Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Zusammensetzung und Funktionalität des Nephronsegments in der Niere adulter Zebrafische zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszenzmarkiertes Dextrin in ein Nest injiziert wird, in dem Zebrafische angebunden werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Niere zu entfernen und zu fixieren, um das Gewebe für nachfolgende Markierungsmethoden vorzubereiten.

Als nächstes wird die Niere gebleicht, um Pigmentflecken zu entfernen, und dann gefärbt, um die gewünschten Nephronsegmente fluoreszierend zu markieren. Die Ergebnisse werden mittels Immunfluoreszenz, Mikroskopie und/oder Hellfeld-Bildgebung erzielt, die eine Visualisierung der Nierenanatomie basierend auf dem ausgewählten Farbstoff oder den ausgewählten Flecken ermöglichen. Die folgenden Markierungsmethoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der Niere zur Organanatomie zu beantworten und können zur Untersuchung der Nephronzusammensetzung und zur Bewertung der Nierenfunktionalität sowohl vor als auch nach einem Verletzungsereignis verwendet werden.

Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Untersuchung genetischer Anomalien in der Nierenbildung bei Erwachsenen und könnten auch zur Beurteilung des Nierenstatus während der Modellierung chronischer Krankheiten angewendet werden. Um mit dem Umfüllen der Lösung von einem betäubten Fisch zu beginnen, legen Sie das Tier vorsichtig auf eine feuchte Schwammform, ventrale Seite. Füllen Sie als Nächstes eine Insulinspritze mit 20 Mikrolitern aufgetauter Dextrin-Stammlösung.

Platzieren Sie die Nadel so, dass das Einstechen in einem flachen Winkel an der ventralen Mittellinie des Bauches erfolgt. Um eine leichte Injektion der Organe zu vermeiden, heben Sie die Nadel direkt nach der Injektion an, um die Körperwand anzuheben und einen Raum zu schaffen, in den die Lösung injiziert werden kann. Bringen Sie den Fisch nach der Injektion vorsichtig in das Aquarium zurück, um sich von der Narkose zu erholen.

Um mit dem Dekantieren zu beginnen, entfernen Sie die überschüssige Lösung von einem betäubten Fisch und legen Sie sie auf ein Taschentuch oder Papiertuch. Nachdem Sie den Kopf und die inneren Organe entfernt haben, verwenden Sie superfeine Präpariernadeln, um die Körperwände aufzustecken. Lokalisieren Sie das Nierenorgan, das an der Rückenwand des Tieres haftet.

Löse die Niere mit einer feinen Pinzette von der Rückenwand. Legen Sie die Niere vorsichtig in ein Fünf-Milliliter-Glasfläschchen mit einem XPBS und waschen Sie sie dreimal jeweils fünf Minuten lang. Entfernen Sie die Niere mit einer Transferpipette und legen Sie sie mit ein bis zwei Tropfen eines XPBS auf einen sauberen Glasobjektträger.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Niere auf dem Objektträger abzuflachen, und stellen Sie sicher, dass sich kein Gewebe gekräuselt oder anderweitig auf sich selbst gekippt hat. Mit einem Wolframdrahtwerkzeug können kleine Schnitte in das Bindegewebe gesetzt werden, um die flache Positionierung der Niere zu erleichtern. Legen Sie anschließend kleine Stücke Modelliermasse auf jede Ecke eines 18 x 18 Millimeter großen Glasdeckglases.

Setzen Sie den Deckglas langsam in einem leichten Winkel auf die Niere. Um das Einschließen von Luftblasen zu minimieren, fügen Sie bei Bedarf einen zusätzlichen Tropfen eines XPBS hinzu, um den Raum zwischen Deckglas und Schiebefolie zu füllen. Eine separate Gruppe von Zebrafischen wird eingeschläfert und über Nacht in Fixiermittel eingeweicht.

Wenn Sie bereit sind, lösen Sie die Niere vorsichtig mit einer feinen Pinzette von der dorsalen Körperwand und legen Sie das Organ in ein Glasfläschchen. Waschen Sie die präparierte Niere dreimal mit drei bis fünf Millilitern eines XPBS mit 0,05 % Tween für jeweils fünf Minuten. Entfernen Sie anschließend die PBS-Lösung und spülen Sie die Niere 30 Minuten lang mit drei Millilitern einer 5%igen Saccharoselösung aus.

Nach dieser Zeit die Lösung durch drei Milliliter 30%ige Saccharose ersetzen und am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Niere zweimal, bevor Sie drei bis fünf Milliliter Bleichlösung hinzufügen. Um die auf dem Nierenorgan vorhandene Melanozytenpigmentierung zu entfernen, stellen Sie das Glasfläschchen auf einen Rotator und beobachten Sie genau, wie die Pigmentierung verschwindet.

Die Depigmentierung dauert in der Regel etwa 20 Minuten, kann aber gelegentlich auch bis zu 60 Minuten dauern. Wenn die Bleichlösung zu lange einwirken gelassen wird, kann es zu einem Zerfall kommen, und es wird daher empfohlen, die Probe alle 10 bis 15 Minuten zu überwachen, um die Unversehrtheit zu überprüfen, wenn die Pigmentierung zweimal aus der Nierenwäsche entfernt wurde, und eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 4%iger PFA-Lösung zu inkubieren. Entfernen Sie anschließend die 4%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Niere nach der letzten Wäsche dreimal mit drei bis fünf Millilitern Blocklösung und inkubieren Sie die Niere zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Wenn die Blockierung abgeschlossen ist, fahren Sie direkt mit dem ausgewählten Färbeprotokoll fort. Entfernen Sie die Blockierungslösung und waschen Sie die Niere dreimal, bevor Sie die Niere mindestens 10 Minuten lang in einem XPBS einweichen lassen. Übertragen Sie die Niere während dieser Zeit in eine 12-Well- oder 24-Well-Kulturschale.

Ersetzen Sie das XPBS durch ausreichend funktionierende alkalische Phosphatase-Substratlösung, um die Probe abzudecken, und legen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator. Nach dieser Zeit stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Niere in alkalischer Phosphatase-Waschpufferlösung waschen. Spülen Sie die Niere über einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten dreimal mit Waschpufferlösung.

Entfernen Sie anschließend die Waschpufferlösung und setzen Sie die Niere auf ein sauberes Glas. Schieben Sie das im Markierungskit enthaltene Phosphatase-Eindeckmedium hinein. Visualisieren Sie die mit alkalischer Phosphatase gefärbte Niere mit einem Stereomikroskop oder Zusammengesetztenmikroskop mit einem an Debbie angeschlossenen Filterset.

Bereiten Sie zunächst eine 200-Mikroliter-Arbeits-DBA-Lösung vor, indem Sie DBA in einem XPBS verdünnen. Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch 200 Mikroliter DBA-Lösung und legen Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator. Nach dieser Zeit entfernen Sie die DBA-Lösung und waschen die Niere dreimal mit drei bis fünf Millilitern eines XPBS für jeweils fünf Minuten.

Entfernen Sie den einen XPBS und montieren Sie die Niere auf einen sauberen Objektträger. Wie bereits gezeigt, visualisieren Sie die DBA-gefärbten distalen Segmente der Niere mit einem Standard-Trixie- oder Texas-Rotfilterset an einem fluoreszierenden Stereomikroskop oder Verbundmikroskop. In diesem Hellfeldbild einer ungebleichten Niere entspricht die schwarze Pigmentierung der verstreuten Population von Melanozyten.

Hier werden Nephron-PCT-Segmente drei Tage nach der Dextrin-Injektion sichtbar gemacht. Der Einschub enthält ein Bild eines einzelnen Nephrons mit Melanozyten. Dieses Bild zeigt eine adulte Niere nach Entfernung der Melanozytenpigmentierung.

Diese repräsentativen Bilder zeigen leichte morphologische Variationen zwischen den PCT-Segmenten, während viele Nephron-PCTs eng gewickelt sind. Andere Nephrone enthalten PCT-Regionen, die eine minimale Spiralbildung aufweisen: Dextrinkaskadenblau, Dextrin, Luzifergelb und Dextrinfluorrubin markieren bevorzugt die PCT-Segmente in Nierennephronen, sowohl Dextrinkaskadenblau als auch Luzifergelb zeigen eine unspezifische Markierung mit einem viel höheren Hintergrund, der in mit Luzifergelb behandelten Nieren beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu zeigte Dextrin-Fluor-Rubin einen dramatisch reduzierten Hintergrund mit intensiver PCT-Markierung.

Eine adulte Niere, die durch den Wunsch gefärbt wurde, einen spezifischen Marker des PCT-Transporterzelltyps zu detektieren, zeigt ein Expressionsmuster, das für die Dextrinaufnahme charakteristisch ist, mit einer Verteilung verschiedener eng gewickelter geschlungener PCT-Domänen sowie länglicher PCT-Abschnitte, die einen konsistent breiten Durchmesser aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nephronsegmente in der erwachsenen Zebrafischniere erfolgreich markiert werden können, wie z. B. der proximale Tubulus mit alkalischer Phosphatase und der medizinische distale Tubulus mit DBA. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 4%-Paraldehyd äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Mantels, von Handschuhen und einer Brille getroffen werden sollten.