Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch Exposition gegenüber aerosolisiertem LPS eine konsistente und reproduzierbare Neutrophilie der Atemwege zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst in Kochsalzlösung suspendiertes LPS in einen Vernebler geladen wird, der mit einer Expositionskammer verbunden ist. Als nächstes werden Mäuse dem aerosolisierten LPS ausgesetzt und dann wird bronchoalveoläre Lavage gesammelt und Entzündungszellen in der Lavage werden aufgezählt.

Schließlich wird das Lungengewebe fixiert, formell für die Einbettung und Sektion und immunhistochemische Analyse. Letztendlich können die Gesamt- und Differentialzellzahlen der bronchoalveolären Lavage verwendet werden, um die Rekrutierung von Neutrophilen in die Lunge zu beurteilen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intratrachealen LPS-Verabreichung sind die gleichmäßige Verteilung von aerosolisiertem LPS in der Lunge, die einfache Durchführung und der minimale Schulungsaufwand, der für eine erfolgreiche Anwendung erforderlich ist. Um ein LPS-Aerosol unter Verwendung geeigneter PSA und innerhalb einer belüfteten Haube der Stufe zwei für biologische Gefahren zu erzeugen, beginnen Sie damit, einen roten Einlass in einen Vernebler einzuführen und dann den Vernebler über den von der bereitgestellten Schlauch mit der unter Druck stehenden Raumluft zu verbinden. Hersteller.

Verwenden Sie als Nächstes einen Luftfilter, um den Auslass des Verneblers an einen Massendurchflussmesser anzuschließen, und schließen Sie dann den Massendurchflussmesser an eine Stromversorgung an. Stellen Sie den Luftstrom auf fünf Liter pro Minute ein, halten Sie den Druck bei ein bis zwei bar, entfernen Sie dann den Massendurchflussmesser und trennen Sie den Luftstrom. Als nächstes wird der Auslass des Verneblers an ein 15,9 Millimeter großes Gabelrohr angeschlossen, das mit 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5 Millimeter großen Plexiglaskästen verbunden ist, die mit abnehmbaren Deckeln ausgestattet sind.

Jede Box sollte ein fünf Millimeter großes Loch in der dem Einlass gegenüberliegenden Seite haben, um einen Druckaufbau zu verhindern. Lege nun bis zu fünf Mäuse in jede Box und schließe die Deckel. Öffnen Sie dann den Vernebler.

Füllen Sie den Einsatz mit vier bis acht Millilitern LPS, das nur in Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gelöst ist, und schließen Sie den Einlass wieder an die Luftzufuhr an. Lassen Sie das Aerosol in die geschlossenen Plexiglasboxen strömen, während Sie die Tiere kontinuierlich überwachen und sicherstellen, dass die Luftzufuhr während der Aerosolisierung fest am Einlass des Verneblers befestigt bleibt. Trennen Sie nach 10 Minuten die Luftzufuhr und lassen Sie die Tiere weitere zwei Minuten in den Plexiglasboxen.

Öffnen Sie dann die Deckel. Lassen Sie das Aerosol sich verteilen und bringen Sie die Mäuse am experimentellen Endpunkt in ihre Käfige zurück. Für jedes Tier der Reihe nach wird zunächst mit einer Schere ein einzelner vorderer hinterer Schnitt gemacht, um den Thorax freizulegen. Heben Sie dann den Brustkorb an der vorderen Spitze des Brustbeins an und punktieren Sie das Zwerchfell an der ventralsten Stelle, ohne in das Lungengewebe einzuschneiden.

Öffnen Sie dann den Brustkorb mit zwei Schnitten, die unterhalb des Kiefers in vorder-hinterer Richtung aufeinandertreffen. Sobald der Brustkorb geöffnet ist, ziehen Sie ihn mit einer Pinzette vorsichtig auseinander und schneiden Sie die Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes durch. Heben Sie nun die Luftröhre an und durchtrennen Sie die Bänder, die die Lungenlappen mit der Brusthöhle verbinden.

Ziehen Sie dann die Lunge und die Luftröhre vorsichtig nach oben und weg vom Fett- und Herzgewebe und legen Sie sie auf ein Stück Spritzenpapier. Führen Sie anschließend einen 0,965 Millimeter schweren Polyethylenschlauch in die Luftröhre ein und befestigen Sie ihn mit einem Seidenfaden. Binden Sie den Mehrlappen ebenfalls mit Seidenfaden ab und führen Sie dann eine 23-Gauge-Nadel in den Polyethylenschlauch ein.

Um dann die bronchoalveoläre Lavage zu sammeln, injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze langsam 250 Mikroliter Eis, das als steriles PBS bezeichnet wird, in den einzelnen Lappen, klopfen Sie vorsichtig auf die Lunge und gegen die Oberfläche der Arbeitsbank, ziehen Sie die Flüssigkeit langsam zurück in die Spritze und sammeln Sie sie in einem Röhrchen, nachdem Sie den Vorgang mit 200 Mikrolitern frischem PBS wiederholt haben. Legen Sie die bronchoalveoläre Lavage zur späteren Analyse auf Eis. Um das Lungengewebe für die histologische Analyse zu fixieren, entfernen Sie den Mehrlappen und schnappen Sie ihn ein. Frieren Sie es auf Trockeneis ein.

Lagern Sie den Keulen bei minus 80 Grad Celsius. Um das Gewebe für die histologische Analyse zu fixieren, montieren Sie eine 60-Milliliter-Spritze ohne Kolben auf einen Metallständer und insufflieren Sie den einzelnen Lappen fünf Minuten lang mit Formalin. Trennen Sie dann die Nadel und ziehen Sie am Seidenfaden, um ihn zusammen mit dem Polyethylenschlauch aus der Luftröhre zu entfernen.

Gleichzeitig wird die Luftröhre verschlossen und der Druck in der Lunge aufrechterhalten. Tauchen Sie dann den Lappen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Formin. Waschen Sie das fixierte Gewebe am nächsten Tag dreimal für jeweils mindestens 20 Minuten in 70%igem Ethanol.

Nach dem Einbetten des dehydrierten Gewebes in einen Para-Film wird der Lappen in vier bis fünf Mikrometer-Abschnitte geschnitten und die Schnitte für die histologische Beurteilung mit Hämatin und Eoin gefärbt. Die Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von Mäusen, die einem Aerosol ausgesetzt waren, das nur mit Vehikel erzeugt wurde, liegt typischerweise bei oder unter 200.000 Zellen. Die Zellen bestehen zu 95 bis 100% aus mononukleären Zellen mit nur wenigen Lymphozyten und ohne Neutrophile.

Mäuse wurden mit einem Milligramm pro Milliliter aerosolisiertem Aerosol herausgefordert. LPS. Sie weisen jedoch eine erhöhte Gesamtzellzahl in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit auf, typischerweise mehr als 500.000 Zellen nach sechs Stunden, wobei die Zellinfiltrate nach 24 Stunden hoch bleiben und sich das Zellprofil in Richtung einer Dominanz von Neutrophilen verschoben hat. Ein ähnliches entzündliches Zellprofil und eine ähnliche pulmonale Neutrophilie wird auch bei einer Vernebelung von fünf Milligramm pro Milliliter LPS beobachtet.

Neutrophile wurden in der epithelialen Submukosa sowie in den Räumen um die leitenden Atemwege und Blutgefäße nach sechs und 24 Stunden LPS-Challenge beobachtet, jedoch nicht unter Kontrolle. Mit Kochsalzlösung behandelte Mäuse. Der Gesamtproteingehalt in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit von LPS-Provokationsmäusen ist im Vergleich zu Mäusen, die Kochsalzlösung ausgesetzt waren, erhöht, und die Expression der neutrophilen Chemolockstoff-Chemokine c, XCL one und C XCL two ist auch bei LPS-provozierten Mäusen erhöht.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in LPs induzierte Lungenentzündung geben. Er kann auch auf andere Krankheitsmodelle wie bakterielle oder virale Infektionen angewendet werden, da der aerosolisierte Dampf an viele verschiedene Herausforderungen angepasst werden kann.