Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zeitrafferauswertung unterschiedlicher Entwicklungsprozesse mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops zu ermöglichen, wobei einfache Strategien zur erneuten Ausrichtung nach Verschiebungen in beliebiger Richtung angewendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, da sie die direkte Beobachtung der Gewebe- und Organentwicklung in lebenden Embryonen über mehrere Stunden hinweg erlaubt. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie eine kostengünstige und einfach zu bedienende Alternative zu komplexeren Techniken darstellt, die üblicherweise für die zeitrafferaufgezeichnete Beobachtung sich entwickelnder Gewebe und Organe verwendet werden, wie beispielsweise die Laserscanning- oder Lichtmikroskopie.

Obwohl diese Methode Einblicke in räumliche und zeitliche Veränderungen während der Entwicklung von Sweeper-Fischembryonen und -larven ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung früher Entwicklungsprozesse und anderer Modellorganismen angewendet werden. Darüber hinaus eignet sie sich zur Beobachtung dynamischer Prozesse in adulten Organismen, wie beispielsweise der Wurzelheilung und Regeneration. Bereiten Sie die Arbeit vor, indem Sie hochreproduktive adulte Fische aus der transgenen GFP-exprimierenden Linie identifizieren.

Am Nachmittag vor der Pflanzen-Mikroinjektion fünf männlich-weibliche Paare von Fortpflanzungsfischen in fünf Brutbehältern bereitstellen. In den Behältern die männlichen und weiblichen Tiere über Nacht durch ein entfernbares Sieb voneinander trennen. Am folgenden Morgen kurz nach dem Einschalten des Lichts ein Männchen und ein Weibchen zusammen oberhalb des Siebs platzieren, wodurch verhindert wird, dass sie ihre Eier fressen.

Beobachten Sie nun die Fische während der Fortpflanzung. Sobald das Paar etwa 50 Eier produziert hat, trennen Sie die Fische. Anschließend überführen Sie die Eier mit einer Pasteur-Pipette in eine Petrischale, die mit Embryowasser gefüllt ist, für eine erste Injektionsrunde.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes begattete Paar. Falls zusätzliche Eier benötigt werden, können dieselben Paare mehrmals erneut zusammengebracht und getrennt werden. Für die Mikroinjektion erfolgt die vorbereitende Herstellung der Schalen und Injektionsnadeln auf übliche Weise.

Einzelheiten finden sich im Textprotokoll. Beginnen Sie damit, eine vorbereitete Injektionsnadel zu laden. Füllen Sie die Nadel mit einem Mikrolader-Spitzenstück rückwärts mit zwei Mikrolitern der MO-Arbeitslösung auf und befestigen Sie anschließend die Nadel in einem Mikromanipulator.

Dann kann die Nadelspitze geöffnet werden. Unter Sichtkontrolle mit dem Stereomikroskop die Öffnung mit einer Pinzette auseinanderziehen oder die Spitze gegen eine feste Oberfläche drücken. Anschließend kalibrieren Sie das Injektionsvolumen, indem Sie die MO-Lösung in einen Tropfen Mineralöl auf einer Skalenscheibe injizieren.

Passt die Injektion so an, dass 75-Mikrometer-Tropfen entstehen, was etwa 200 Piktoliter Lösung entspricht. Bereitet als Nächstes die zu injizierenden Embryonen vor. Ordnet die Embryonen im Stadium von etwa 21 Zellen entlang der Rille der Mikroinjektionsschale an, wobei der vegetative Pol in Richtung des Anflugs der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist, die in einem Winkel von 45 Grad zur Rille steht.

Injizieren Sie nun die Embryonen. Perforieren Sie mit der Nadel das Chorion und das Eiweiß, und injizieren Sie anschließend die beladene Morpholino-Lösung in das Eiweiß. Dies funktioniert bei Embryonen im Ein- oder Zweizellstadium.

Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sammeln Sie diese mit einer Pasteur-Pipette mit großer Öffnung ein. Überführen Sie die injizierten Embryonen in Petrischalen, die mit Embryowasser gefüllt sind, und inkubieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius. Später am Nachmittag saugen Sie die toten Embryonen ab und ersetzen das Embryowasser.

Am nächsten Morgen, nachdem die Embryonen die Gastrulation durchlaufen haben, hemmen Sie deren Melanisierung, indem Sie das Wasser durch Embryowasser mit einer Spur PTU ersetzen. Vorsicht: PTU stört die normale Entwicklung vor der Gastrulation. Später, im gewünschten Entwicklungsstadium, entfernen Sie die Chorionhülle der Embryonen mit einer scharfen Pinzette.

Unter dem Mikroskop die Chorion mit einem Paar Pinzetten greifen und versuchen, die andere Seite des Chorions mit einem zweiten Paar Pinzetten zu fassen. Dann die Pinzetten vorsichtig auseinanderziehen, ohne das Embryo zu beschädigen. Anschließend die Embryonen mit Tricaine betäuben und fortfahren mit dem Einbetten der Embryonen und Agarose auf einem 15-Mikrometer-Relokationsgitter, das in einer Mikroschale mit Deckglasboden platziert ist.

Dann pipettieren Sie Aliquote von je einem Milliliter geschmolzenem Agarose in 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäße. Stellen Sie die Gefäße in Heizblöcke, die auf 36 Grad Celsius eingestellt sind, und warten Sie, bis sie abgekühlt sind. Anschließend übertragen Sie mithilfe einer Pipette mit großer Öffnung ein Embryo in die Mikroschale.

Überschüssiges Embryowasser abpipettieren und den Embryo mit Agarose überdecken. Während die Agarose noch flüssig ist, zwei kleine Pipettenspitzen verwenden, um die Embryonen auszurichten. Die Struktur von Interesse – in diesem Fall der Pronephros – so nah wie möglich an den Glasboden und in unmittelbarer Nähe zum Raster bringen.

Das Raster sollte nicht über der Struktur von Interesse liegen. Es ist vorteilhaft, bis zu vier Embryonen in verschiedenen Mikroschalen einzubetten und den besten für die Bildaufnahme auszuwählen. Ein korrektes Einbetten erfordert etwas Übung.

Während das Agarose noch flüssig ist, muss das Embryo in eine gewünschte Position orientiert werden. Wenn es sich um ein Pronephros handelt, sollte dieses nahe dem Glasboden liegen und einen geeigneten Abstand zum Verschiebungsgitter aufweisen. Überprüfen Sie die Agarose regelmäßig.

Sobald es fest genug ist, um die Embryonen zu halten, lassen Sie es weitere zwei bis drei Minuten ruhen. Anschließend bedecken Sie den eingebetteten Embryo mit Embryowasser, das Spuren von PTU und Tricain enthält. Gießen Sie das überschüssige Embryowasser ab oder saugen Sie es ab und verschließen Sie den Deckel, um Verdunstung zu verhindern.

Das Ergebnis sollte keine Luftblasen enthalten. Der Embryo kann nun mit der Glasunterseite in Richtung Objektivlinse abgebildet werden. Bei der Verwendung der Präparation zur Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen, beispielsweise durch periodische Aufnahme von Z-Stapeln über mehrere Stunden hinweg, ist es notwendig, den Fokusdrift zu korrigieren.

Verwenden Sie nach Möglichkeit eine Autofokus-Strategie. Schalten Sie die Autofokus-Option in der Softwaresteuerung ein. Wählen Sie für den Referenzkanal den durchgehenden Licht-Hellfeldkanal, um die Phototoxizität zu minimieren.

Es ist außerdem entscheidend, einen ausreichend großen durchsuchbaren Bereich für das Objekt zur korrekten Funktion der Autofokusierung zu wählen. Bevor Sie Bilder aufnehmen, positionieren Sie einen bestimmten Punkt des aufgebrachten Rasters nahe der Struktur von Interesse in der Mitte der Software-Ziellinien und speichern Sie diese Position mithilfe eines Screenshot. Danach, kurz bevor jedes Bildaufnahmeintervall endet, rufen Sie den Screenshot erneut auf und justieren Sie gegebenenfalls die Position des Objekttisches und den Fokus neu, falls kein Autofokus verwendet wird.

Die vorgestellte Methode wurde zur Analyse der Nierenentwicklung in WT1A-Morpholino-injizierten Embryonen einer transgenen Zebrafischart verwendet. Während der frühen Nephrogenese zeigte diese Linie grüne Fluoreszenz im intermediären Mesoderm, wo die Nierenprogenitoren entstehen, und später in der Entwicklung in den sich bildenden Tubuli und Nephron-Anlagen. Die Zeitrafferaufnahme zeigte eine normale Nephrogenese in den Kontroll-Morpholino-injizierten Embryonen.

20 Stunden nach der Befruchtung waren die sich entwickelnden Pronephroskanälchen sichtbar. An ihren vorderen Enden konnte eine kugelförmige Ansammlung von Zellen, die das entstehende Nephronanlage darstellt, nachgewiesen werden. In den folgenden Stunden wuchsen die Kanälchen und Nephronanlagen, und die Anlagen begannen, sich in der Mittellinie zu vereinigen.

Im Gegensatz dazu war die Nephrogenese bei den Mutanten stark gestört. Obwohl GFP-positive tubuläre Strukturen 20 Stunden nach der Befruchtung sichtbar waren, waren sie diffus und unterentwickelt. Die Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass sich Nephron-Anlagen niemals bildeten und eine auffällig große Anzahl fluoreszierender Zellen, die außerhalb der sich entwickelnden Pronephridien lagen, ventral wanderte und somit das Pronephridienfeld verließ.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig zu beachten, dass bei fehlender Zusatzausrüstung, wie Temperaturregelung oder Anti-Verdunstungstischen, regelmäßige Überprüfungen auf Drifts und Nachjustierungen erforderlich sind. Nach diesem Verfahren können die abgebildeten Embryonen weiterverarbeitet werden, um andere Methoden anzuwenden, wie beispielsweise Immunhistochemie, Inzertohybridisierung oder Echtzeit-PCR, um spezifische Bestandteile von Zellen oder Geweben zu identifizieren oder die Genexpression zu untersuchen.