Ein Verfahren zur Permeabilisierung der Drosophila Embryonen für Tests von Small Molecule Aktivität

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, lebensfähige Drosophila-Embryonen mit einer durchlässigen Eierschale zu präparieren, um die Bioaktivität von eingeführten niedermolekularen Medikamenten oder Toxinen zu testen. Dies wird erreicht, indem Embryonen im Entwicklungsstadium zunächst mit verdünntem Bleichmittel behandelt werden, um die äußeren Schichten der Chorion-Eierschale zu entfernen. Der zweite Schritt besteht darin, die Embryonen mit einem Lösungsmittel zu permatisieren, das die dünne wachsartige Eierschalenschicht abbaut, die kleine gelöste Moleküle blockiert.

Der dritte Schritt besteht darin, Embryonen mit einem Medikament oder Toxin und einem Farbstoff zu behandeln, um gleichzeitig die Durchlässigkeit der Eischale zu messen und eine interessante Verbindung einzuführen. Nach der weiteren Entwicklung können die Embryonen entweder direkt abgebildet oder für die Immunhistochemie aufbereitet werden. Letztendlich können die Ergebnisse die Aktivität eines Medikaments oder Toxins auf die Entwicklung von Geweben zeigen, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie mit Immunreagenzien oder lebenswichtigen Bindungen bestimmt wurde.

Heute stelle ich unsere Methode der Permeation von Drosophila-Embryonen für Assays der Aktivität kleiner Moleküle vor. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung herkömmlicher organischer Lösungsmittel wie Heptan bis Perme. Die Eierschale besteht darin, dass unser Embryopermeationslösungsmittel (EPS) wasserfest und relativ ungiftig ist.

Diese Eigenschaften erleichtern die Behandlung von Embryonen, bei der die Lösungsmittelexposition genauer gesteuert und in physiologisch relevanten Medien durchgeführt werden kann, was beides zu einer höheren Lebensfähigkeit der Embryonen führt. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich darüber nachdachte, wie man die wachsartige Schicht der Eierschale entfernen kann. Als Skifahrer dachte ich über die übliche Verwendung von Zitruslösungsmitteln nach, um das restliche Wachs von der Basis der Skier zu entfernen.

Dies veranlasste mich, diese Anwendung auf die Eierschale des Fliegenembryos zu übertragen, und nach einigem Ausprobieren führte dies zur Lösung der EPS-Zusammensetzung, Bereiten Sie Populationskäfige mit mindestens 500 Fliegen im Paarungsalter der gewünschten Stämme vor. Die Käfige sollten mit 10 Zentimeter Traubensaft gefüllt sein. Mit einem Klecks Hefepaste belüften.

Wechseln Sie diese Platten zweimal täglich. Nach ein paar Tagen werden die Fliegen an die Kultur gewöhnt und legen regelmäßiger Embryonen. EPS wird aus Tensiden und limitierenden Lösungsmittellösungen hergestellt und ist zwei Monate lang gut.

Bei Lagerung bei Raumtemperatur die Tenside auf 37 Grad Celsius erwärmen, wenn frisches EPS für die EPS-Behandlung angemischt werden. Für die EPS-Behandlung werden Embryonen mit Körben aus drei Zentimetern gefertigt, also 50 Milliliter Polypropylen-Schlauch und Nylonnetz aufgeraut. Kunststoffkanten schmelzen in späteren Entwicklungsschritten leichter mit dem Gewebe zusammen. Die Embryonen werden auch mit Körben behandelt, die aus den Verschlüssen von 50-Milliliter-Röhrchen bestehen.

Die Kappe wird aufgebohrt und eingekerbt, und das Gewinde zwischen Kappe und Rohr sichert das Netz. Alternativ wird eine lokal maschinelle Schiebekammer verwendet und mit einem Stück sauerstoffdurchlässigem Stück präpariert. Führen Sie eine Membran durch, die durch einen Retainerring über der Öffnung befestigt ist, um die Embryonen zu entnehmen.

Morgens eine frische Traubenplatte mit Hefepaste auf die Kultur setzen. Wechseln Sie nach einer Stunde die Platte und entsorgen Sie die erste gesammelte Platte. Lassen Sie die zweite Platte zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius die Embryonen sammeln.

Dann die Platte auffangen und auf 18 Grad Celsius umfüllen. Lassen Sie die Embryonen sich bis zum gewünschten Stadium entwickeln. Wenn die Embryonen fertig sind, enthüllen Sie sie vor der EPS-Behandlung.

Spülen Sie sie vom Teller in den Breikorb mit Wasser und einem Pinsel ab. Spülen Sie sie zweitens unter fließendem Wasser ab, um Schmutz zu entfernen. Drittens, tauchen Sie sie zwei Minuten lang in 50%iges Bleichmittel mit regelmäßiger Zirkulation der Bleichlösung.

Spülen Sie sie dann umgehend mit fließendem Wasser ab. Füllen Sie nun sechs 60-Millimeter-Schalen mit jeweils 10 Millilitern PBS, die als Bäder fungieren, und verdünnen Sie das EPS-Material in MBIM um ein bis 40 Grad, um die Mischung zu verwirbeln. Eine weiße Emulsion bildet sich, tupft das überschüssige Wasser mit einem Tuch vom Boden des Siebkorbs ab und taucht die Embryonen mit ständiger Wirbelbewegung in die EPS-Verdünnung.

Nachdem Sie die Embryonen 30 Sekunden lang in EPS geschwenkt haben, entfernen Sie sie und tupfen Sie die überschüssige Lösung ab. Bewegen Sie dann den Korb zwischen den sechs PBS-Bädern und spritzen Sie ihn vorsichtig ab, um ihn zu spülen und mit der Färbe- und Arzneimittelbehandlung fortzufahren. Die Optimierung der Permeabilität und Lebensfähigkeit ist der schwierigste Teil dieses Protokolls.

Durchlässigkeit hängt vom Entwicklungsstadium des Embryos ab. Die Temperatur, bei der die Embryonen altern und kann auch zwischen den einzelnen Fliegenstämmen stark variieren. Die besten Parameter für die EPS-Verdünnung und die Expositionszeit müssen empirisch ermittelt werden.

Bereiten Sie zunächst eine 50 mikromolare Lösung des Science-Fiction-Carbonsäurefarbstoffs in M-B-I-M-T vor, ein Milliliter in einem Mikrofiche-Röhrchen reicht aus. In diesem Stadium kann ein Toxin oder Medikament hinzugefügt werden, damit sich der Wirbel der Akutbehandlung vermischt. Übertragen Sie die Perme-Embryonen mit einem Pinsel aus dem Korb in das Mikrofuge-Röhrchen.

Verschließen Sie das Rohr und drehen Sie es mehrmals um. Laden Sie dann das Röhrchen auf einen Mutator und lassen Sie sie 15 Minuten lang inkubieren. Nachdem sich die Embryonen eingenistet haben, entfernen Sie den Farbstoff mit einer Pipette und fügen Sie einen Milliliter M-B-I-M-T zum Waschen hinzu. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die Embryonen, lassen Sie sie sich ansiedeln und ersetzen Sie das M-B-I-M-T. Tun Sie dies dann ein drittes und ein viertes Mal. Sobald die vierte Wäsche abgeschlossen ist, entfernen Sie alle M-B-I-M-T und bringen Sie die Embryonen für lange Entwicklungsperioden in einen Entwicklungskorb.

Für den Entwicklungskorb bereiten Sie zuerst den Korb mit einer Spülung von 70% Ethanol vor und dann mit Wasser, Blut trocknen mit einem Labortuch. Wenn fertig. Übertragen Sie dann den Korb in eine 60-Millimeter-Schale mit sechs Millilitern Inkubationsmedium, das das gewünschte Medikament oder Toxin enthält.

Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel auf das Netz im Korb, indem Sie vorsichtig Inkubationsmedium über sie tropfen lassen, und verteilen Sie die Embryonen in einer Monoschicht. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen unter dem Netz eingeschlossen werden. Um zuerst eine Objektträgerkammer zu verwenden, bereiten Sie die Kammer vor, drehen Sie die Objektträgerkammer um und geben Sie eine dünne Kugel Vakuumfett um den Rand der Öffnung.

Als nächstes werden 150 Mikroliter des gewünschten Mediums auf die Oberfläche der Membran in der Öffnung geladen. Übertragen Sie nun die Embryonen mit einem Pinsel auf das Medium und verteilen Sie sie auf der Membran. Zum Schluss tragen Sie einen 25 Millimeter dicken, kreisförmigen Deckzettel auf und glätten Sie das Medium.

Üben Sie einen leichten Druck um den Umfang aus, um die Abdichtung zu gewährleisten. Es gibt einen robusten Effekt der Aufzucht von Embryonen bei 18 Grad Celsius auf ihre Fähigkeit, durch EPS perme zu sein und in späten Entwicklungsstadien Farbstoff aufzunehmen. Dies wird durch das Fehlen einer Rumin-BD-Aufnahme in EPS-behandelten Embryonen veranschaulicht, die bei 25 Grad Celsius aufgezogen wurden. Die Aufnahme von Sci-Fi-Carbonsäure-Farbstoffen, hier in Rot, zeigt die verschiedenen Grade der Permeabilität, die typischerweise bei EPS-behandelten Embryonen zu beobachten sind.

dynamische Verteilung des fernroten Sci-Fi-Farbstoffs während der Entwicklung und seine Konsolidierung im Eigelb im entwickelten Darm, die mit blauer Autofluoreszenz beobachtet wird, zeigen ein Kriterium zur Beurteilung der Lebensfähigkeit. Der Sci-Fi-Farbstoff kann auch die vorherige Embryonendurchlässigkeit nach Formaldehydfixierung und Immunfärbung bestimmen. Nachdem EPS-Embryonen mit Sci-Fi-Farbstoff und Methylquecksilbertoxin behandelt wurden, werden sie mit Antifa zwei in Grün gefärbt, um Motoneuronen zu markieren, und Anti E Lab in Rot, um Neuronenzellkörper zu markieren.

Sci-Fi-Farbstoff ist pseudofarben in Blau. Das Methylquecksilber hat einen Einfluss auf die Musterung der Zellkörper der Corton-Neuronen, die durch die Pfeile in den Embryonen der Kontrollbehandlung gekennzeichnet sind. Diese Neuronen haben eine geordnetere Faszien: Zwei hier in Weiß gezeigte veranschaulichen die normale Verzweigung segmentaler Neuronen in der Kontrollbehandlung, die durch die Pfeilspitzen festgestellt wird.

Im Vergleich dazu verändert die Behandlung mit Methylquecksilber das Verzweigungsmuster, das durch die durchgehenden grünen Pfeile markiert ist. Der hohle grüne Pfeil markiert, wo die Verzweigung verschoben wurde. Sobald Sie die Embryopermeationsbehandlungen mit dieser Technik beherrschen, können sie in etwa 30 oder 40 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fixierung und Immunfärbung der Embryonen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche spezifischen Gewebe während der Entwicklung von einem Medikament oder einem Toxin angegriffen werden. Ich danke Ihnen, dass Sie dieses Verfahren beobachtet haben, und wünsche Ihnen viel Glück bei der Anwendung dieser Methoden in Ihrem Labor.