Bänder, die die Lungenlappen mit der Brusthöhle verbinden.
Ziehen Sie dann die Lunge und die Luftröhre vorsichtig nach oben und weg vom Fett- und Herzgewebe und legen Sie sie auf ein Stück Spritzenpapier. Führen Sie anschließend einen 0,965 Millimeter schweren Polyethylenschlauch in die Luftröhre ein und befestigen Sie ihn mit einem Seidenfaden. Binden Sie den Mehrlappen ebenfalls mit Seidenfaden ab und führen Sie dann eine 23-Gauge-Nadel in den Polyethylenschlauch ein.
Um dann die bronchoalveoläre Lavage zu sammeln, injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze langsam 250 Mikroliter Eis, das als steriles PBS bezeichnet wird, in den einzelnen Lappen, klopfen Sie vorsichtig auf die Lunge und gegen die Oberfläche der Arbeitsbank, ziehen Sie die Flüssigkeit langsam zurück in die Spritze und sammeln Sie sie in einem Röhrchen, nachdem Sie den Vorgang mit 200 Mikrolitern frischem PBS wiederholt haben. Legen Sie die bronchoalveoläre Lavage zur späteren Analyse auf Eis. Um das Lungengewebe für die histologische Analyse zu fixieren, entfernen Sie den Mehrlappen und schnappen Sie ihn ein. Frieren Sie es auf Trockeneis ein.
Lagern Sie den Keulen bei minus 80 Grad Celsius. Um das Gewebe für die histologische Analyse zu fixieren, montieren Sie eine 60-Milliliter-Spritze ohne Kolben auf einen Metallständer und insufflieren Sie den einzelnen Lappen fünf Minuten lang mit Formalin. Trennen Sie dann die Nadel und ziehen Sie am Seidenfaden, um ihn zusammen mit dem Polyethylenschlauch aus der Luftröhre zu entfernen.
Gleichzeitig wird die Luftröhre verschlossen und der Druck in der Lunge aufrechterhalten. Tauchen Sie dann den Lappen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Formin. Waschen Sie das fixierte Gewebe am nächsten Tag dreimal für jeweils mindestens 20 Minuten in 70%igem Ethanol.
Nach dem Einbetten des dehydrierten Gewebes in einen Para-Film wird der Lappen in vier bis fünf Mikrometer-Abschnitte geschnitten und die Schnitte für die histologische Beurteilung mit Hämatin und Eoin gefärbt. Die Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von Mäusen, die einem Aerosol ausgesetzt waren, das nur mit Vehikel erzeugt wurde, liegt typischerweise bei oder unter 200.000 Zellen. Die Zellen bestehen zu 95 bis 100% aus mononukleären Zellen mit nur wenigen Lymphozyten und ohne Neutrophile.
Mäuse wurden mit einem Milligramm pro Milliliter aerosolisiertem Aerosol herausgefordert. LPS. Sie weisen jedoch eine erhöhte Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit auf, typischerweise mehr als 500.000 Zellen nach sechs Stunden, wobei die Zellinfiltrate nach 24 Stunden hoch bleiben und sich das Zellprofil in Richtung einer Dominanz von Neutrophilen verschoben hat. Ein ähnliches entzündliches Zellprofil und eine ähnliche pulmonale Neutrophilie wird auch bei einer Vernebelung von fünf Milligramm pro Milliliter LPS beobachtet.
Neutrophile wurden in der epithelialen Submukosa sowie in den Räumen um die leitenden Atemwege und Blutgefäße nach sechs und 24 Stunden LPS-Challenge beobachtet, jedoch nicht unter Kontrolle. Mit Kochsalzlösung behandelte Mäuse. Der Gesamtproteingehalt in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit von LPS-Provokationsmäusen ist im Vergleich zu Mäusen, die Kochsalzlösung ausgesetzt waren, erhöht, und die Expression der neutrophilen Chemolockstoff-Chemokine c, XCL one und C XCL two ist auch bei LPS-provozierten Mäusen erhöht.
Diese Methode kann jedoch Einblicke in LPs induzierte Lungenentzündung geben. Er kann auch auf andere Krankheitsmodelle wie bakterielle oder virale Infektionen angewendet werden, da der aerosolisierte Dampf an viele verschiedene Herausforderungen angepasst werden kann.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Induktion einer neutrophilen pulmonalen Entzündung mittels aerosolisierter Lipopolysaccharid-(LPS-)Nebelung beschrieben, mit der eine akute Lungenschädigung modelliert wird. Außerdem werden grundlegende chirurgische Techniken zur Lungenisolation, zur Trachealintubation und zur bronchoalveolären Lavage erläutert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Pulmonale Entzündung
- Akutes Lungenversagen
Hintergrund
- Aerosolisierter LPS wird verwendet, um ein Modell zur Untersuchung der neutrophilen Entzündung zu erstellen.
- Die Bronchoalveoläre Lavage ermöglicht die Gewinnung entzündlicher Zellen.
- Das Verständnis der Neutrophilenrekrutierung ist entscheidend für die Erforschung von Lungenerkrankungen.
- Diese Methode bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen LPS-Applikationstechniken.
Zweck der Studie
- Um eine konsistente neutrophile Infiltration der Atemwege in einer kontrollierten Umgebung zu erzeugen.
- Um die Rekrutierung von Neutrophilen in die Lunge zu bewerten.
- Um bestehende Methoden zur Induktion einer Lungenentzündung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Laden von in Kochsalzlösung suspendiertem LPS in einen Vernebler.
- Exposition von Mäusen gegenüber aerosolisiertem LPS in einer Expositionskammer.
- Gewinnung der bronchoalveolären Lavage zur Zellzählung.
- Fixierung von Lungengewebe zur immunhistochemischen Analyse.
Hauptergebnisse
- Nachweis einer effektiven Neutrophilen-Rekrutierung mittels aerosolisierter LPS.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Beurteilung von Lungenentzündungen.
- Aufgezeigt, dass Vorteile hinsichtlich Verteilung und Handhabung im Vergleich zu intratrachealen Methoden bestehen.
- Ermöglichung einer detaillierten Analyse entzündlicher Reaktionen im Lungengewebe.
Schlussfolgerungen
- Die aerosolisierte LPS-Methode ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von pulmonaler Entzündung.
- Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in Forschungsumgebungen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um therapeutische Interventionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Induktion einer pulmonalen Neutrophilie, einer zentralen pathologischen Kennzeichen bei akuter Lungenschädigung und entzündlichen Lungenerkrankungen. Durch die Bereitstellung eines standardisierten, kostengünstigen Aerosolapplikationssystems unterstützt sie die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung in frühen Entdeckungsprogrammen, die auf neutrophil-vermittelte Lungenerkrankungen abzielen. Der Ansatz verbessert das Vorhersagevermögen in präklinischen Modellen, indem er quantifizierbare entzündliche Endpunkte liefert, die für die therapeutische Screening-Relevanz sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der Neutrophilenrekrutierung und Chemokinpfade wie CXCL1 und CXCL2 in einem kontrollierten entzündlichen Umfeld.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes Modell zur Bewertung der Zielinteraktion und Pfadmodulation bei neutrophilenvermittelten Lungenerkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Bronchoalveolärlavage-Ergebnisse, einschließlich Gesamt- und Differenzialzellzahlen sowie Gesamtproteingehalten, zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Unterstützt die Entwicklung reproduzierbarer entzündlicher Endpunkte zur Untersuchung von Substanzen, die den Neutrophileneinstrom oder deren Aktivierung modulieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die bei menschlichen akuten Lungenschäden beobachtete, krankheitsrelevante neutrophile Entzündung und unterstützt so die translationale Abstimmung von Biomarkern.
- Operativer Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem konsistente Bewertungen von entzündungshemmenden oder neutrophilenmodulierenden Substanzen über verschiedene Studien hinweg ermöglicht werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielvalidierung über die Identifizierung von Leitsubstanzen bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für Programme, die auf pulmonale Entzündung und neutrophil-vermittelte Gewebeschädigung ausgerichtet sind.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Neutrophilen-Chemoattraktant-Wegen und der Modulation entzündlicher Kaskaden im Lungenparenchym.
- Screening: Ermöglicht standardisierte neutrophile Entzündungen für zuverlässiges Wirkstoff-Screening und Zielvalidierung in Modellen pulmonaler Erkrankungen.
- Analytik: Liefert quantitative Auswertungen der bronchoalveolären Lavage (Zellzahlen, Proteinspiegel, Neutrophilenanteil) zum Vergleich entzündlicher Reaktionen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Modelliert menschenrelevante neutrophile pulmonale Entzündungen und ermöglicht so eine präklinische Kontinuität für akute Lungenschädigungen und verwandte Indikationen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine kostengünstige, einfach zu bedienende Plattform, die mehrfach in verschiedenen Projekten zur Untersuchung von Lungenerkrankungen oder Wirt-Pathogen-Interaktionen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die Variabilität der induzierten neutrophilen Entzündung verringert wird.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Aerosolapplikation und geringe Anforderungen an technisches Fachwissen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen, indem bereits früh im Entdeckungsprozess mechanistisch relevante, quantifizierbare entzündliche Phänotypen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Substanzen basierend auf konsistenten Daten zur Neutrophilenrekrutierung und Chemokinexpression.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse in der Aerosolerzeugung, der Handhabung von Mäusen und der bronchoalveolären Lavage-Technik.
- Setzt den Zugang zu einem Zerstäuber, einer Druckluftquelle, einer Plexiglas-Expositionsanordnung und einem Sicherheitswerkbank zur Handhabung von LPS voraus.
- Erfordert die Standardisierung der LPS-Konzentration, der Expositionszeit und der postexpositionellen Bedingungen über verschiedene Labore hinweg, um die Vergleichbarkeit zwischen Studien zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das System zur Applikation anderer aerosolisierter Substanzen wie viralen oder bakteriellen Pathogenen eingesetzt wird.
- Auf nicht GMP-konforme explorative Forschung beschränkt; ohne zusätzliche Validierung nicht geeignet für regulierte Toxikologie oder die Herstellung klinischer Materialien.
