Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Zeitrafferanalyse verschiedener Entwicklungsprozesse mit einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop mit einfachen Strategien zur Neuausrichtung nach dem Driften in eine beliebige Richtung zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, da sie die direkte Beobachtung der Gewebe- und Organentwicklung in lebenden Embryonen über mehrere Stunden ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine erschwingliche und einfach zu handhabende Alternative zu komplexeren Techniken ist, die normalerweise für die Zeitrafferaufzeichnung von sich entwickelnden Geweben und Organen verwendet werden, wie z. B. Laserscanning oder Lichtmikroskopie.

Obwohl diese Methode Einblicke in räumliche und zeitliche Veränderungen geben kann, die während der Entwicklung von Embryonen und Larven von Kehrfischen auftreten, kann sie auch zur Untersuchung früher Entwicklungsprozesse und anderer Modellorganismen angewendet werden. Darüber hinaus eignet es sich, dynamische Prozesse in erwachsenen Organismen zu beobachten, wie z.B. die Heilung und Regeneration von Wurzeln. Zur Vorbereitung sind hochreproduktive adulte Fische aus der transgenen GFP-Expressionslinie zu identifizieren.

Am Nachmittag vor der Mikroinjektion der Pflanze setzen Sie fünf männlich-weibliche Paare von Fortpflanzungsfischen in fünf Zuchtbehältern ein. In den Behältern das Männchen und das Weibchen durch ein herausnehmbares Sieb über Nacht getrennt aufbewahren. Legen Sie am nächsten Morgen, kurz nachdem das Licht angeht, ein Männchen und ein Weibchen zusammen über das Sieb, damit sie ihre Eier nicht auffressen.

Beobachten Sie nun die Fische beim Laichen. Sobald das Paar etwa 50 Eier produziert hat, trenne sie. Übertragen Sie dann die Eizellen mit einer Pasteur-Pipette in eine mit Embryowasser gefüllte Petrischale für eine erste Injektionsrunde.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes verpaarte Paar. Werden zusätzliche Eier benötigt, können die gleichen Paarungen mehrmals zusammengebracht und getrennt werden. Für die Mikroinjektion erfolgt die fortgeschrittene Zubereitung von Schalen und Injektionsnadeln auf ziemlich standardisierte Weise.

Details finden Sie im Textprotokoll. Beginnen Sie mit dem Laden einer vorbereiteten Injektionsnadel. Füllen Sie die Nadel mit einer Mikroladerspitze mit zwei Mikrolitern MO-Arbeitslösung auf und befestigen Sie die Nadel dann in einem Mikromanipulator.

Dann kann die Nadelspitze geöffnet werden. Während du es mit dem Seziermikroskop betrachtest, kneifst du das Ende mit einer Pinzette auf oder drückst die Spitze gegen eine starre Oberfläche. Kalibrieren Sie dann das Injektionsvolumen, indem Sie die MO-Lösung in einen Tropfen Mineralöl auf einem Gradnetz injizieren.

Passen Sie die Injektion so an, dass Sie 75-Mikron-Tropfen erhalten, was etwa 200 Pikolitern Lösung entspricht. Bereiten Sie als Nächstes die Embryonen für die Injektion vor. Ordnen Sie die etwa 21 Embryonen im Zellstadium entlang der Rille der Mikroinjektionsschale an, wobei der Pflanzenpol in Richtung des Ansatzes der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist, der in einem Winkel von 45 Grad von der Rille steht.

Injizieren Sie nun die Embryonen. Perforieren Sie mit der Nadel das Chorion und das Eigelb und injizieren Sie dann die geladene Morpholino-Lösung in das Eigelb. Dies funktioniert bei Embryonen im Ein- oder Zweizellstadium.

Nachdem Sie alle Embryonen injiziert haben, verwenden Sie einen Pasteur mit breiter Bohrung, um sie zu sammeln. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in Petrischale, die mit Embryowasser gefüllt sind, und inkubieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius. Später am Nachmittag saugen Sie tote Embryonen ab und ersetzen Sie das Embryowasser.

Am nächsten Morgen, nachdem die Embryonen die Gastrulation durchlaufen haben, hemmen Sie ihre Melanisierung, indem Sie ihr Wasser durch Embryowasser ersetzen, das eine Spur von PTU enthält. Seien Sie vorsichtig, PTU stört die ordnungsgemäße Entwicklung vor der Gastrulation. Später, im gewünschten Entwicklungsstadium, dechorionieren Sie die Embryonen mit einer scharfen Pinzette.

Fassen Sie mit dem Mikroskop das Chorion mit einer Pinzette und versuchen Sie, die andere Seite des Chorions mit einer zweiten Pinzette zu greifen. Ziehe dann die Pinzette vorsichtig auseinander, ohne den Embryo zu stören. Dann betäuben Sie die Embryonen mit Tricain und fahren Sie mit der Einbettung der Embryonen und der Agarose auf einem 15-Mikron-Relokationsgitter fort, das in einer Mikroschale mit Deckglasboden platziert wird.

Laden Sie dann einen Milliliter aliquot geschmolzener Agarose in 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen. Legen Sie die Röhren in Heizblöcke, die auf 36 Grad Celsius eingestellt sind, und warten Sie, bis sie abgekühlt sind. Dann übertragen Sie einen Embryo mit einer Pipette mit breitem Durchgang in die Mikroschale.

Saugen Sie das überschüssige Embryowasser ab und beschichten Sie den Embryo mit Agarose. Während die Agarose noch flüssig ist, verwenden Sie zwei kleine Pipettenspitzen, um die Embryonen auszurichten. Positionieren Sie die interessierende Struktur, in diesem Fall den Pronephros, so nah wie möglich am Glasboden und in unmittelbarer Nähe des Gitters.

Das Raster sollte die interessierende Struktur nicht überlagern. Es ist von Vorteil, bis zu vier Embryonen in verschiedene Mikroschalen einzubetten und den besten abzubilden. Die richtige Einbettung braucht etwas Übung.

Solange die Agarose noch flüssig ist, muss der Embryo in eine gewünschte Position gebracht werden. Wenn es sich um einen Pronephros in der Nähe des Glasbodens und in angemessenem Abstand zum Verlagerungsgitter handelt. Überprüfen Sie die Agarose regelmäßig.

Sobald es schwer genug ist, die Embryonen zu halten, lassen Sie sie weitere zwei bis drei Minuten ruhen. Überlagern Sie dann den eingebetteten Embryo mit Embryowasser, das Spuren von PTU und Tricain enthält. Dekantieren oder saugen Sie das überschüssige Embryowasser ab und verriegeln Sie den Deckel, um eine Verdunstung zu verhindern.

Das Ergebnis sollte keine Luftblasen enthalten. Der Embryo kann nun mit dem Glasboden zur Objektivlinse hin abgebildet werden. Bei der Verwendung der Vorbereitung zur Erstellung von Zeitrafferbildern, z. B. durch die regelmäßige Aufnahme von Z-Stapelbildern über mehrere Stunden, ist es notwendig, die Fokusdrift zu korrigieren.

Wenn möglich, wenden Sie eine Autofokus-Strategie an. Schalten Sie die Autofokus-Option in der Softwaresteuerung um. Wählen Sie als Referenzkanal den Durchlicht-Hellfeldkanal, um die Phototoxizität zu minimieren.

Es ist auch wichtig, einen ausreichend großen, probenabhängigen Suchbereich zu wählen, damit der Autofokus ordnungsgemäß funktioniert. Positionieren Sie vor dem Sammeln von Bildern einen bestimmten Punkt des aufgedruckten Rasters in der Nähe der interessierenden Struktur im Fadenkreuz der Software und speichern Sie diese Position dann mit einem Screenshot. Beziehen Sie sich dann kurz vor Ablauf jedes Bildgebungszeitintervalls auf den Screenshot und passen Sie die Position des Tisches und den Fokus neu an, wenn der Autofokus nicht verwendet wird.

Die vorgestellte Methode wurde zur Analyse der Nierenentwicklung in WT1A-morphenen Embryonen einer transgenen Zebrafischlinie verwendet. Während der frühen Nephrogenität wählte diese Linie die grüne Fluoreszenz im intermediären Mesoderm, wo die Nierenvorläuferzellen entstehen, und später während der Entwicklung in den sich bildenden Tubuli und Nephronprimordien. Die Zeitrafferbildgebung zeigte eine normale Nephrogenese bei den Kontrollembryonen, die Morpholino injiziert wurde.

20 Stunden nach der Befruchtung waren die sich entwickelnden pronephrischen Tubuli sichtbar. An ihren vorderen Spitzen konnte eine kugelförmige Ansammlung von Zellen nachgewiesen werden, die die sich bildenden Nephronprimordien repräsentieren. In den nächsten Stunden wuchsen die Tubuli und die Nephron-Primordien, und die Primodien begannen an der Mittellinie zu verschmelzen.

Im Gegensatz dazu war die Nephrogenese bei den Mutanten stark gestört. Obwohl GFP-positive röhrenförmige Strukturen 20 Stunden nach der Befruchtung sichtbar waren, waren sie diffus und unterentwickelt. Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass sich nie Nephron-Primorgien bildeten, und eine auffällige Anzahl von fluoreszierenden Zellen, die sich außerhalb der sich entwickelnden Pronephrone befanden, wanderten ventral und verließen das Pronephrusfeld.

Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass das Fehlen zusätzlicher Geräte, wie z. B. Temperaturkontrolle oder Anti-Verdunstungstabellen, regelmäßige Überprüfungen auf Drifts und Nachjustierungen erfordert. Nach diesem Verfahren können Bildembryonen verarbeitet werden, um andere Methoden wie Immunhistochemie, Inzetrohypertisierung oder Echtzeit-PCR durchzuführen, um bestimmte Bestandteile von Zellen und Geweben zu identifizieren oder die Genexpression zu beurteilen.