Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit Hilfe von Ultraschall und Endomikroskopie das angiogene Potenzial eines Pools von Faktoren zu veranschaulichen, die von Krebszellen sezerniert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plug implantiert wird, um in der Maus in Abwesenheit von Tumorzellen eine tumorähnliche Umgebung zu erzeugen. Als nächstes werden die Dichte der Blutgefäße und der prozentuale Anteil der funktionsfähigen Blutgefäße innerhalb des Pfropfens beurteilt.

Im letzten Schritt wird die Morphologie der Blutgefäße sichtbar gemacht. Letztendlich kann das Gleichgewicht zwischen den von den Zellen sezernierten pro- und anti-angiogenen Faktoren und ihren Auswirkungen auf die Angiogenese durch die beiden komplementären Bildgebungsmodalitäten in, vital und zu verschiedenen Zeitpunkten beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem herkömmlichen Matrigel-Plug-Assay besteht darin, dass sie die Analyse eines Pools von sezernierten Faktoren durch die Zellen ermöglicht, während komplementäre intravitale Bildgebungsmodalitäten verwendet werden.

Um dieses Verfahren zu demonstrieren, wird sie F Andra Doktoranden aus meinem Labor zur Verwendung von Ultraschall zur Bewertung der extrazellulären Matrix oder der EZM-Mimik-Gel-Plug-Vaskularisation verwenden, beginnen Sie damit, ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen mit 80 Mikrolitern frisch zubereitetem konditioniertem Medium auf Eis zu legen. Der kniffligste Teil des Eingriffs ist die blasenfreie Injektion des Gels mit eiskalten Spitzen. Schonendes Mischen und eine langsame Injektion sorgen für eine optimale Gelverabreichung.

Mischen Sie dann mit eiskalten 1000-Mikroliter-Spitzen über Nacht 600 Mikroliter eiskalte vier Grad Celsius. Aufgetautes ECM-Mimikgel in die Medien und darauf achten, keine Blasen zu bilden. Nachdem Sie die Sedierung durch Zehenkneifen bestätigt haben, rasieren Sie den Bauch jeder Maus und verwenden Sie eine eiskalte Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um langsam subkutan zu behandeln.

Injizieren Sie den Inhalt eines EEND DPH-Schlauchs pro Tier. Sobald das gesamte Volumen verabreicht wurde, halten Sie die Nadel einige Minuten lang an Ort und Stelle, bis eine Verfestigung auftritt. Drei Wochen später rasieren Sie den Bauchbereich der Mäuse erneut, entfernen Sie überschüssige Haare mit Enthaarungscreme und fixieren Sie die Mäuse dann in Rückenlage auf der Bühne des Mikromanipulators.

Füllen Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit Kochsalzlösung. Platzieren Sie dann die Nadel in der Schwanzvene. Fixieren Sie die Nadel fest und lösen Sie die Spritze.

Platzieren Sie nun den Schallkopf in der Mitte des gewünschten Scanbereichs und klicken Sie auf 3D, um den 3D-Motortisch zu initialisieren. Klicken Sie auf 3D. Geben Sie erneut den Scanabstand und die Schrittweite ein und drücken Sie Scan.

Bestätigen Sie, dass der gesamte Stecker in den angezeigten 3D-Bilddaten gescannt wurde. Wenn nicht, stellen Sie den Schallkopf so ein, dass der gesamte Stecker sichtbar ist, und scannen Sie den Bereich erneut, wie gerade gezeigt. Wählen Sie als Nächstes den Kontrast und passen Sie die Zeitverstärkungskompensation oder die TGC-Steuerung an, um das Bild abzudunkeln, verwenden Sie einen Fläschchenmixer, um die Mikrobläschen für 45 Sekunden zu aktivieren.

Mischen Sie dann 50 Mikroliter der Mikrobläschen mit 50 Mikrolitern Kochsalzlösung in einer Ein-Milliliter-Spritze. Ersetzen Sie die Kochsalzlösung enthaltende Lösespritze durch die Spritze mit den aktivierten Mikrobläschen und injizieren Sie die verdünnten Mikrobläschen in die Schwanzvene jeder Maus. Warten Sie einige Sekunden, bis die Blasen einen stabilen Zustand erreicht haben, und klicken Sie dann auf 3D und wählen Sie Scannen, um 3D zu erfassen.

Kontrastverstärkte Bilder. Klicken Sie auf "Gesehener Speicher", um die Bilddaten zu speichern, und wählen Sie dann "3D" und "3D löschen" aus. Um die Mikroblasen zu zerstören, klicke erneut auf 3D und wähle Scannen, um eine Cena-Schleife nach der Zerstörung zu erhalten.

Klicken Sie dann erneut auf einen Shop gesehen. Klicken Sie anschließend in den Referenzeinstellungen auf Referenz erstellen und wählen Sie dann Studienverwaltung aus. Um den Pre Destruction Cena Loop zu öffnen.

Klicken Sie nun auf cena verarbeiten, um ein grünes Kontrast-Overlay zu erzeugen. Wählen Sie dann in der Ultraschallbildgebungssoftware In 3D laden aus. Klicken Sie anschließend auf Moduseinstellungen, klicken Sie auf Lautstärke und wählen Sie parallel.

Segmentieren Sie dann eine Reihe von Konturen, um ein 3D-Volumen des Zielgewebes zu erstellen, und klicken Sie auf Fertig, um die Segmentierung abzuschließen. Um die faserkonfokale Endomikroskopie zur Beurteilung der Morphologie des ECM-Mimikgel-Gefäßsystems zu verwenden, injizieren Sie 200 Mikroliter à 10 Milligramm pro Milliliter und passen C-markiertes Dextran in die Schwanzvene jedes Versuchstieres an. Setzen Sie dann einen kleinen Schnitt etwa einen Zentimeter vom Plug entfernt und platzieren Sie die Endomikroskopiesonde vorsichtig auf dem Plug, während der Plug intakt bleibt.

Sobald die Sonde an Ort und Stelle ist, drücken Sie mit dem Fußpedal auf Laser starten. Sobald die Fluoreszenz auf dem Bildschirm erscheint, drücken Sie mit dem Fußpedal die Auswahltaste, um kurze bis 32. lange Filme zwischen den Filmen aufzunehmen, und waschen Sie die Sondenspitze in einem Röhrchen mit Wasser. Wenn die Folie fertig ist, reinigen Sie die Spitze mit einem Wattestäbchen, um den mittleren Gefäßdurchmesser zu analysieren.

Klicken Sie anschließend auf Mikrogefäße erkennen, um das Fenster des Gefäßerkennungsmoduls zu öffnen, und klicken Sie auf Einstellungen. Stellen Sie sicher, dass der mittlere Gefäßdurchmesser in der interessierenden Statistik enthalten ist. Fenster- und Anzeigehistogrammbalken im Anzeigemodus sind markiert.

Klicken Sie auf Erkennen, um die ausgewählten Messungen anzuzeigen. Um die Intensität des Fluoreszenzsignals in den an die Blutgefäße angrenzenden Bereichen zu analysieren, wählen Sie ROI für Kreis erstellen und erstellen Sie einen Kreis im interessierenden Bereich. Wählen Sie abschließend Histogramm berechnen innerhalb des ROI aus, um die Werte zu berechnen, die sich auf den eingekreisten Bereich beziehen.

Hier wird die umfangreiche Rekrutierung funktioneller Blutgefäße in U 87 mg konditionierten mittelbelasteten Pfropfen durch mikroblasenkontrastverstärkte Ultraschallbildgebung aufgedeckt. Umgekehrt ist der Blutfluss innerhalb der Pfropfen, die konditioniertes Medium aus ruhenden tumorerzeugenden Zellen enthalten, nahezu nicht nachweisbar. Die Morphologie dieser neu gebildeten Blutgefäße wird durch die faserige konfokale Endomikroskopie der Gefäße nach der Verabreichung von fittem C-Dextran weiter betont, wie in diesen repräsentativen Bildern gezeigt wird, beachten Sie, wie die Blutgefäße in den mit dem konditionierten Medium U 87 mg beladenen Pfropfen eine typische undichte Morphologie des vergrößerten Gefäßes aufweisen.

Die vergrößerten und stark verwickelten Blutgefäße zeigen auch einen unkontinuierlichen und trägen Fluss, und es wird ein Austreten des Blutes in der Umgebung beobachtet, ebenso wie das hohe Fluoreszenzsignal, das außerhalb der Blutgefäße sichtbar ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in Stunden zu mehreren Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Angiogenese-Kinetik zu optimieren.