Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe von Ultraschall und Endomikroskopie das angiogenetische Potenzial eines von Krebszellen sezernierten Faktorengemischs zu veranschaulichen. Dazu wird zunächst ein Implantat eingepflanzt, um eine tumorauslösende Umgebung in der Maus ohne Tumorzellen zu erzeugen. Anschließend werden die Dichte der Blutgefäße sowie der Anteil funktionsfähiger Blutgefäße innerhalb des Implantats bewertet.

Im letzten Schritt wird die Morphologie der Blutgefäße sichtbar gemacht. Letztendlich kann das Gleichgewicht zwischen pro- und antiangiogenen Faktoren, die von den Zellen sezerniert werden, sowie deren Wirkung auf die Angiogenese in vivo und zu verschiedenen Zeitpunkten mittels der beiden komplementären bildgebenden Verfahren bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem konventionellen Matrigel-Plug-Assay besteht darin, dass die Analyse eines Pool sezernierter Faktoren durch die Zellen ermöglicht wird, während gleichzeitig komplementäre intravitale Bildgebungsmethoden genutzt werden.

Den Ablauf dieses Verfahrens wird sie ran F Andra, Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Um mit Ultraschall die Durchblutung eines Gels zu überprüfen, das die extrazelluläre Matrix oder ECM nachahmt, stellen Sie zunächst ein 1,5-Milliliter-Einmaltube mit 80 Mikrolitern frisch hergestelltem konditioniertem Medium auf Eis. Der schwierigste Teil des Verfahrens ist das Injizieren des Gels ohne Luftblasen unter Verwendung eiskalter Pipettenspitzen. Vorsichtiges Mischen und langsames Injizieren gewährleisten eine optimale Applikation des Gels.

Danach mithilfe eiskalter 1000-Mikroliter-Spitzen 600 Mikroliter eiskaltes, vier Grad Celsius kaltes Übernachtungsmittel in das Medium einmischen, wobei darauf geachtet werden muss, keine Blasen zu bilden. Das aufgetaute ECM-Mimic-Gel langsam subkutan injizieren. Nachdem die Sedierung durch Zehenquetschung bestätigt wurde, den Bauch jedes Mäuschens rasieren und eine eiskalte Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel verwenden, um langsam subkutan zu injizieren.

Injizieren Sie den Inhalt eines EEND-DPH-Röhrchens pro Tier. Sobald das gesamte Volumen verabreicht ist, halten Sie die Nadel mehrere Minuten lang an Ort und Stelle, bis die Verfestigung erfolgt ist. Drei Wochen später rasieren Sie den Bauchbereich der Mäuse erneut und entfernen Sie überschüssiges Haar mit Enthaarungscreme. Danach fixieren Sie die Mäuse in Rückenlage auf dem Objektträger des Mikromanipulators.

Füllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit Kochsalzlösung. Stecken Sie danach die Nadel in die Schwanzvene. Befestigen Sie die Nadel fest und lösen Sie die Spritze.

Platzieren Sie nun den Wandler in der Mitte des gewünschten Abtastbereichs und klicken Sie auf 3D, um die 3D-Motorstufe zu initialisieren. Klicken Sie erneut auf 3D. Geben Sie erneut die Scan-Distanz und die Schrittgröße ein und drücken Sie auf Scan.

Überprüfen Sie, ob der gesamte Pfropfen in den angezeigten 3D-Bilddaten erfasst wurde. Falls nicht, justieren Sie den Wandler, sodass der gesamte Pfropfen sichtbar ist, und scannen Sie den Bereich erneut, wie zuvor gezeigt. Wählen Sie anschließend den Kontrast aus und stellen Sie die Zeitverstärkungskompensation oder TGC-Regler ein, um das Bild abzudunkeln. Aktivieren Sie die Mikrobläschen mithilfe eines Vial-Mischers 45 Sekunden lang.

Anschließend mischen Sie 50 Mikroliter der Mikrobläschen mit 50 Mikrolitern Kochsalzlösung in einer Ein-Milliliter-Spritze. Ersetzen Sie die Spritze mit der enthaltenen lockeren Kochsalzlösung durch die Spritze mit den aktivierten Mikrobläschen und injizieren Sie die verdünnten Mikrobläschen in die Schwanzvene jedes Mäuschens. Warten Sie einige Sekunden, bis die Bläschen einen stabilen Zustand erreicht haben, und klicken Sie dann auf 3D und wählen Sie „Scan“, um die 3D-Aufnahme zu starten.

Kontrastverstärkte Bilder. Klicken Sie auf „Store“, um die Bilddaten zu speichern, und wählen Sie anschließend 3D und „Destroy 3D“. Um die Mikrobläschen zu zerstören, klicken Sie erneut auf 3D und wählen Sie „Scan“, um eine Post-Destruction-Cine-Loop-Aufnahme durchzuführen.

Dann klicken Sie erneut auf „Geschäft anzeigen“. Als Nächstes klicken Sie in den Referenzeinstellungen auf „Referenz erstellen“ und wählen anschließend „Studienverwaltung“, um die vor der Zerstörung liegende Zenaschleife zu öffnen.

Klicken Sie nun auf „Process CENA“, um eine grüne Kontrastüberlagerung zu erzeugen. Wählen Sie dann „In 3D laden“ in der Ultraschallbildgebungssoftware aus. Klicken Sie anschließend auf „Moduseinstellungen“, dann auf „Volumen“ und wählen Sie „Parallel“ aus.

Danach eine Reihe von Konturen segmentieren, um ein 3D-Volumen des Zielgewebes zu erstellen, und auf „Fertig stellen“ klicken, um die Segmentierung abzuschließen. Um mithilfe der fasergeführten konfokalen Endomikroskopie die Gefäßmorphologie des ECM-Mimetikum-Gel-Plugs zu bewerten, 200 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Lösung von FITC-markiertem Dextran in die Schwanzvene jedes Versuchstieres injizieren. Anschließend einen kleinen Schnitt etwa einen Zentimeter vom Plug entfernt anlegen und die Endomikroskopie-Sonde vorsichtig auf den Plug aufsetzen, wobei der Plug intakt bleiben muss.

Wenn die Sonde an Ort und Stelle ist, verwenden Sie das Fußpedal, um den Laserstart zu betätigen. Sobald die Fluoreszenz auf dem Bildschirm erscheint, drücken Sie mit dem Fußpedal auf „Auswählen“, um kurze Filme aufzunehmen, die bis zu 32stel lang sind. Zwischen den Filmaufnahmen spülen Sie die Sondenspitze in einem Reagenzglas mit Wasser. Wenn die Aufnahme beendet ist, reinigen Sie die Spitze mit einem Wattestäbchen, um den mittleren Gefäßdurchmesser zu analysieren.

Klicken Sie anschließend auf „Mikrogefäße erkennen“, um das Modulfenster zur Gefäßdetektion zu öffnen, und klicken Sie auf „Einstellungen“. Stellen Sie sicher, dass der mittlere Gefäßdurchmesser in den interessierenden Statistiken ausgewählt ist. Aktivieren Sie außerdem die Option zur Anzeige von Histogrammbalken im Anzeigemodus.

Klicken Sie auf „Detect“, um die ausgewählten Messungen anzuzeigen. Um die Fluoreszenzsignalintensität in den Bereichen neben Blutgefäßen zu analysieren, wählen Sie „Create Circle ROI“ und erstellen Sie einen Kreis im interessierenden Bereich. Wählen Sie abschließend „Compute Histogram within ROI“, um die Werte für den umkreisten Bereich zu berechnen.

Hier wird die umfangreiche Rekrutierung funktioneller Blutgefäße in Plugs, die mit konditioniertem Medium von U 87 mg beladen wurden, mittels kontrastverstärkter Ultraschallbildgebung mit Mikrobläschen sichtbar gemacht. Umgekehrt ist innerhalb der Plugs, die konditioniertes Medium aus ruhenden, tumorbildenden Zellen enthalten, der Blutfluss nahezu nicht nachweisbar. Die Morphologie dieser neu gebildeten Blutgefäße wird weiter hervorgehoben durch die faserbasierte konfokale Endomikroskopie der Gefäße nach Gabe von FITC-Dextran, wie in diesen repräsentativen Abbildungen gezeigt. Beachten Sie, wie die Blutgefäße in den mit konditioniertem Medium von U 87 mg beladenen Plugs eine typische undichte, stumpf endende, erweiterte Gefäßmorphologie aufweisen.

Die vergrößerten und stark verwundenen Blutgefäße zeigen außerdem einen nicht kontinuierlichen, langsamen Fluss, und es wird eine Aussickern von Blut im umgebenden Bereich beobachtet, was sich auch durch ein starkes fluoreszierendes Signal außerhalb der Blutgefäße bemerkbar macht. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden zu mehreren Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Kinetik der Angiogenese zu optimieren.